KR20120118680A - 마이크로 미세유체칩 및 이를 이용한 세포배양방법 - Google Patents

마이크로 미세유체칩 및 이를 이용한 세포배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포를 포함하는 유체가 주입되는 세포 주입구; 상기 세포 주입구와 연결되고 마이크로 밸브를 구비한 세포 채널; 배양액을 포함하는 유체가 주입되는 배양액 주입구; 상기 배양액 주입구와 연결되고 마이크로 밸브를 구비한 배양액 채널; 상기 세포 채널과 상기 배양액 채널이 교차하는 교차점에 배치되며, 상기 세포 주입구 방향으로 개구부를 가지고 격벽과 격벽 사이에 세포를 포함하는 유체 및 배양액을 포함하는 유체가 관통하는 마이크로 홀을 보유한 세포 포획부; 세포를 포함하는 유체가 배출되는 배출구; 및 배양액을 포함하는 유체가 배출되는 배양액 배출구;을 포함하여 이루어지는 마이크로 미세유체칩에 관한 것으로, 본 발명의 마이크로 미세유체칩은 세포 배양, 특히 줄기세포의 배양 및 분화에 유용한 도구로 활용될 수 있고, 세포를 이용한 약물 테스트에도 활용될 수 있다.

Description

마이크로 미세유체칩 및 이를 이용한 세포배양방법{Integrated microfluidic device and method for cell culture by using it}
본 발명은 세포 배양에 적합한 마이크로 미세유체칩에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 세포 함유 유체와 배양액을 공급하는 미세유체 채널이 교차하고 그 교차점에 세포 포집부가 존재하고, 세포 포집부의 마이크로 홀의 크기를 조절한 마이크로 미세유체칩에 관한 것이다.
줄기세포는 개체를 구성하는 세포나 조직의 근간이 되며, 또한 다양한 화학적, 기계적, 물리적 요소로 인해서 증식, 분화, 이동, 사멸할 수 있는 세포로, 자가 재생산을 할 수 있고, 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 지닌 세포이다.
줄기세포의 자가 재생산 능력과 다 분화성은 사람의 발생과정의 연구를 위한 좋은 모델을 제공해줄 뿐만 아니라, 신약 개발에도 중요하게 활용될 수 있다. 줄기세포는 크게 성체 줄기세포와 배아 줄기세포 등 두 종류로 나눌 수 있다.
성체 줄기세포는 일반적으로 신체조직에 어떤 손상이 발생하면 다른 장기에 있던 줄기세포가 손상된 조직으로 변하는 분화의 유연성을 가지고 있으며, 주입된 몸 안에서 자가 재생산을 할 수 있으며 면역성에 안전성을 가지고 있다. 하지만 얻을 수 있는 줄기세포의 수가 적다는 단점이 있다. 반면에, 인간의 배아를 이용한 배아 줄기세포는 인체를 이루는 모든 세포로의 분화능력을 가지고 있다. 배아 줄기세포는 질병의 치료제, 신약의 독성검사 등 다양한 연구에 이용될 수 있지만, 배아 줄기세포 확보에 따른 윤리적 문제가 남아 있다. 따라서 이러한 문제점을 해결하기 위하여 최근 유도 만능 줄기세포에 대한 연구도 활발하게 진행되고 있다.
하지만, 줄기세포의 뛰어난 세포치료 효능에도 불구하고 기존의 세포배양 방법으로는 줄기세포의 성장과 분화조건을 최적화하는 데 많은 제약들이 있다.
이러한 문제점들을 극복하기 위해서 반도체 제조 공정인 미세가공 기술을 이용하여 인체 내 조건과 유사한 새로운 형태의 세포 및 조직 배양 연구를 할 수 있다. 미세가공기술을 이용한 랩온어칩 기술은 초소형 칩에서 여러 가지 실험조건들을 하나의 마이크로칩 안에서 실행하는 것으로 칩 위의 실험실을 말한다.
