CN107652370A - 叶用莴苣多糖及其在制备口腔疾病药物或保健品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及叶用莴苣多糖及其在制备口腔疾病药物或保健品中的应用。所述的叶用莴苣多糖是通过微波提取的方法，利用0.5‑1%醋酸水溶液作为提取溶剂，在功率300‑400W下快速提取，单次提取时间20‑30s，提取次数2‑3次，间隔5‑10min，再利用含15‑20%硫酸钠的体积分数30‑60%的乙醇溶液沉淀回收获得。抑菌实验表明，本发明的叶用莴苣多糖对于口腔病菌变异链球菌、远缘链球菌和乳酸杆菌均具有显著的抑制作用，因此可用于制备防治口腔疾病的药物或保健品，用于防治龋齿、口腔异味、牙痛、牙龈出血等常见口腔疾病，且其制备方法简便快速，适于大规模生产。

Description

叶用莴苣多糖及其在制备口腔疾病药物或保健品中的应用

技术领域

本发明涉及植物天然多糖的提取，具体地说，涉及叶用莴苣多糖及其在制备口腔疾病药物或保健品中的应用。

背景技术

叶用莴苣(var.ramosaHort.)，俗称生菜，属菊科莴苣属，为一年生或二年生草本，是日常餐桌常见绿叶菜之一。具有清热安神、清肝利胆和养胃的功效，所含的莴苣素能够阵痛催眠、降低胆固醇和辅助治疗神经衰弱，甘露醇等成分能够利尿和促进血液循环。

微波辅助提取(Microwave-assistedExtraction，MAE)是指使用适当的溶剂在微波反应器中从植物、矿物、动物组织等中提取各种化学成分的技术和方法。微波辅助提取具有以下优势：(1)加热迅速：微波萃取是一种“体加热”过程，即内外同时加热，因而加热均匀，热效率较高，加热速度快，物料的受热时间短。(2)选择性加热：微波可对萃取物质中的不同组分进行选择性加热，因而可使目标组分与基体直接分离开来，从而可提高萃取效率和产品纯度。(3)高效节能：常规加热设备的能耗主要有物料升温的热损失、设备预热及向外界散热的损失，后两项的热损失占总能耗的比例很大，使常规加热能量利用率较低，微波加热时，主要是物料吸收微波能，金属材料只能反射而不能吸收微波，因此，微波加热设备的热损失仅占总能耗的极少部分。(4)环保：微波提取显著减少了溶剂的使用量，微波萃取过程中，无有害气体排放，不产生余热和粉尘污染。

口腔疾病是一类发病率很高的疾病总称，常见的有龋齿、口腔异味、牙痛、牙龈出血等。龋病俗称蛀牙，是细菌性疾病，可以继发牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症，致龋菌的感染和在口腔内的大量繁殖是导致龋病的重要原因。口腔异味是由于口腔封闭，空气不流通，产生大量分泌物，引起细菌大量滋生。牙痛大多由牙龈炎和牙周炎、龋齿或折裂牙而导致牙髓感染所引起，具体是由于不注意口腔卫生，牙齿受到牙齿周围食物残渣、细菌等结成的软质牙垢和硬质牙石所致的长期刺激，不正确的刷牙习惯或维生素缺乏等原因所造成。牙龈出血常见于牙周病的早期，引起牙龈出血的原因很多，除了单纯口腔局部问题，还可能是其它全身疾病的口腔病变表现，多数是因为牙面上的菌斑(细菌)软垢没有及时清除，唾液中的钙离子将牙菌斑钙化慢慢地形成牙石，相应部位的牙龈长期受到牙石的刺激，毛细血管扩张，通透性增强，血流量增加，致使牙龈变为鲜红或暗红色、牙龈乳头肿胀、边缘变厚，牙龈不再紧贴牙面，造成牙龈松软脆弱、牙龈沟加深，当刷牙或进食时，由于机械性刺激，这种炎症状态下的牙龈就很容易出血。

目前有文献报道使用微波提取的方法从生地、黄芪等植物中成功提取多糖，也有文献报道从甘草中提取的多糖具有抗龋齿的活性。但还未见利用微波提取方法从叶用莴苣中快速、高效提取叶用莴苣多糖，并用于防治口腔疾病的报道。

