CN107648602A

CN107648602A - 二价乙肝疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN107648602A
Application number: CN201710992798.6A
Authority: CN
Inventors: 董晨; 郭志荣; 刘芳; 张钧; 王洁
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2017-10-23
Filing date: 2017-10-23
Publication date: 2018-02-02
Anticipated expiration: 2037-10-23
Also published as: CN107648602B

Abstract

本发明涉及一种二价乙肝疫苗，以其总体积为基准，包括浓度均为10‑60μg/ml的重组野生型乙肝病毒表面抗原(重组w‑HBsAg)和重组突变型乙肝病毒表面抗原(重组m‑HBsAg)以及氢氧化铝凝胶溶液，重组w‑HBsAg含有野生型HBV的HBsAg或HBsAg氨基酸片段，重组m‑HBsAg含有突变的HBsAg或突变的HBsAg氨基酸片段，突变的HBsAg的突变位点为L21S、I126S和G145R。本发明还提供了其制备方法：将重组w‑HBsAg和重组m‑HBsAg分别与氢氧化铝凝胶溶液混匀，调节pH至5.5‑9.6；将得到的两种混合物进行混合，得到二价乙肝疫苗。本发明的二价乙肝疫苗能够诱导针对野生型HBV和常见的突变型HBV(含有L21S、I126S和/或G145R突变)的特异性中和抗体，进而预防和控制乙型肝炎的发生和流行，其制备方法简单。

Description

二价乙肝疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种二价乙肝疫苗及其制备方法。

背景技术

乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)引起的慢性感染是全球重要的公共卫生问题，也是我国肝硬化和肝细胞癌的首要病因。据世界卫生组织报道，目前全世界超过20亿人感染过HBV，其中至少有3.5亿感染人群发展成为慢性乙型肝炎携带者。我国是乙型肝炎流行大国，据统计，我国现有3000余万慢性乙肝患者，而且每年约有30万人死于慢性乙肝所致的肝硬化/肝癌等相关疾病。由此可见，预防、控制和消灭HBV的传播和流行具有重要的意义。

乙肝疫苗是预防HBV感染的最有效途径，完整的乙肝疫苗接种可以对95％以上的婴幼儿和成年人起保护性作用。HBV是一个包裹着的部分双链环状DNA分子，其基因组含有4个开放读码框架。分别称为S、C、P、X，S区又分为S基因、preS1基因和preS2基因三段，分别编码S蛋白、preS1蛋白和preS2蛋白，其中S基因可以刺激机体产生中和性抗体或称为保护性抗体。目前市场上广泛使用的基因工程乙肝疫苗正是利用啤酒酵母、CHO细胞等真核表达系统通过表达、纯化乙肝表面抗原(HBsAg)制备。

自从1992年乙肝疫苗在我国被纳入儿童计划免疫规划后，我国新生儿及低年龄组儿童人群HBsAg阳性检出率均呈现大幅度的下降。HBV感染状况正逐步得到改善，然而调查发现，在疫苗免疫儿童中仍然存在HBV慢性感染的现象(免疫逃避)。由于这类儿童可能成为潜在的慢性HBV感染人群，因此已成为新的值得关注的焦点问题。进一步研究发现，免疫压力导致的HBsAg‘a’抗原决定簇变异株的出现是免疫逃避的重要原因。HBV‘a’抗原决定簇由位于HBsAg第124-147位的氨基酸构成。研究表明，‘a’抗原决定簇中I126S和G145R位点突变是最为常见的变异，该两位点的突变能够改变HBsAg的空间结构，降低了其与保护性抗体的结合力，逃避现有疫苗保护，从而产生新的感染问题。

HBsAg‘a’抗原决定簇以外区域L21S的突变同样能够影响HBsAg的空间结构及其抗原性，造成免疫逃避。最新的研究证实，含有L21S、I126S和/或G145R的HBV突变株在疫苗免疫后人群具有形成水平传播的风险。而目前并不存在一种能够有效诱导针对野生型HBV和常见的突变型HBV(含有L21S、I126S和/或G145R突变)的特异性中和抗体的疫苗。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种二价乙肝疫苗及其制备方法，本发明的二价乙肝疫苗能够诱导针对野生型HBV和常见的突变型HBV(含有L21S、I126S和/或G145R突变)的特异性中和抗体，进而预防和控制乙型肝炎的发生和流行，其制备方法简单。