최근에 반도체 제조기술인 포토리소그래피(photolithography)와 소프트 리소그래피(soft lithography) 기술을 이용하여 마이크로 미세유체칩을 만들어 줄기세포의 증식과 분화연구가 시작되고 있다. 이렇게 만든 마이크로 미세유체칩은 생체에 적합하며, 적은 양의 미디어와 세포를 사용하여 시간과 비용 면에서 효율적이며 또한 안정하면서도 다양한 형태의 농도구배를 생성할 수 있고, 실시간으로 세포를 관찰할 수 있는 등의 많은 장점들을 가지고 있기 때문에 줄기세포의 성장과 분화를 관찰하기에 적합한 특징을 가지고 있으나, 줄기세포의 배양이나 분화에 적합하도록 배양액의 흐름으로 발생하는 전단응력에 의해 영향을 받는 것을 최소화할 수 있는 마이크로 미세유체칩에 대한 기술은 아직까지 개발되어 있지 않다.
본 발명은 세포 배양, 특히 줄기세포의 배양 및 분화에 적합한 마이크로 미세유체칩을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 마이크로 미세유체칩을 이용한 세포배양방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 마이크로 미세유체칩을 이용하여 세포배양을 한 후, 약물을 테스트하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은, 세포를 포함하는 유체가 주입되는 세포 주입구; 상기 세포 주입구와 연결되고 마이크로 밸브를 구비한 세포 채널; 배양액을 포함하는 유체가 주입되는 배양액 주입구; 상기 배양액 주입구와 연결되고 마이크로 밸브를 구비한 배양액 채널; 상기 세포 채널과 상기 배양액 채널이 교차하는 교차점에 배치되며, 상기 세포 주입구 방향으로 개구부를 가지고 격벽과 격벽 사이에 세포를 포함하는 유체 및 배양액을 포함하는 유체가 관통하는 마이크로 홀을 보유한 세포 포획부; 세포를 포함하는 유체가 배출되는 배출구; 및 배양액을 포함하는 유체가 배출되는 배양액 배출구;을 포함하여 이루어진 마이크로 미세유체칩을 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 마이크로 미세유체칩을 이용한 세포배양방법에 있어서, 세포 주입구를 통해 세포 채널로 세포를 함유한 유체 주입하여 세포 포획부에 세포를 포획하는 단계; 및 상기 세포 채널의 마이크로 밸브를 잠그고, 배양액 주입구를 통해 배양액 채널로 배양액을 주입하면서 세포를 배양하는 단계;를 포함하는 마이크로 미세유체칩을 이용한 세포배양방법을 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 세포배양방법으로 세포를 배양한 후, 복수의 배양액 채널로 각기 다른 약물을 포함하는 배양액을 주입하여, 약물에 따른 세포의 반응을 확인하는 약물의 테스트 방법을 제공한다.
본 발명의 마이크로 미세유체칩은 세포 함유 유체와 배양액을 공급하는 미세유체 채널이 교차하고 그 교차점에 세포 포집부가 존재하여, 세포 배양에 적합하고, 세포 포집부의 마이크로 홀의 크기를 조절하여 세포가 배양액의 흐름으로 발생하는 전단응력에 의해 영향을 받는 것을 최소화하였기 때문에, 본 발명의 마이크로 미세유체칩은 세포 배양, 특히 줄기세포의 배양 및 분화에 유용한 도구로 활용될 수 있고, 세포를 이용한 약물 테스트에도 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 미세유체칩의 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 미세유체칩의 세포 채널과 배양액 채널을 포함하는 미세 유체 채널과 마이크로 밸브 및 세포 포집부(microchamber array)의 모습을 나타낸 사진이다.
도 3은 제조예 1의 마이크로 미세유체칩의 세포 주입구로 형광염료를 주입하였을 때 마이크로 미세유체칩에서의 유체의 흐름을 나타낸 사진이다.
