CN107649225A - 掩膜版、模具与微流控芯片及制作方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种掩膜版、模具与微流控芯片及制作方法与用途，涉及细胞培养装置的制作领域，该用于制作微流控芯片的掩膜版，包括第一掩膜版和第二掩膜版；第一掩膜版包括主要由第一矩形以阵列方式排布的第一光刻图案，第二掩膜版包括主要由第二矩形平行且间隔设置组成的第二光刻图案，缓解了现有技术中的微流控芯片制作成本高、工艺难度大且不便于观察记录的技术问题，达到了降低制作工艺难度和生产成本的技术效果。

Description

掩膜版、模具与微流控芯片及制作方法与用途
技术领域
本发明涉及细胞培养装置的制作领域，尤其是涉及一种掩膜版、模具与微流控芯片及制作方法与用途。
背景技术
母细胞培养装置(mother machine)是一种可以进行连续培养细胞的微流控芯片。20世纪50年代初，哥本哈根细菌生长生理学院表明细胞生长环境的平衡对细胞进行严格定量研究的重要性。近年来，来自定量科学的研究人员对于生长方面的科学问题关注日益增加，而mother machine能够保持细胞稳定生长的培养条件，更加严格地定量细胞的增长。
现有mother machine装置主要是通道以及设置于通道两侧的几千个培养室组成的，通道两端分别为进样口和出样口，根据所要观察的细胞大小和其他实验需求，培养室的数量可增加或减少，每个培养室大小设计成仅能有一个细胞进入，通过离心或者液压差等方式，使细胞进入培养室并束缚于该培养室内，只有当细胞在培养室内增值到通道附近才被连续的液流冲走，这样可保持培养室内能连续观察最初的母细胞，通过显微镜记录，可以定量每个细胞的生长速率以及细胞形态。
由于现有的几种mother machine的每个培养室仅容纳单个细胞进入，因此对于一些比较小的细菌，每个培养室的宽度甚至需要小至1μm，这对微流控芯片的制作精度要求非常高，在制作中需要用到价格昂贵的铬板制作掩膜，并且在不同厚度层的掩膜对齐上需要更精准，操作难度更高。除此之外，单个培养室的阵列在显微镜高倍镜下能显示的数量有限，因此在需要记录大量数据的情况下，需要频繁移动显微镜镜头，从而增加了数据记录和分析的难度。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于制作微流控芯片的掩膜版，以缓解现有技术的微流控芯片制作成本高、工艺难度大且不便于观察记录的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种用于制作微流控芯片的模具的制作方法，该制作方法具有工艺流出简单，便于实现的优点。
本发明的第三目的在于提供一种微流控芯片的制作方法，该制作方法具有工艺流出简单、加工成本低的优点。
本发明的第四目的在于提供一种微流控芯片，该微流控芯片可以实现同时观察细胞的几种分裂状态。
本发明的第五目的在于提供一种上述微流控芯片在细胞培养中的用途。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种用于制作微流控芯片的掩膜版，包括第一掩膜版和第二掩膜版；所述第一掩膜版包括主要由第一矩形以阵列方式排布的第一光刻图案，所述第二掩膜版包括主要由第二矩形以平行且间隔方式排布的第二光刻图案。
进一步的，所述第一矩形的长度小于等于所述第二矩形之间的间距；可选地，所述第一矩形的长度小于等于所述第二矩形之间的间距且所述第一矩形的长度大于等于所述第二矩形之间的间距的一半。
进一步的，所述第一矩形以错位的阵列方式排布。
进一步的，所述第二光刻图案还包括样品注入通道图形和样品流出通道图形。
一种用于制作微流控芯片的模具的制作方法，在模具基体表面涂覆光刻胶，利用上述用于制作微流控芯片的掩膜版进行曝光、显影后得到。
进一步的，上述制作方法包括以下步骤：在模具基体表面涂覆第一层光刻胶，利用第一掩膜版进行曝光，显影后再涂覆第二层光刻胶，之后利用第二掩膜版进行曝光，显影后得到所述模具。