在一方面，本发明提供了一种二价乙肝疫苗，以其总体积为基准，包括重组野生型乙肝病毒表面抗原(w-HBsAg)、重组突变型乙肝病毒表面抗原(m-HBsAg)以及免疫佐剂，其中重组野生型乙肝病毒表面抗原和重组突变型乙肝病毒表面抗原的浓度均为10-60μg/ml，重组w-HBsAg含有野生型乙肝病毒(HBV)的HBsAg或HBsAg氨基酸片段，重组m-HBsAg含有乙肝病毒突变的HBsAg或突变的HBsAg氨基酸片段，m-HBsAg的突变位点为L21S、I126S和G145R，免疫佐剂为氢氧化铝凝胶溶液。

进一步地，重组w-HBsAg或重组m-HBsAg是由酵母细胞或哺乳动物细胞表达的基因工程重组蛋白。优选地，重组w-HBsAg或重组m-HBsAg是由毕赤酵母细胞或CHO细胞表达的基因工程重组蛋白。

进一步地，重组w-HBsAg含有野生型HBV的HBsAg的226个氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地，重组m-HBsAg含有L21S、I126S和G145R突变位点的HBsAg，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，二价乙肝疫苗中，氢氧化铝凝胶溶液的浓度为0.6-1.5mg/ml。氢氧化铝凝胶可以增加免疫原性。

进一步地，二价乙肝疫苗中还包括0.5-0.7w/v％的明胶。

优选地，二价乙肝疫苗中，重组w-HBsAg的浓度为10-20μg/ml，重组m-HBsAg的浓度为10-20μg/ml，免疫佐剂的浓度为1.0mg/ml。

在另一方面，本发明还提供了一种上述二价乙肝疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)将重组w-HBsAg与重组m-HBsAg分别与氢氧化铝凝胶溶液混匀，调节pH至5.5-9.6；

(2)将步骤(1)得到的两种混合物进行混合，得到二价乙肝疫苗。

进一步地，在步骤(2)中，还包括加入明胶进行混合的步骤。加入明胶后，可增加疫苗的稳定性。

进一步地，步骤(2)得到的二价乙肝疫苗可在含有硅涂层的玻璃瓶中贮存，增加疫苗的稳定性并便于运输保存。

本发明的二价乙肝疫苗中，使用的氢氧化铝凝胶溶液可以购买或采用已知方法制备。该类佐剂为本领域技术人员所熟知的，易于获得和制备。

本发明的二价乙肝疫苗能够有效的预防野生型和突变型HBV的感染和流行，借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明的二价乙肝疫苗可以有效的诱导机体产生针对野生型和突变型HBV的中和抗体。

本发明的二价乙肝疫苗的体外实验研究表明，该二价疫苗诱导的针对HBV的中和抗体，不仅可以有效的预防野生型HBV的感染，而且可以预防L21S突变型HBV、I126S突变型HBV、G145R突变型HBV、L21S+G145R突变型HBV、L21S+I126S突变型HBV、I126S+G145R突变型HBV以及L21S+I126S+G145R的感染，因此本发明提供的二价疫苗具有比传统单价疫苗更好的保护效力。

实验研究结果表明，根据本发明的方案制备的二价乙肝疫苗能够诱导机体产生针对野生型HBV和突变型HBV的高滴度、特异性抗体，因此本发明提供的二价疫苗具有比单价疫苗更好的免疫原性和保护效力。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细说明如后。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

一种二价乙肝疫苗，以其总体积为基准，包括重组野生型乙肝病毒表面抗原(重组w-HBsAg，浓度为10μg/ml)、重组突变型乙肝病毒表面抗原(重组m-HBsAg，浓度为10μg/ml)以及氢氧化铝凝胶(浓度为0.6mg/mL)。重组w-HBsAg或重组m-HBsAg是由酵母细胞、哺乳动物细胞或其他可用细胞表达的基因工程重组蛋白。其中，重组w-HBsAg含有野生型HBV的HBsAg的226个氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。重组m-HBsAg含有L21S、I126S和G145R三个突变位点的突变HBsAg的226个氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