도 4는 제조예 1의 마이크로 미세유체칩의 배양액 주입구로 형광염료를 주입하였을 때 마이크로 미세유체칩에서의 유체 흐름을 나타낸 사진이다.
도 5의 좌측은 실시예 1, 중간은 비교예 1, 우측은 비교예 2의 세포 포집부에서의 속도프로파일을 나타낸 이미지이다.
도 6의 좌측은 실시예 1, 중간은 비교예 1, 우측은 비교예 2의 세포 포집부 바닥면의 전단응력을 나타낸 이미지이다.
도 7은 실시예 1 및 비교예 1 및 2에서 세포 포집부로 공급되는 유체의 속도에 따른 세포 포집부 내부의 전단응력의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 세포 포집부 내에 주입되는 주입되는 세포의 수를 최적화하기 위해 세포 포집부 내의 파티클 수를 모델링을 통해 분석한 결과이다.
도 9는 세포 함유 유체의 유속과 세포 주입구로부터의 거리에 따른 세포 포집부에 포집되는 세포수를 나타낸 그래프이다.
도 10의 A는 6 웰 플레이트에서 100% 배아줄기세포 미디엄에서 6일 동안 배양한 사진이고, B는 6 웰 플레이트에서 50%배아 줄기세포 미디엄과 50%내피세포 분화 미디엄을 혼합하여 6일 동안 배양한 사진이다.
도 11의 A는 실시예 1의 마이크로 미세유체칩의 세포 포집부에서 50% 배아줄기세포 미디엄과 50%내피세포 분화 배지를 혼합하여 6일 동안 배양한 사진이고, B는 A에서 세포 포집부를 확대한 사진이다.
본 발명의 마이크로 미세유체칩은, 세포를 포함하는 유체가 주입되는 세포 주입구; 상기 세포 주입구와 연결되고 마이크로 밸브를 구비한 세포 채널; 배양액을 포함하는 유체가 주입되는 배양액 주입구; 상기 배양액 주입구와 연결되고 마이크로 밸브를 구비한 배양액 채널; 상기 세포 채널과 상기 배양액 채널이 교차하는 교차점에 배치되며, 상기 세포 주입구 방향으로 개구부를 가지고 격벽과 격벽 사이에 세포를 포함하는 유체 및 배양액을 포함하는 유체가 관통하는 마이크로 홀을 보유한 세포 포획부; 세포를 포함하는 유체가 배출되는 배출구; 및 배양액을 포함하는 유체가 배출되는 배양액 배출구;을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 마이크로 미세유체칩은 상기 세포 포획부에 공기를 공급하는 공기공급채널을 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 마이크로 미세유체칩에서 상기 세포 채널과 상기 배양액 채널의 교차각은 60°~ 90°, 바람직하게는 90°인 것이다.
본 발명의 마이크로 미세유체칩에서 상기 세포 포획부는 세포 주입구 방향으로 개구부를 가진 5 ~ 30 ㎛, 바람직하게는 10 ~ 15 ㎛의 마이크로 홀을 포함하는 격벽으로 이루어지는 것이 바람직하다. 마이크로 홀의 크기가 상기 상한치를 초과하는 경우 배양액 채널을 통한 유체의 흐름에서 유속이 빨라질 경우 세포 포집부 내부까지 전단응력이 전달되어 세포의 배양 및 분화에 나쁜 영향을 줄 수 있고, 상기 하한치 미만일 경우에는 세포 포집부로의 배양액의 공급이 원활하지 못할 수 있다.
본 발명의 마이크로 미세유체칩에서 상기 세포 포획부의 지름 또는 크기가 300 ~ 500㎛인 것이 바람직하다.
본 발명의 마이크로 미세유체칩에서 상기 세포 포획부의 개구부의 크기는 10 ~ 100 ㎛, 바람직하게는 30 ~ 60 ㎛인 것이다.
본 발명의 마이크로 미세유체칩에서 상기 세포 포획부는 세포 주입구가 연결된 채널 방향으로 개구부가 형성된 것이면 어떠한 형상도 관계없으나 각진 "ㄷ"자 형상 또는 항아리 형상일 수 있고, 바람직하게는 항아리 형상이다.