发明内容

本发明从叶用莴苣中提取得到叶用莴苣多糖，并验证了该叶用莴苣多糖对口腔常见致病菌的抑制作用。基于此完成了本发明。

本发明提供了一种叶用莴苣多糖，其提取方法为：

1)将叶用莴苣的叶片充分干燥粉碎，过60-80目筛；

2)向叶用莴苣粉末加入30-60％乙醇回流提取1-2h，然后除去乙醇，于40-50℃恒温干燥箱中烘干；

3)将烘干后的叶用莴苣粉末加入到0.5-1％的醋酸水溶液中进行微波提取，功率300-400W，单次提取时间20-30s，提取次数2-3次，间隔5-10min；

4)合并提取液，在40-50℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/4-1/2，静置过滤，向滤液中加入含15-20％硫酸钠的体积分数30-60％的乙醇溶液，于40-50℃下振荡1-2h，静置，收集硫酸钠相；

5)向收集的硫酸钠相中加入2-4倍体积的无水乙醇溶液沉淀多糖，于40-50℃下振荡1-2h，静置12-24h，5000-8000r/min离心5-10min，收集沉淀；

6)再加入无水乙醇洗涤沉淀2次，于40-50℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

步骤2)中叶用莴苣粉末和30-60％乙醇的料液比为1:5-8。

步骤3)中烘干后的叶用莴苣粉末和0.5-1％的醋酸水溶液的料液比为1:5-8。

本发明还提供了所述叶用莴苣多糖的提取方法，包括以下步骤：

1)将叶用莴苣的叶片充分干燥粉碎，过60-80目筛；

2)向叶用莴苣粉末加入30-60％乙醇回流提取1-2h，然后除去乙醇，于40-50℃恒温干燥箱中烘干；

3)将烘干后的叶用莴苣粉末加入到0.5-1％的醋酸水溶液中进行微波提取，功率300-400W，单次提取时间20-30s，提取次数2-3次，间隔5-10min；

4)合并提取液，在40-50℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/4-1/2，静置过滤，向滤液中加入含15-20％硫酸钠的体积分数30-60％的乙醇溶液，于40-50℃下振荡1-2h，静置，收集硫酸钠相；

5)向收集的硫酸钠相中加入2-4倍体积的无水乙醇溶液沉淀多糖，于40-50℃下振荡1-2h，静置12-24h，5000-8000r/min离心5-10min，收集沉淀；

6)再加入无水乙醇洗涤沉淀2次，于40-50℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

步骤2)中叶用莴苣粉末和30-60％乙醇的料液比为1:5-8。

步骤3)中烘干后的叶用莴苣粉末和0.5-1％的醋酸水溶液的料液比为1:5-8。

本发明又提供了所述叶用莴苣多糖的用途。

所述的叶用莴苣多糖在制备口腔疾病药物或保健品中的应用。

所述的叶用莴苣多糖在制备抑制口腔致病菌药物中的应用。

所述的口腔致病菌是变异链球菌、远缘链球菌或乳酸杆菌。

本发明的有益效果在于：

1、从叶用莴苣中利用微波提取的方法快速提取获得叶用莴苣多糖，采用添加了0.5-1％醋酸的水溶液作为提取溶剂，合理控制提取参数，多糖提取率高。

2、本发明微波提取的方法简便快速，适于大规模生产。

3、抑菌实验表明，本发明的叶用莴苣多糖对于口腔疾病的常见致病菌变异链球菌、远缘链球菌和乳酸杆菌均具有显著的抑制作用，因此可用于制备防治口腔疾病的药物或保健品，用于防治龋齿、口腔异味、牙痛、牙龈出血等常见口腔疾病。

具体实施方式

以下实施例所用叶用莴苣品种前卫75，购于菜市。

主要设备：DU-640紫外/可见分光光度计：美国贝克曼公司；AUW320分析天平：日本岛津；MA-2270EGC海尔微波炉：青岛海尔微波制品有限公司；FW100型高速粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；RE52CS旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DZF真空干燥箱：上海海向仪器设备厂；800型台式离心机：上海手术仪器厂。

实验菌株：变异链球菌CGMCC12500，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心；远缘链球菌ATCC27351，购于北京北纳创联生物技术研究院；乳酸杆菌ATCC4546购自北京豫鼎鑫捷科技有限公司。

培养基：TPY培养基、BHI培养基、LBS培养基，购于青岛海博生物技术有限公司。

制备实施例1

1)取新鲜叶用莴苣的叶片，于45℃恒温干燥箱内充分干燥，粉碎机粉碎，过80目筛；

2)向叶用莴苣粉末加入50％乙醇回流提取1.5h，料液比1:6，然后除去乙醇，于45℃恒温干燥箱中烘干；

3)将烘干后的叶用莴苣粉末加入到0.8％的醋酸水溶液中进行微波提取，料液比1:6，功率350W，单次提取时间25s，提取次数2次，间隔10min；

4)合并提取液，在45℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/2，静置过滤，向滤液中加入含15％硫酸钠的体积分数50％的乙醇溶液，于45℃下振荡1.5h，静置，收集硫酸钠相；