一种微流控芯片的制作方法，包括以下步骤：将微流控芯片的制备原料浇灌于根据上述制作方法得到的模具中，经固化成型后分离得到下基体，之后下基体与上盖板连接得到微流控芯片。
进一步的，所述液体原料包括固化剂与PDMS组成的聚合物；可选地，所述固化剂与所述PDMS的重量比为1：(8-12)。
进一步的，浇灌后先进行脱气处理再固化成型；优选地，固化成型过程中的温度80-100℃，时间1.5-2.5h。
一种微流控芯片，根据微流控芯片的制作方法得到。
一种上述微流控芯片在细胞培养中的用途。
与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的掩膜版中，第一掩膜版的第一光刻图案主要由第一矩形以阵列方式排布组成，第二掩膜版的第二光刻图案主要由第二矩形平行且间隔设置组成。在光刻工艺过程中，只需要利用第一掩膜版与第二掩膜版进行交叉组合光刻，之后通过显影即可得到用于制备微流控芯片的模具。该模具的型腔由光刻胶组成，制备过程中在模具基体上涂覆光刻胶后分别用第一掩膜版和第二掩膜版曝光后再进行光刻、显影可以得到由光刻胶组成的图形，该图形和第一掩膜版与第二掩膜版交叉组合后的图形相对应。
在制作微流控芯片时只要控制第一层光刻胶的厚度在一个细胞的尺寸左右，即可使细胞进入培养室后以单层状态存在并且被束缚在培养室内而不会随意流出培养室。同时，由于本发明中的培养室的结构尺寸由第一掩膜版和第二掩膜版的交叉情况控制决定，因此，培养室的大小可以不受限制，可以在同一个培养室内容纳多个细胞，实现多细胞生长状态的时时观察，进行高通量数据收集极以及单细胞水平长时观察等实验操作。
由于该掩膜版在使用过程中可以用肉眼直接对齐，不再依靠于大型精密设备，对齐方式更方便，大大减小了操作难度，可以实现制作方便，成本低，高通量的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中第一掩膜版的结构示意图；
图2为本发明实施例1中第二掩膜版的结构示意图；
图3为本发明实施例2中第一掩膜版的结构示意图；
图4为本发明实施例3提供的微流控芯片的结构示意图；
图5为本发明实施例3中提供的微流控芯片的一个细胞观察单元的结构示意图。
图标：10-第一掩膜版；11-第一矩形；12-第一光刻图案；20-第二掩膜版；21-第二矩形；22-第二光刻图案；30-下基体；31-培养室；40-上盖板。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
一种用于制作微流控芯片的掩膜版，包括第一掩膜版和第二掩膜版；所述第一掩膜版包括主要由第一矩形以阵列方式排布的第一光刻图案，所述第二掩膜版包括主要由第二矩形以平行且间隔方式排布的第二光刻图案。
本发明提供的掩膜版中，第一掩膜版的第一光刻图案主要由第一矩形以阵列方式排布组成，第二掩膜版的第二光刻图案主要由第二矩形平行且间隔设置组成。在光刻工艺过程中，只需要利用第一掩膜版与第二掩膜版进行交叉组合光刻，之后通过显影即可得到用于制备微流控芯片的模具。该模具的型腔由光刻胶组成，制备过程中在模具基体上涂覆光刻胶后分别用第一掩膜版和第二掩膜版曝光后再进行光刻、显影可以得到由光刻胶组成的图形，该图形和第一掩膜版与第二掩膜版交叉组合后的图形相对应。
具体的，该模具的型腔由光刻胶组成，制备过程中首先在模具基体表面涂覆第一层光刻胶，之后用第一掩膜版进行光刻，显影后可以得到与第一光刻图案相同的由光刻胶组成的图形；然后再涂覆第二层光刻胶并用第二掩膜版进行光刻，显影后在第一层光刻胶之上得到与第二光刻图案相同的由光刻胶组成的图形，两层光刻胶的叠加即构成模具的型腔结构。其中，第一矩形所对应形成的光刻胶被第二矩形所对应形成的光刻胶覆盖后剩余的光刻胶区域即为微流控芯片的培养室结构，而第二矩形所对应形成的光刻胶构成微流控芯片的通道。第一层光刻胶的厚度决定培养室的高度，第二层光刻胶的厚度决定微流控芯片的通道的高度。