본 발명의 마이크로 미세유체칩에서 상기 세포 채널과 상기 배양액 채널은 각각 1 ~ 100 개, 바람직하게는 2 ~ 50 개, 더욱 바람직하게는 4 ~ 50 개인 것으로, 세포 채널의 수와 배양액 채널의 수가 반드시 동일할 필요는 없다.
본 발명의 마이크로 미세유체칩에서 상기 세포 포획부는 그 크기나 지름 및 마이크로 홀의 크기를 고려하여 적절한 수의 격벽이 설치될 수 있으나, 통상 12 ~ 25 개, 바람직하게는 14 ~ 20 개의 격벽으로 이루어진다.
또한 상기 마이크로 미세유체칩은 세포배양에 이용될 수 있다. 본 발명의 세포배양방법은, 상기 마이크로 미세유체칩의 세포 주입구를 통해 세포 채널로 세포를 함유한 유체 주입하여 세포 포획부에 세포를 포획하는 단계; 및 상기 세포 채널의 마이크로 밸브를 잠그고, 배양액 주입구를 통해 배양액 채널로 배양액을 주입하면서 세포를 배양하는 단계;를 포함한다. 즉, 본 발명의 마이크로 미세유체칩을 이용한 세포배양에서는 세포를 함유한 유체의 흐름과 세포 배양용 배양액 또는 약물을 함유한 배양액의 흐름은 동시에 일어나지 않고 각각의 마이크로 밸브 조작을 통해 순차적으로, 구분된 시간 하에서 수행된다.
본 발명의 마이크로 미세유체칩은 특히 줄기세포의 배양에 적용될 수 있으며, 배양액 채널을 통한 배지의 변경을 통해 줄기세포의 분화를 유도할 수 있다.
또한 본 발명에서 상기 세포 주입구를 통한 줄기세포를 함유한 유체의 주입속도는 5 ~ 10 ㎕/min인 것이 바람직하다. 상기 상한치를 초과하면 세포 포집부에 포집되는 세포의 수가 너무 작아지고, 상기 하한치 미만에서는 세포 포집부에서 세포 주입구까지의 거리가 멀어질 수록 세포 포집부에 포집되는 세포의 수가 감소하여 균일한 수의 세포를 배양하게 어렵게 된다.
또한 본 발명에서, 세포 채널과 배양액 채널의 교차점에 위치한 복수의 세포 포획부에 포획되는 세포를 균일하게 조절하기 위하여 세포를 함유한 유체의 유속을 조절할 수 있다.
또한 본 발명은, 상기 세포배양방법으로 세포를 배양한 후, 복수의 배양액 채널로 각기 다른 약물을 포함하는 배양액을 주입하여, 약물에 따른 세포의 반응을 확인하는 약물의 테스트 방법을 제공한다. 약물은 세포의 생육을 촉진하거나, 사멸 또는 변형을 유도하는 약물일 수 있고, 또는 이 외에도 세포에 약물이 흡수되는 정도를 확인하기 위해 이용할 수도 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 더욱 구체적으로 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 : 미세유체칩 제조
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 마이크로 미세유체칩의 개략도이다. 다층 소프트 리소그라피 기술을 이용하여 도 2와 같이 가로로 세포를 함유한 유체가 공급되는 미세 유체 채널(세포 채널) 4개와 세포 채널과 직교하도록 세로로 배양액이 공급되는 4개의 미세 유체 채널(배양액 채널)을 한 층에 형성하고, 상기 세포 채널과 배양액 채널의 말단에 각각 가로 및 세로 마이크로 밸브를 설치하고, 상기 미세 유체 채널과 다른 층에 공기공급채널(air control channel)을 포함하는 미세유체칩을 만들었다.