5)向收集的硫酸钠相中加入3倍体积的无水乙醇溶液沉淀多糖，于45℃下振荡1.5h，静置18h，6000r/min离心8min，收集沉淀；

6)再加入无水乙醇洗涤沉淀2次，于45℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

制备实施例2

1)取新鲜叶用莴苣的叶片，于40℃恒温干燥箱内充分干燥，粉碎机粉碎，过60目筛；

2)向叶用莴苣粉末加入30％乙醇回流提取2h，料液比1:5，然后除去乙醇，于40℃恒温干燥箱中烘干；

3)将烘干后的叶用莴苣粉末加入到0.5％的醋酸水溶液中进行微波提取，料液比1:5，功率400W，单次提取时间20s，提取次数3次，间隔5min；

4)合并提取液，在40℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/4，静置过滤，向滤液中加入含15％硫酸钠的体积分数30％的乙醇溶液，于40℃下振荡2h，静置，收集硫酸钠相；

5)向收集的硫酸钠相中加入4倍体积的无水乙醇溶液沉淀多糖，于40℃下振荡2h，静置24h，8000r/min离心5min，收集沉淀；

6)再加入无水乙醇洗涤沉淀2次，于40℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

制备实施例3

1)取新鲜叶用莴苣的叶片，于50℃恒温干燥箱内充分干燥，粉碎机粉碎，过60目筛；

2)向叶用莴苣粉末加入60％乙醇回流提取1h，料液比1:8，然后除去乙醇，于50℃恒温干燥箱中烘干；

3)将烘干后的叶用莴苣粉末加入到1％的醋酸水溶液中进行微波提取，料液比1:8，功率300W，单次提取时间30s，提取次数2次，间隔10min；

4)合并提取液，在50℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/4，静置过滤，向滤液中加入含20％硫酸钠的体积分数60％的乙醇溶液，于50℃下振荡1h，静置，收集硫酸钠相；

5)向收集的硫酸钠相中加入2倍体积的无水乙醇溶液沉淀多糖，于50℃下振荡1h，静置12h，5000r/min离心10min，收集沉淀；

6)再加入无水乙醇洗涤沉淀2次，于50℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

制备实施例4

1)取新鲜叶用莴苣的叶片，于40℃恒温干燥箱内充分干燥，粉碎机粉碎，过60目筛；

2)向叶用莴苣粉末加入60％乙醇回流提取1h，料液比1:8，然后除去乙醇，于50℃恒温干燥箱中烘干；

3)将烘干后的叶用莴苣粉末加入到1％的醋酸水溶液中进行微波提取，料液比1:8，功率300W，单次提取时间30s，提取次数2次，间隔10min；

4)合并提取液，在50℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/4，静置过滤，向滤液中加入含20％硫酸钠的体积分数60％的乙醇溶液，于50℃下振荡1h，静置，收集硫酸钠相；

5)向收集的硫酸钠相中加入2倍体积的无水乙醇溶液沉淀多糖，于50℃下振荡1h，静置12h，5000r/min离心10min，收集沉淀；

6)再加入无水乙醇洗涤沉淀2次，于50℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

制备实施例5

1)取新鲜叶用莴苣的叶片，于40℃恒温干燥箱内充分干燥，粉碎机粉碎，过60目筛；

2)向叶用莴苣粉末加入30％乙醇回流提取2h，料液比1:5，然后除去乙醇，于40℃恒温干燥箱中烘干；

3)将烘干后的叶用莴苣粉末加入到0.5％的醋酸水溶液中进行微波提取，料液比1:5，功率400W，单次提取时间20s，提取次数3次，间隔5min；

4)合并提取液，在50℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/4，静置过滤，向滤液中加入含20％硫酸钠的体积分数60％的乙醇溶液，于50℃下振荡1h，静置，收集硫酸钠相；

5)向收集的硫酸钠相中加入2倍体积的无水乙醇溶液沉淀多糖，于50℃下振荡1h，静置12h，5000r/min离心10min，收集沉淀；

6)再加入无水乙醇洗涤沉淀2次，于50℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

对比例1

1)取新鲜叶用莴苣的叶片，于50℃恒温干燥箱内充分干燥，粉碎机粉碎，过60目筛；

2)向叶用莴苣粉末加入60％乙醇回流提取1h，料液比1:8，然后除去乙醇，于50℃恒温干燥箱中烘干；

3)将烘干后的叶用莴苣粉末加入到1.5％的醋酸水溶液中进行微波提取，料液比1:8，功率300W，单次提取时间30s，提取次数2次，间隔10min；

4)合并提取液，在50℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/4，静置过滤，向滤液中加入含20％硫酸钠的体积分数60％的乙醇溶液，于50℃下振荡1h，静置，收集硫酸钠相；