在制作微流控芯片时只要控制第一层光刻胶的厚度在一个细胞的尺寸左右，即可使细胞进入培养室后以单层状态存在并且被束缚在培养室内而不会随意流出培养室。同时，由于本发明中的培养室的结构尺寸由第一掩膜版和第二掩膜版的交叉情况控制决定，因此，培养室的大小可以不受限制，可以在同一个培养室内容纳多个细胞，实现多细胞生长状态的时时观察，进行高通量数据收集极以及单细胞水平长时观察等实验操作。
由于该掩膜版在使用过程中可以用肉眼直接对齐，不再依靠于大型精密设备，对齐方式更方便，大大减小了操作难度，可以实现制作方便，成本低，高通量的优点。
值得说明的是，在上述效果分析中，本发明中是利用第一矩形与第二矩形之间的间隔部位交叉来说明，但是这仅仅是为了详细说明本发明的具体使用所做的说明，并不代表第一矩形只能以上述交叉方式制备得到，也可以采用其他方式。例如，可以让第一矩形与第二矩形相交叉，但是此时第二矩形所隐含的意义为实际制备得到的通道之间的间隔所对应的图形。
第一矩形的长度尺寸范围优选为35-50微米，相应的，第二矩形之间的间距也优选为35-50微米。第一矩形和第二矩形的间距交叉重合的部位可形成培养室的区域，该区域的大小决定于第一矩形与第二矩形的间距的交叉尺寸。
在上述优选的实施方式中，第一矩形典型但非限制性的长度例如为：35微米、37微米、40微米、42微米、45微米、48微米或50微米；第二矩形之间的间距典型但非限制性的例如为：35微米、37微米、40微米、42微米、45微米、48微米或50微米。
作为本发明优选的实施方式，第一矩形和第二矩形交叉重合时优选采用垂直方式组合使用，这样制备得到的培养室的结构更有规则。
作为本发明优选的实施方式，所述第一矩形的长度小于等于所述第二矩形之间的间距，这样可有效保证培养室不会贯通微流控芯片通道之间的间隔区域成为通室，使培养室只有一端开口与通道连通，培养室的另一端为封闭结构。
作为本发明优选的实施方式，所述第一矩形的长度小于等于所述第二矩形之间的间距且所述第一矩形的长度大于等于所述第二矩形之间的间距的一半，这样可以进一步增加培养室的数量，使培养室同时分布于通道间隔区域的两侧。
作为本发明优选的实施方式，所述第一矩形以错位的阵列方式排布。第一矩形以错位的阵列方式排布，可以在不限制第一矩形的尺寸的情况下提高培养室的数量。
作为本发明优选的实施方式，所述第二光刻图案还包括样品注入通道图形和样品流出通道图形，利用该通道光刻图案可以得到用于样品注入的通道和样品流出的通道。
本发明的第二个方面提供了一种用于制作微流控芯片的模具的制作方法，在模具基体表面涂覆光刻胶，利用上述用于制作微流控芯片的掩膜版进行曝光、显影后得到。利用该方法制作模具时可以用肉眼进行对位即可，具有工艺流出简单，便于实现的优点。
作为本发明优选的实施方式，上述制作方法包括以下步骤：在模具基体表面涂覆第一层光刻胶，利用第一掩膜版进行曝光，显影后再涂覆第二层光刻胶，之后利用第二掩膜版进行曝光，显影后得到所述模具。利用该方法制备模具时首先在模具基体表面涂覆第一层光刻胶，之后用第一掩膜版进行光刻，显影后可以得到与第一光刻图案相同的由光刻胶组成的图形；然后再涂覆第二层光刻胶并用第二掩膜版进行光刻，显影后在第一层光刻胶之上得到与第二光刻图案相同的由光刻胶组成的图形，两层光刻胶的叠加即构成模具的型腔结构。其中，第一矩形所对应形成的光刻胶被第二矩形所对应形成的光刻胶覆盖后剩余的光刻胶区域即为微流控芯片的培养室结构，而第二矩形所对应形成的光刻胶构成微流控芯片的通道。第一层光刻胶的厚度决定培养室的高度，第二层光刻胶的厚度决定微流控芯片的通道的高度。
本发明的第三个方面提供了一种微流控芯片的制作方法，包括以下步骤：将微流控芯片的制备原料浇灌于根据上述制作方法得到的模具中，经固化成型后分离得到下基体，之后下基体与上盖板连接得到微流控芯片。微流控芯片主要由下基体和上盖板组成，本发明中的下基体采用浇铸法制备得到后再与上盖板进行连接，优选采用键合连接，得到微流控芯片。上盖板优选采用载玻片，以保证上盖板的平整度。