미세 유체 채널은 12 ㎛ 두께로 AZ 포토레지스트를 이용하여 제조하였는데, 이때 실리콘웨이퍼에 헥사메틸디실라잔(HMDS)을 코팅하여 실리콘웨이퍼와 포토 레지스트의 접착력을 증가시켰다. 스핀 코터로 코팅된 포토레지스트는 마스크 필름을 이용하여 자외선에 30초 동안 노출시켜 높이 40 ㎛로 얇게 돌출된 미세 유체 채널의 패턴을 만들고 그 후에 디벨롭공정을 통해 남아있는 잔여 포토레지스트를 제거하고 핫 플레이트에 130 ℃에 2분 동안 올려두어 미세 유체 채널로 만들었다.
또한 공기공급채널은 SU-8 네가티브 포토레지스트를 이용하여 40 ㎛ 두께로 스핀 코팅한 뒤에 자외선에 60초 동안 노출하여 패턴을 만들었다. 미세유체 채널의 실리콘 웨이퍼에 폴리(디메틸실록산)[PDMS] 용액을 1분 동안 1200 rpm 으로 돌려 약 15 ㎛의 PDMS 멤브레인을 만들고 그 위에 공기공급채널의 PDMS 몰드를 플라즈마 처리한 뒤에 잘 정렬 하여 붙여 주면 결과적으로 공기공급채널과 미세 유체 채널이 교차하여 위치하게 된다.
공압에 의해서 PDMS 멤브레인이 움직여서 미세 유체 채널을 자유롭게 열고 닫아서 미세 유체의 흐름을 정밀하게 조절할 수 있으며, 상기 세포 채널과 배양액 채널의 교차점에 지름이 400 ㎛인 항아리 모양의 세포 포집부(microchamber array)를 형성하였다.
상기 마이크로 미세유체칩에서, 세포 채널에서 세포를 함유하는 유체가 공급되는 방향에 크기 96 ㎛인 개구부가 형성되고, 폭이 24 ㎛인 격벽 15개로 둘러싸고 격벽과 격벽 사이는 12 ㎛의 마이크로 홀이 형성된 항아리 모양의 세포 포집부가 세포 채널과 배양액 채널의 교차점에 형성된 것을 실시예 1로 하였다.
실시예 1과 개구부의 크기와 방향은 동일하되, 폭이 24 ㎛인 격벽 8개로 둘러싸이고, 격벽과 격벽 사이는 42 ㎛의 마이크로 홀이 형성된 항아리 모양의 세포 포집부가 세포 채널과 배양액 채널의 교차점에 형성된 것을 비교예 1로 하였다.
실시예 1과 개구부의 크기와 방향은 동일하되, 폭이 24 ㎛인 격벽 5개로 둘러싸이고, 격벽과 격벽 사이는 96 ㎛의 마이크로 홀이 형성된 항아리 모양의 세포 포집부가 세포 채널과 배양액 채널의 교차점에 형성된 것을 비교예 2로 하였다.
상기 실시예의 마이크로 미세유체칩으로 마이크로 밸브의 작동과 유체의 흐름을 형광염료를 통해서 확인하였다. 도 3은 세포 주입구로 형광염료를 주입하였을 때 마이크로 미세유체칩에서의 유체의 흐름을 나타낸 사진이고, 도 4는 배양액 주입구로 형광염료를 주입하였을 때 마이크로 미세유체칩에서의 유체 흐름을 나타낸 사진이다.
실험예 1: 전단응력 모델링
세포 포집부 안에서 전단응력(shear stress) 프로파일을 조사하기 위해 Comsol 프로그램을 사용하였다. 3 X 10-5 m/sec의 속도로 inlet을, 0으로 outlet을, 그리고 나머지 다른 면은 노슬립(no-slip)으로 지정하여 시뮬레이션을 하였다. 또한 격벽 사이의 간격이 넓어지면, 즉 마이크로 홀의 크기가 커질 때의 전단응력 변화를 확인하였다.