其制备方法如下：

(1)将重组w-HBsAg和重组m-HBsAg分别与氢氧化铝凝胶溶液混匀，调节pH至5.5-9.6，得到两种混合物；

实施例2

一种二价乙肝疫苗，以其总体积为基准，包括重组野生型乙肝病毒表面抗原(重组w-HBsAg，浓度为20μg/ml)、重组突变型乙肝病毒表面抗原(重组m-HBsAg，浓度为20μg/ml)以及氢氧化铝凝胶(浓度为1.0mg/mL)。重组w-HBsAg或重组m-HBsAg是由酵母细胞、哺乳动物细胞或其他可用细胞表达的基因工程重组蛋白。其中，重组w-HBsAg含有野生型HBV的HBsAg的226个氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。重组m-HBsAg含有L21S、I126S和G145R三个突变位点的突变HBsAg的226个氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

其制备方法参照实施例1进行。

实施例3

一种二价乙肝疫苗，以其总体积为基准，包括重组野生型乙肝病毒表面抗原(重组w-HBsAg，浓度为60μg/ml)、重组突变型乙肝病毒表面抗原(重组m-HBsAg，浓度为60μg/ml)、氢氧化铝凝胶(浓度为1.5mg/mL)以及0.5-0.7w/v％用量的明胶。重组w-HBsAg或重组m-HBsAg是由酵母细胞、哺乳动物细胞或其他可用细胞表达的基因工程重组蛋白。其中，重组w-HBsAg含有野生型HBV的HBsAg的226个氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。重组m-HBsAg含有L21S、I126S和G145R三个突变位点的突变HBsAg的226个氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

其制备方法如下：

(2)将步骤(1)得到的两种混合物进行混合，同时加入明胶进行混合，混匀后得到二价乙肝疫苗，放入含有硅涂层的玻璃瓶中贮存。

实施例4

本实施例提供了本发明所使用的重组w-HBsAg的制备方法，具体如下：

(1)以中国流行毒株基因C2型的HBV野生型S基因序列为模板，用引物1(5’-ATGGAGAACACAACATCAGGA-3’，SEQ ID No.3)和引物2(5’-TTA AAT GTA TAC CCA AAG AC-3’，SEQ ID No.4)扩增S基因全长(226氨基酸)。PCR条件为：94℃-45秒，55℃-50秒，72℃-50秒，35个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化，克隆入pPIC9质粒中。经测序鉴定后转化酵母菌GS115。

(2)培养通过基因工程方法制备的可以表达重组野生型HBsAg的毕赤酵母细胞，通过离心获得的酵母细胞沉淀，以1:2的比例稀释到缓冲液中(0.5M NaCl，10mM EDTA，0.01％HgSO₄，pH 7.0)。稀释后的溶液用玻璃珠搅拌器破碎细胞壁。获得的溶液加入0.5％的中性表面活性剂，4℃搅拌混合均匀。向得到的溶液中加入NaOH调节至pH＝11，然后4℃下搅拌混合5小时。得到的溶液加入HCl至pH＝4。离心去除沉淀，调整pH值至7.0。然后用硅胶吸附、葡萄糖层析等方法得到纯化的重组w-HBsAg，纯化后产物通过电泳验证并用以疫苗制备。

重组w-HBsAg也可以按照2000年版《中国生物制品规程》中《重组(CHO细胞)乙型肝炎疫苗制造及检定规程》制备。

实施例5

本实施例提供了本发明所使用的重组m-HBsAg的制备方法，具体如下：

(1)以基因C2型的突变型HBV的S基因序列为模板，用引物1(5’-ATGGAGAACACAACATCAGGA-3’，SEQ ID No.3)和引物2(5’-TTA AAT GTA TAC CCA AAG AC-3’，SEQ ID No.4)扩增S基因全长(226氨基酸)。PCR条件为：94℃-45秒，55℃-50秒，72℃-50秒，35个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化，克隆入pPIC9质粒中。经测序鉴定后转化酵母菌GS115。

(2)培养通过基因工程方法制备的可以表达重组野生型HBsAg的毕赤酵母细胞，通过离心获得的酵母细胞沉淀，以1:2的比例稀释到缓冲液中(0.5M NaCl，10mM EDTA，0.01％HgSO₄，pH 7.0)。稀释后的溶液用玻璃珠搅拌器破碎细胞壁。获得的溶液加入0.5％的中性表面活性剂，4℃搅拌混合均匀。得到的溶液中加入NaOH至pH 11，然后4℃搅拌混合5小时。得到的溶液加入HCl至pH 4.0。离心去除沉淀，调整pH值至7.0。然后用硅胶吸附、葡萄糖层析等方法得到纯化的重组m-HBsAg，纯化后产物通过电泳验证并用以疫苗制备。