5)向收集的硫酸钠相中加入2倍体积的无水乙醇溶液沉淀多糖，于50℃下振荡1h，静置12h，5000r/min离心10min，收集沉淀；

6)再加入无水乙醇洗涤沉淀2次，于50℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

对比例2

1)取新鲜叶用莴苣的叶片，于50℃恒温干燥箱内充分干燥，粉碎机粉碎，过60目筛；

2)向叶用莴苣粉末加入60％乙醇回流提取1h，料液比1:8，然后除去乙醇，于50℃恒温干燥箱中烘干；

3)将烘干后的叶用莴苣粉末加入到1％的醋酸水溶液中进行微波提取，料液比1:8，功率250W，单次提取时间2min，提取次数4次，间隔10min；

4)合并提取液，在50℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/4，静置过滤，向滤液中加入含20％硫酸钠的体积分数60％的乙醇溶液，于50℃下振荡1h，静置，收集硫酸钠相；

5)向收集的硫酸钠相中加入2倍体积的无水乙醇溶液沉淀多糖，于50℃下振荡1h，静置12h，5000r/min离心10min，收集沉淀；

6)再加入无水乙醇洗涤沉淀2次，于50℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

对比例3

1)取新鲜叶用莴苣的叶片，于45℃恒温干燥箱内充分干燥，粉碎机粉碎，过80目筛；

2)向叶用莴苣粉末加入50％乙醇回流提取1.5h，料液比1:6，然后除去乙醇，于45℃恒温干燥箱中烘干；

3)将烘干后的叶用莴苣粉末加入到0.8％的醋酸水溶液中进行微波提取，料液比1:6，功率350W，单次提取时间25s，提取次数2次，间隔10min；

4)合并提取液，在45℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/2，静置过滤，向滤液中加入含15％硫酸铵的体积分数50％的乙醇溶液，于45℃下振荡1.5h，静置，收集硫酸铵相；

5)向收集的硫酸铵相中加入3倍体积的无水乙醇溶液沉淀多糖，于45℃下振荡1.5h，静置18h，6000r/min离心8min，收集沉淀；

6)再加入无水乙醇洗涤沉淀2次，于45℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

试验例1

1、实验方法

采用苯酚-硫酸比色法测定以上各实施例和对比例的多糖含量。以葡萄糖为标准品，准确称取标准葡萄糖20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6ml溶液至刻度试管中，再各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6％苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却，室温放置20分钟后于490nm测定吸光度值，横坐标为葡萄糖浓度μg/ml，纵坐标为吸光度值，绘制标准曲线，得到线性回归方程。同样条件下取粗多糖2mg，定容至50ml容量瓶中，吸取1.0ml待测液至刻度试管中用蒸馏水补齐至2.0ml，然后加入6％苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却，室温放置20分钟后于490nm测定吸光度值。计算各实施例和对比例的多糖提取率，公式：多糖提取率＝(多糖质量/原料质量)*100％。

2、实验结果

实施例1-5和对比例1-3的多糖提取率见表1。将不同组别的多糖提取率进行比较，可见实施例1-5的多糖提取率均显著高于对比例1-3(p<0.05)。

表1多糖提取率

组别	多糖提取率(％)
		实施例1	4.524
实施例2	4.278
		实施例3	4.337
实施例4	4.285
		实施例5	4.194
对比例1	2.740
		对比例2	3.017
对比例3	3.249

试验例2

1、实验方法

分别取实施例1-3和对比例1-3的叶用莴苣多糖提取物，用去离子水配制成8mg/ml、4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml的药物稀释液，巴氏消毒法灭菌。取配制好的溶液各20μl，滴加于干燥的无菌圆形滤纸片(d＝5mm)上，以滴加20μl无菌蒸馏水的滤纸片作为阴性对照，将滤纸片晾干备用。分别将变异链球菌、远缘链球菌、乳酸杆菌配制成浓度为1×10⁶cfu/mL的试验菌液。用无菌棉拭子蘸取菌液，均匀涂抹变异链球菌于TPY培养基、远缘链球菌于BHI培养基、乳酸杆菌于LBS培养基表面，室温下干燥5min。在涂菌平板中央贴放制备好的滤纸片及阴性对照，置于厌氧培养箱中37℃培养，乳酸杆菌24h后观察结果，远缘链球菌和变异链球菌48h后观察结果，测量抑菌环直径，阴性对照组应无抑菌环产生，否则试验无效。抑菌环直径大于7mm者，为有抑菌作用，小于或等于7mm者，为无抑菌作用。试验重复三次，取平均值。