도 5의 좌측은 실시예 1, 중간은 비교예 1, 우측은 비교예 2의 세포 포집부에서의 속도프로파일을 나타낸 것으로 청색에서 적색으로 변화할 수록 높은 속도를 의미한다. 실시예 1은 왼쪽에서 배양액 채널을 통해 공급되는 유체의 흐름이 세포 포집부 내부에는 거의 영향을 미치지 않는 것으로 나타났지만, 비교예 1 및 2에서는 배양액 채널을 통해 공급되는 유체의 흐름이 세포 포집부 내부까지 영향을 주었다.
도 6의 좌측은 실시예 1, 중간은 비교예 1, 우측은 비교예 2의 세포 포집부 바닥면의 전단응력을 나타낸 것으로 청색에서 적색으로 변할 수록 전단응력이 높은 것을 의미한다. 도 5의 속도프로파일에서와 마찬가지로 실시예 1은 왼쪽에서 배양액 채널을 통해 공급되는 유체의 흐름으로 세포 포집부 내부에는 전단응력의 상승이 미미하고, 세포 포집부의 둘레로 전단응력이 상승하였으나, 비교예 1 및 2에서는 배양액 채널을 통해 공급되는 유체의 흐름이 세포 포집부 내부까지 전단응력이 상승하였음을 나타내었다.
그 결과 실시예 1의 마이크로 홀의 크기가 12 ㎛인 세포 포집부를 가지는 마이크로 미세유체칩이 응력이 비교예 1 및 2에 비해 낮아 항아리 모양의 세포 포집부에서 세포가 빠져나가지 않고 분화될 수 있음을 확인하였다. 그러나 비교예 1 및 2와 같이 마이크로 홀의 간격이 크면 응력이 높아져 세포에 좋지 않은 영향을 줄 것으로 예상되었다.
도 7은 실시예 1 및 비교예 1 및 2에서 세포 포집부로 공급되는 유체의 속도에 따른 세포 포집부 내부의 전단응력의 변화를 나타낸 그래프로서, 유체의 속도가 1 m/sec 에서 10 m/sec로 증가하더라도 실시예 1에서는 응력의 증가가 거의 나타나지 않았고, 비교예 1의 실시예 1에 비해서 전단응력의 증가율이 높게 나타났으며, 비교예 2에서는 비교예 1에 비해서도 현저히 높게 나타났다.
도 8은 세포 포집부 내에 주입되는 주입되는 세포의 수를 최적화하기 위해 세포 포집부 내의 파티클 수를 모델링을 통해 분석한 결과이다. 파티클의 동선을 예측하고 100개의 파티클을 주입하였을 때 약 5%의 파티클이 주입되어 고정되는 것을 확인하였다.
실험예 2: 세포 포집부 내의 세포 포집 효율
배아 줄기세포가 챔버안에 포집(docking)되도록 1 ~ 10 ㎕/min의 속도로 조절하여 세포 주입부에서 가까운 라인별로 순서대로 1번부터 4번까지 번호를 지정하여 라인별로 세포가 포집되는 수를 비교하여 도 9에 나타내었다.
속도가 빠른 5 ㎕/min 및 10 ㎕/min 에서 속도가 상대적으로 느린 1 ㎕/min에 비하여 더 골고루 더 골고루 세포가 포집된 것을 확인할 수 있었다. 더 나아가서 1 ㎕/min 의 느린 속도에서는 1번 라인이 4번 라인보다 더 세포 주입구와 가깝기 때문에 많은 수의 세포가 포집됨을 확인하였다. 그러나 속도를 증가하였을 때는 라인과 상관없이, 세포 주입구와의 거리에 상관없이 골고루 분포되었고, 최대 세포 포집량은 거의 50개 정도임을 확인하였다.
이를 통해 세포를 함유한 유체의 공급 속도와 세포 주입구와의 거리에 따라 세포의 포집량에 차이가 있다는 것을 확인하였고, 결과적으로 세포 함유 유체의 공급속도를 5 ~ 10 ㎕/min로 최적화하였을 때 세포 포집부 안에 세포를 골고루 넣을 수 있다는 것을 확인하였으며, 이러한 미세유체칩이 배아 줄기세포의 포집을 균일하게 조절하는데 유용한 도구로 사용될 것이라는 것을 확인하였다.