本发明提供的微流控芯片与现有的单通道的mother machine制作工艺相比，上下层对齐无需特别精确，降低了微流控芯片的加工难度。
作为本发明优选的实施方式，所述制备原料包括固化剂与聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，简称：PDMS)组成的预聚物；可选地，所述固化剂与所述PDMS的重量比为1：(8-12)。
在上述优选的实施方式中，所述固化剂与所述PDMS的重量比典型但非限制性的例如为1：8、1：9、1：10、1：11或1：12；其中所述固化剂优选为脱醇型固化剂或脱酸型固化剂。
作为本发明优选的实施方式，浇灌后先进行脱气处理再固化成型；优选地，固化成型过程中的温度80-100℃，时间1.5-2.5h。先进行脱气处理可以排除PDMS中的气泡，保证下基体中无气泡残留影响，以防气泡对细胞的分离产生不利影响。
在上述优选的实施方式中，固化成型过程中的温度典型但非限制性的例如为：80℃、85℃、90℃、95℃或100℃；固化成型过程中的时间典型但非限制性的例如为：1.5h、1.7h、2.0h、2.2h或2.5h。
一种微流控芯片，根据微流控芯片的制作方法得到。
通过上述方法制备得到的微流控芯片中的培养室的容纳空间相对变大，可以同时容纳几个细胞的生长。
本发明提供的微流控芯片既可追踪观察单细胞的生长，亦可研究群体性细胞的动态变化。
一种上述微流控芯片在细胞培养中的用途。
下面将结合实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1
本实施例是一种用于制作微流控芯片的掩膜版，包括第一掩膜版10(如图1所示)和第二掩膜版20(如图2所示)，所述第一掩膜版10包括主要由第一矩形11以阵列方式排布的第一光刻图案12，所述第二掩膜版20包括主要由第二矩形21以平行且间隔设置方式排布的第二光刻图案22。其中，第一矩形11的长度为所述第二矩形21之间的间距的0.8倍。
实施例2
本实施例是一种用于制作微流控芯片的掩膜版，包括第一掩膜版10(如图3所示)和第二掩膜版20，所述第一掩膜版10包括主要由第一矩形11以阵列方式排布的第一光刻图案12，所述第二掩膜版20包括主要由第二矩形21以平行且间隔设置方式排布的第二光刻图案22。其中，第一矩形11的长度为所述第二矩形21之间的间距的0.5倍，且第一矩形11以错位的阵列方式排布。
实施例3和实施例4是分别用实施例1和实施例2中提供的掩膜版制备得到的微流控芯片，参照图4和图5，具体的制备方法包括以下步骤：
步骤a)：涂覆第一层光刻胶：在模具基体(实施例3和4中的均选用硅片作为模具基体)表面倒上SU-8 2000.5光刻胶，用匀胶机在800-1200rpm下离心处理，95℃前烘4-7min；第一层光刻胶的厚度为0.5-2微米；
步骤b)：曝光、显影：用第一掩膜版10进行曝光，曝光时间4-6s，95℃后烘4-7min，用SU-8显影液显影，130-138℃揭膜处理；
步骤c)：涂覆第二层光刻胶：在得到第一光刻图层的基础上，再倒一层SU-8 3010光刻胶，用匀胶机2800-200rpm离心处理，95℃前烘4-7min；第二层光刻胶的厚度为0.5-1cm；
步骤d)：曝光、显影：用第二掩膜版20进行曝光，曝光时间4-6s，95℃后烘4-7min，用SU-8显影液显影，130-138℃揭膜处理，得到模具；
步骤e)：制作下基体30：将固化剂(SYLGARD 184)与PDMS的预聚物(SYLGARD 184)按质量比为1：10充分混合后浇灌于做好的模具内，真空干燥箱脱气10min-30min，至没有气泡为止；之后将组合模具放入80℃-100℃恒温箱中固化1.5h-2.5h，然后将固化后的PDMS从模具上取下，利用直径为0.75mm的打孔针对PDMS模型打孔得到进样口和出样口后得到下基体30；
步骤f)：键合：利用等离子清洗机对PDMS下基体30和上盖板40键合，本实施例中的上盖板40为载玻片，从而得到微流控芯片。