2、实验结果

各实施例和对比例制备的叶用莴苣多糖处理的变异链球菌、远缘链球菌、乳酸杆菌的抑菌环大小统计结果见表2-4。可以看出，实施例1-3制备的叶用莴苣多糖在各浓度下对变异链球菌、远缘链球菌、乳酸杆菌均具有抑制作用，而对比例1-3提取的叶用莴苣多糖在0.25mg/ml时对变异链球菌、远缘链球菌、乳酸杆菌均未表现出抑制作用；比较抑菌环直径，当提取物浓度为8mg/ml和4mg/ml时，实施例1-3的叶用莴苣多糖对各口腔疾病致病菌的抑菌环均显著大于对比例1-3的叶用莴苣多糖对各口腔疾病致病菌的抑菌环(p<0.05)。表明本发明成功提取得到能够显著抑制口腔疾病常见致病菌，进一步有效防治口腔疾病的叶用莴苣多糖。

表2各叶用莴苣多糖对变异链球菌的抑菌环大小

表3各叶用莴苣多糖对远缘链球菌的抑菌环大小

表4各叶用莴苣多糖对乳酸杆菌的抑菌环大小

Claims (9)

1.一种叶用莴苣多糖，其特征在于，其提取方法为：

1）将叶用莴苣的叶片充分干燥粉碎，过60-80目筛；

2）向叶用莴苣粉末加入30-60%乙醇回流提取1-2h，然后除去乙醇，于40-50℃恒温干燥箱中烘干；

3）将烘干后的叶用莴苣粉末加入到0.5-1%的醋酸水溶液中进行微波提取，功率300-400W，单次提取时间20-30s，提取次数2-3次，间隔5-10min；

4）合并提取液，在40-50℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/4-1/2，静置过滤，向滤液中加入含15-20%硫酸钠的体积分数30-60%的乙醇溶液，于40-50℃下振荡1-2h，静置，收集硫酸钠相；

5）向收集的硫酸钠相中加入2-4倍体积的无水乙醇溶液沉淀多糖，于40-50℃下振荡1-2h，静置12-24h，5000-8000r/min离心5-10min，收集沉淀；

6）再加入无水乙醇洗涤沉淀2次，于40-50℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

2.根据权利要求1所述的叶用莴苣多糖，其特征在于，步骤2）中叶用莴苣粉末和30-60%乙醇的料液比为1:5-8。

3.根据权利要求1所述的叶用莴苣多糖，其特征在于，步骤3）中烘干后的叶用莴苣粉末和0.5-1%的醋酸水溶液的料液比为1:5-8。

4.权利要求1所述的叶用莴苣多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将叶用莴苣的叶片充分干燥粉碎，过60-80目筛；

2）向叶用莴苣粉末加入30-60%乙醇回流提取1-2h，然后除去乙醇，于40-50℃恒温干燥箱中烘干；

3）将烘干后的叶用莴苣粉末加入到0.5-1%的醋酸水溶液中进行微波提取，功率300-400W，单次提取时间20-30s，提取次数2-3次，间隔5-10min；

4）合并提取液，在40-50℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/4-1/2，静置过滤，向滤液中加入含15-20%硫酸钠的体积分数30-60%的乙醇溶液，于40-50℃下振荡1-2h，静置，收集硫酸钠相；

5）向收集的硫酸钠相中加入2-4倍体积的无水乙醇溶液沉淀多糖，于40-50℃下振荡1-2h，静置12-24h， 5000-8000r/min离心5-10min，收集沉淀；

6）再加入无水乙醇洗涤沉淀2次，于40-50℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，步骤2）中叶用莴苣粉末和30-60%乙醇的料液比为1:5-8。

6.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，步骤3）中烘干后的叶用莴苣粉末和0.5-1%的醋酸水溶液的料液比为1:5-8。

7.权利要求1-3任一所述的叶用莴苣多糖在制备口腔疾病药物或保健品中的应用。

8.权利要求1-3任一所述的叶用莴苣多糖在制备抑制口腔致病菌药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的口腔致病菌是变异链球菌、远缘链球菌或乳酸杆菌。