실험예 3: 배아 줄기세포 배양
배아 줄기세포는 젤라틴이 코팅된 조직배양 플라스크의 표면에서, 5% CO2, 37 ℃에서 배양하였다. 세포 배양용 배지는 15% Fetal bovine serum (FBS), 1400 Unit/ml leukemia inhibitory factor (LIF), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) knockout medium으로 주로 구성되어 있으며 0.1% 베타머켑토에탄올과 1% ㅂ비필수아미노산 용액, 1% penicillin-streptomycin을 포함하고 있다.
세포를 트립신으로 처리하고 재현탁한 후에 2 x 106 cells/ml 의 세포밀도를 실시예 1의 4 x 4 마이크로 미세유체칩의 세포 주입구를 통해 배아 줄기세포를 미세 유체칩에 주입하였고, 배아 줄기세포를 미세 유체칩에서 골고루 분포시키기 위해서 세포밀도와 양을 최적화하였다.
왼쪽/오른쪽에 있는 배양액 채널의 마이크로 밸브를 잠그고, 배아 줄기세포를 세포 주입구로 주입한 후에 위/아래에 있는 세포 채널의 마이크로 밸브를 잠그고, 왼쪽으로부터 세포 배양용 배지를 오른쪽으로 주입하여 배아 줄기세포를 미세 유체칩 안에서 배양하였다.
세포 배양용 배지가 통과할 수 있는 마이크로 홀을 통해 세포는 통과할 수가 없으며 세포 배양용 배지만 통과하여서 항아리 모양의 세포 포집부에서 배아 줄기세포를 배양하였고, 또한 배아줄기세포에서 유도된 내피세포로 분화하기 위해서 배양액 채널을 통해 ES ell-derived endothelial cell culture medium (EGM-2, Lonza)과 supplements containing 2% FBS, 0.4% human fibroblast growth factor-2 (hFGF-2), 0.1% vascular endothelial growth factor (VEGF), 0.1% insulin-like growth factor-1 (IGF-1), 0.1% human epidermal growth factor (hEGF), 0.04% hydrocortisone, 0.1% ascorbic acid, 0.1% heparin과 0.1% gentamicin amphotericin B-100 등을 공급하여 마이크로 미세유체칩의 세포 포집부에서의 분화를 유도하였다.
배아 줄기세포에서 배아 줄기세포와 분화된 세포들을 분류하고 분석하기 위해서 면역염색법을 사용하였다. 미세유체칩에서 배아 줄기세포를 6일 동안 배양한후 4% paraformaldehyde를 이용하여 세포를 고정하고 0.1% 트리톤을 이용하여 permeabilization 하고 3% BSA를 이용하여 블로킹을 하였다. 그리고 나서 1차 항체 PECEM과 SMA를 하루 동안 인큐베이터 시킨후, 2차 항체를 처리하였다. 마지막으로 4, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)로 counterstaining을 하고, 형광현미경을 이용하여 배아 줄기세포에서 내피세포로의 분화를 성공적으로 분석하였다.
도 10의 A는 6 웰 플레이트에서 100% 배아줄기세포 미디엄에서 6일 동안 배양한 것이고, B는 6 웰 플레이트에서 50%배아 줄기세포 미디엄과 50%내피세포 분화 미디엄을 혼합하여 6일 동안 배양한 것으로, Anti-platelet endothelial cell adhesion molecule (PECEM)과 smooth muscle actin (SMA)마커는 적색과 녹색으로 표시되었으며, 스케일바는 300 ㎛를 나타내었다.