重组m-HBsAg也可以按照2000年版《中国生物制品规程》中《重组(CHO细胞)乙型肝炎疫苗制造及检定规程》制备。

实施例7

本实施例提供了本发明二价乙肝疫苗的免疫原性实验方法与结果，具体如下：

一、实验动物分组与免疫方案

选用6-8周龄的雌性BALB/C纯系小鼠100只，随机分为10组，每组10只。A组：空白对照，注射浓度为1.0mg/mL的氢氧化铝凝胶，0.1mL/只；B组：野生型乙肝疫苗组：注射野生型乙肝疫苗，重组野生型HBsAg浓度为10μg/mL，0.1mL/只；C组：野生型乙肝疫苗组：注射野生型乙肝疫苗，重组野生型HBsAg浓度为30μg/mL，0.1mL/只；D组：野生型乙肝疫苗组：注射野生型乙肝疫苗，重组野生型HBsAg浓度为60μg/mL，0.1mL/只；E组：突变型乙肝疫苗组：注射突变型乙肝疫苗，重组突变型HBsAg浓度为10μg/mL，0.1mL/只；F组：突变型乙肝疫苗组：注射突变型乙肝疫苗，重组突变型HBsAg浓度为30μg/mL，0.1mL/只；G组：突变型乙肝疫苗组：注射突变型乙肝疫苗，重组突变型HBsAg浓度为60μg/mL，0.1mL/只；H组：二价乙肝疫苗组：注射重组野生型HBsAg10μg/mL+重组突变型HBsAg10μg/mL，0.1mL/只；I组：二价乙肝疫苗组：注射重组野生型HBsAg30μg/mL+重组突变型HBsAg30μg/mL，0.1mL/只；J组：二价乙肝疫苗组：注射重组野生型HBsAg60μg/mL+重组突变型HBsAg60μg/mL，0.1mL/只。各组动物分别于0、4、6周注射相应疫苗三次，其中0周背部皮下多点注射0.1mL相应疫苗，4、6周腹腔注射0.05mL相应疫苗。

二、检测方法及结果

(1)血清采集

所有动物均于免疫前以及免疫后的第2、4、6、8、10、12、18、24、48周经眶静脉采血，-20℃冻存，于实验结束后统一检测。

(2)乙肝抗体检测

采用北京万泰公司生产的HBsAb检测试剂盒(ELISA)，各组动物血清以1:100稀释，检测各动物抗体产生情况。以1:10的免疫前血清作为阴性对照，P/N比值大于2.1则视为抗体阳性。

将不同组别、不同时间的免疫血清分别系列稀释，以1:100为起点，采用ELISA法检测乙肝抗体滴度。

(3)测试结果

各组实验对象的检测结果如表1-3所示，结果表明，使用不同剂量的野生型乙肝疫苗、突变型乙肝疫苗和二价乙肝疫苗免疫小鼠，4周后所有小鼠均可以产生相应的针对乙肝表面抗原的抗体(HBsAb)。而且，免疫血清中HBsAb滴度随着疫苗剂量、免疫次数的增加而升高，至8-10周时达到最高水平(1:102400)，至48周时各组免疫血清的滴度仍可维持1:6400。表1不同剂量的野生型乙肝疫苗诱生小鼠乙肝抗体的产生情况

表2不同剂量的突变型乙肝疫苗诱生小鼠乙肝抗体的产生情况

表3不同剂量的新型二价乙肝疫苗诱生小鼠乙肝抗体的产生情况

实施例8

二价乙肝疫苗的体外中和实验研究，方法如下：

依照已建立的体外中和试验方法(中国实验和临床病毒学杂志，2005,19(2)：172-175)，将动物免疫后48周的免疫血清和阴性对照血清系列稀释后，分别与适量野生型或突变型HBV病毒悬液(最小感染细胞的病毒滴度的100倍剂量)相混匀，置37℃水浴中温育1小时，然后将混合物接种至HepG2单层细胞的6孔板，37℃温育24小时后，以PBS液洗涤细胞3遍，提取核酸，PCR检测HBV DNA。以检测不到HBV目的基因片段(252bp)为中和试验阳性。同时设细胞对照孔、病毒对照孔及病毒和阴性血清混合物对照孔。