实施例3
如图4所示，本实施例是一种微流控芯片，利用实施例1中的提供的掩膜版制备得到。图5是图4所示微流控芯片中的一个细胞观察单元的结构示意图，其中，一个细胞观察单元包括一个培养室31和与该培养室连接的通道。如图4所示，当培养室中的细胞分裂后超出培养室31后在培养基的流动下被带离，离开培养室31。
实施例4
本实施例是一种微流控芯片，利用实施例2中的提供的掩膜版制备得到。
细胞培养试验：用实施例4或5提供的微流控芯片进行细胞培养，具体试验过程如下：
步骤a)：从LB琼脂培养基挑取4-5个单克隆菌株进行37℃过夜活化，将菌悬液以1:100的比例转接一次，养到OD600＝0.2时,再以同样比例转接两次，养到OD600＝0.2；
步骤b)：在微流控芯片通道两端的进样口和出样口处连接进样管和出样管，先从进样口处注射菌液，当出样口有液体冒出，堵住出样口，用注射器向里加压，让细菌能够进入到培养中；
步骤c)：注射器中更换培养基，将注射器夹在注射泵上，调整液体流速，将培养基推入通道，将未进入培养室的细菌冲走；
步骤d)：试验观察记录：在100倍显微镜下观察并拍摄记录细菌生长过程，当细菌长满培养室后可对单个细胞的生长分裂进行观察和记录，分析其生长状态。
本发明中已用E.coli RP437菌株进行连续培养测试，100倍显微镜下，通过注射泵注射LB培养基连续培养菌株3小时，并且选择五个视野用显微镜相机记录。实验结果可观测到，当培养室中充满细菌后，由于培养室的高度只为单个细菌的尺寸，因此细菌在培养室内会相互挤压排列成整齐的队列，向两侧通道生长，3h中可记录到培养室中间细胞3-4代的分裂情况。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种用于制作微流控芯片的掩膜版，其特征在于，包括第一掩膜版和第二掩膜版；所述第一掩膜版包括主要由第一矩形以阵列方式排布的第一光刻图案，所述第二掩膜版包括主要由第二矩形以平行且间隔方式排布的第二光刻图案。
2.根据权利要求1所述的用于制作微流控芯片的掩膜版，其特征在于，所述第一矩形的长度小于等于所述第二矩形之间的间距；
优选地，所述第一矩形的长度小于等于所述第二矩形之间的间距且所述第一矩形的长度大于等于所述第二矩形之间的间距的一半。
3.根据权利要求1或2所述的用于制作微流控芯片的掩膜版，其特征在于，所述第一矩形以错位的阵列方式排布。
4.根据权利要求1或2所述的用于制作微流控芯片的掩膜版，其特征在于，所述第二光刻图案还包括样品注入通道图形和样品流出通道图形。
5.一种用于制作微流控芯片的模具的制作方法，其特征在于，在模具基体表面涂覆光刻胶，利用权利要求1-4任一项所述的用于制作微流控芯片的掩膜版进行曝光、显影后得到。
6.根据权利要求5所述的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：在模具基体表面涂覆第一层光刻胶，利用第一掩膜版进行曝光，显影后再涂覆第二层光刻胶，之后利用第二掩膜版进行曝光，显影后得到所述模具。
7.一种微流控芯片的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：将微流控芯片的制备原料浇灌于根据权利要求5或6所述的制作方法得到的模具中，经固化成型后分离得到下基体，之后下基体与上盖板连接得到微流控芯片。
8.根据权利要求7所述的微流控芯片的制作方法，其特征在于，所述制备原料包括固化剂与PDMS组成的预聚物；
优选地，所述固化剂与所述PDMS的重量比为1：(8-12)；
优选地，浇灌后先进行脱气处理再固化成型；
优选地，固化成型过程中的温度80-100℃，时间1.5-2.5h。
9.一种微流控芯片，其特征在于，根据权利要求7或8所述的制作方法得到。
10.一种权利要求9所述的微流控芯片在细胞培养中的用途。
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