도 11의 A는 실시예 1의 마이크로 미세유체칩의 세포 포집부에서 50% 배아줄기세포 미디엄과 50%내피세포 분화 배지를 혼합하여 6일 동안 배양한 사진이고, B는 A에서 세포 포집부를 확대한 사진으로, 본 발명의 미세유체칩에서 배아 줄기세포가 내피세포로 성공적으로 분화되었음을 확인할 수 있었다. 스케일바는 200 ㎛이다.

Claims (15)

  1. 세포를 포함하는 유체가 주입되는 세포 주입구;
    상기 세포 주입구와 연결되고 마이크로 밸브를 구비한 세포 채널;
    배양액을 포함하는 유체가 주입되는 배양액 주입구;
    상기 배양액 주입구와 연결되고 마이크로 밸브를 구비한 배양액 채널;
    상기 세포 채널과 상기 배양액 채널이 교차하는 교차점에 배치되며, 상기 세포 주입구 방향으로 개구부를 가지고 격벽과 격벽 사이에 세포를 포함하는 유체 및 배양액을 포함하는 유체가 관통하는 마이크로 홀을 보유한 세포 포획부;
    세포를 포함하는 유체가 배출되는 배출구; 및
    배양액을 포함하는 유체가 배출되는 배양액 배출구;을 포함하여 이루어진 마이크로 미세유체칩.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포 포획부에 공기를 공급하는 공기공급채널을 더 포함하여 이루어진 마이크로 미세유체칩.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 세포 채널과 상기 배양액 채널의 교차각은 60°~ 90°인 것을 특징으로 하는 마이크로 미세유체칩.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 세포 포획부는 세포 주입구 방향으로 개구부를 가진 5 ~ 30 ㎛의 마이크로 홀을 포함하는 격벽으로 이루어진 것을 특징으로 하는 마이크로 미세유체칩.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 세포 포획부의 지름 또는 크기가 300 ~ 500㎛인 것을 특징으로 하는 마이크로 미세유체칩.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 세포 포획부의 개구부의 크기는 10 ~ 100 ㎛인 것을 특징으로 하는 마이크로 미세유체칩.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 포획부는 항아리 형상인 것을 특징으로 하는 마이크로 미세유체칩.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 채널과 상기 배양액 채널은 각각 1 ~ 100 개인 것을 특징으로 하는 마이크로 미세유체칩.
  9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 포획부의 개구부크기는 30 ~ 60 ㎛이고, 마이크로 홀의 크기는 10 ~ 15 ㎛이며, 12 ~ 25 개의 격벽으로 이루어진 것을 특징으로 하는 마이크로 미세유체칩.
  10. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 하나의 마이크로 미세유체칩을 이용한 세포배양방법에 있어서,
    세포 주입구를 통해 세포 채널로 세포를 함유한 유체 주입하여 세포 포획부에 세포를 포획하는 단계; 및
    상기 세포 채널의 마이크로 밸브를 잠그고, 배양액 주입구를 통해 배양액 채널로 배양액을 주입하면서 세포를 배양하는 단계;를 포함하는 마이크로 미세유체칩을 이용한 세포배양방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 공기공급채널을 통해 세포 포획부로 공기를 공급하는 것을 특징으로 하는 마이크로 미세유체칩을 이용한 세포배양방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 세포는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 마이크로 미세유체칩을 이용한 세포배양방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 세포 주입구를 통한 줄기세포를 함유한 유체의 주입속도는 5 ~ 10 ㎕/min인 것을 특징으로 하는 마이크로 미세유체칩을 이용한 세포배양방법.
  14. 제 10 항에 있어서, 세포 채널과 배양액 채널의 교차점에 위치한 복수의 세포 포획부에 포획되는 세포의 수를 균일하게 조절하기 위하여 세포를 함유한 유체의 유속을 조절하는 것을 특징으로 하는 세포배양방법.
  15. 제 10 항의 세포배양방법으로 세포를 배양한 후, 복수의 배양액 채널로 각기 다른 약물을 포함하는 배양액을 주입하여, 약물에 따른 세포의 반응을 확인하는 약물의 테스트 방법.
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