结果如表4-6所示，野生型乙肝疫苗诱导的免疫血清能够有效的中和野生型HBV，中和滴度可达1:128；突变型乙肝疫苗诱导的免疫血清能够有效的中和突变型HBV，中和滴度可达1:64。然而，野生型乙肝疫苗诱导的免疫血清仅能中和L21S突变的HBV，不能中和其他类型突变的HBV，而且突变型乙肝疫苗诱导的免疫血清也不能中和野生型HBV。但是，本发明的二价乙肝疫苗诱导的抗体能够有效中和野生型HBV(1:128)和突变型HBV(1:64)。表4野生型乙肝疫苗诱生的HBsAb对野生型和突变型HBV的中和能力

表5突变型乙肝疫苗诱生的HBsAb对野生型和突变型HBV的中和能力

表6本发明二价乙肝疫苗诱生的HBsAb对野生型和突变型HBV的中和能力

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 二价乙肝疫苗及其制备方法

<141> 2017-10-23

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 226

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 1

Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

1 5 10 15

Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu

20 25 30

Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys

35 40 45

Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser

50 55 60

Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe

65 70 75 80

Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val

85 90 95

Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly

100 105 110

Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala

115 120 125

Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp

130 135 140

Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg

145 150 155 160

Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu

165 170 175

Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu

180 185 190

Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile

195 200 205

Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val

210 215 220

Tyr Ile

225

<210> 2

<211> 226

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 2

Met Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

1 5 10 15

Ala Gly Phe Phe Ser Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu

20 25 30

Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Lys Cys

35 40 45

Pro Gly Gln Asn Leu Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser

50 55 60

Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr His Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe

65 70 75 80

Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val

85 90 95

Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly

100 105 110

Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ser Pro Ala

115 120 125

Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp

130 135 140

Arg Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys

145 150 155 160

Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu

165 170 175

Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu

180 185 190

Ser Val Ile Trp Met Met Trp Phe Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile

195 200 205

Leu Ser Pro Phe Met Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val

210 215 220

Tyr Ile

225

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

Claims

1.一种二价乙肝疫苗，其特征在于：以其总体积为基准，包括重组野生型乙肝病毒表面抗原、重组突变型乙肝病毒表面抗原以及免疫佐剂，其中所述重组野生型乙肝病毒表面抗原和重组突变型乙肝病毒表面抗原的浓度均为10-60μg/ml，所述重组野生型乙肝病毒表面抗原含有野生型乙肝病毒的HBsAg或HBsAg氨基酸片段，所述重组突变型乙肝病毒表面抗原含有乙肝病毒突变的HBsAg或突变的HBsAg氨基酸片段，所述突变的HBsAg的突变位点为L21S、I126S和G145R，所述免疫佐剂为氢氧化铝凝胶溶液。

2.根据权利要求1所述的二价乙肝疫苗，其特征在于：所述重组野生型乙肝病毒表面抗原或所述重组突变型乙肝病毒表面抗原是由酵母细胞或哺乳动物细胞表达的基因工程重组蛋白。

3.根据权利要求1所述的二价乙肝疫苗，其特征在于：所述重组野生型乙肝病毒表面抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.根据权利要求1所述的二价乙肝疫苗，其特征在于：所述重组突变型乙肝病毒表面抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求1所述的二价乙肝疫苗，其特征在于：所述二价乙肝疫苗中，氢氧化铝凝胶溶液的浓度为0.6-1.5mg/ml。

6.根据权利要求1所述的二价乙肝疫苗，其特征在于：所述二价乙肝疫苗中还包括0.5-0.7w/v％的明胶。

7.一种根据权利要求1-5中任一项所述的二价乙肝疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将所述重组野生型乙肝病毒表面抗原和所述重组突变型乙肝病毒表面抗原分别与所述氢氧化铝凝胶溶液混匀，并调节pH至5.5-9.6；

(2)将步骤(1)得到的两种混合物进行混合，得到所述二价乙肝疫苗。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，还包括加入明胶进行混合的步骤。