CN105263522A - 可中和乙肝病毒的结合分子 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种结合分子,其通过结合于至少一个选自adw、adr、ayw和ayr的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)亚型而具有乙肝病毒中和活性。本发明的结合分子对HBsAg具有优异的结合能力,从而能够结合于HBV的所有四种主要亚型,即adw、adr、ayw和ayr,并对主要亚型表现出中和效应,并对多种HBsAg突变抗原表现出广谱中和效应,因此,所述结合分子非常有助于乙肝的预防和治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种能够中和乙肝病毒的结合分子,更具体地,涉及一种来源于人类单个B细胞的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的特异性人单克隆抗体。
背景技术
乙肝病毒(HBV)是一种属于肝脱氧核苷酸病毒科的DNA病毒,是造成肝硬化和肝癌的主要原因。根据WHO在2012年的报告,全世界约有2.4亿慢性乙肝携带者,每年有500000-700000人死于乙肝引起的疾病。在韩国,约有5-8%的成年人为HBV携带者,且成年人中80%的慢性肝炎患者、65%的肝硬化患者以及70%的肝细胞肝癌患者均与HBV感染相关。自从1980年代开始引入了疫苗,在韩国,乙肝的流行已有大幅下降,但是,HBV感染仍然是慢性肝病最主要的原因,且肝脏疾病被认为是国内最严重的社会问题之一。因此,无论是对已经感染的患者还是新感染者,能够预防其进展为慢性肝脏疾病的合适的抗病毒治疗剂都是非常必要的。
目前用于慢性乙肝治疗的药物包括干扰素(PEG-干扰素)、拉米夫定、阿德福韦酯以及恩替卡韦,除了干扰素以外的口服抗病毒药均为核苷/核酸类似药物。这些药物通过抑制HBV的逆转录酶活性而抑制病毒DNA的复制。此外,这些药物降低了血清HBV的DNA水平、使ALT水平正常化,并改善了肝脏的纤维化。
尽管有这些优点,但由于长期使用而造成了耐药,这些核苷类似物表现出的效果有所降低,最终,伴随着肝脏疾病的进展,肝功能恶化。具体地,已知全世界使用最广泛的拉米夫定在5年后表现出70-80%的耐药率。此外,这些药物并不直接抑制HBV感染。为此,将这些药物与乙肝抗体药物联用以预防新的感染,即,母亲至孩子的垂直感染以及肝移植患者的重复感染。
目前所采用的乙肝抗体药物的制备是通过利用高级纯化技术将抗体从含有抗HBV抗体的人血来源中分离出来,并利用病毒灭活技术去除潜在的污染源。然而,由于昂贵的人类血清可获取性太低,而灭活人血浆来源病毒的代价太高且费时,这些方法并不能满足日益高涨的需求。此外,还存在潜在感染源的缺陷,还有因低效造成的长期用药而引起的较差便利性。
自从1970年代开始建立了单克隆抗体(Mab)制备技术,就不断有技术革新来开发能够具有优异表现的抗体治疗剂。从小鼠制备的单克隆抗体不能长时间重复施用,因为将单克隆抗体施用于人类后会产生人抗-小鼠抗体(HAMA)。为了克服这个缺陷,开发了将小鼠抗体的恒定区替换为人类抗体的氨基酸残基而制备的嵌合抗体,或将90-95%的小鼠抗体氨基酸残基替换为人抗体的氨基酸序列而制备的人源化抗体。然而,仍未完全解决HAMA的产生问题。因此,在最近几年,迫切需要开发一种基于完全人类抗体的抗体治疗剂。
对HBV的传统分类是检测其血清型,其基于乙肝表面抗原(HBsAg)对标准血清的反应性。由于目前对这些血清型的分子生物学特征已知,可以基于HBsAg的氨基酸序列将HBV分成各种亚型。HBsAg第124-147位氨基酸的a决定簇是免疫源性的主要位点,但通常在HBV中存在,因此基于不同的表位可将HBV分成各亚型。换言之,基于HBsAg第122和160位的氨基酸特性,将HBV分为d/y和r/w决定簇。当第122位氨基酸是精氨酸时,则确定为y亚型,当第122位氨基酸为赖氨酸时,则确定为d亚型。同样地,当第160位氨基酸为精氨酸时,则确定为r亚型,而当第160位氨基酸是赖氨酸时,则确定为w亚型。根据这些标准,共报道了有4种亚型(adr、adw、ayr和ayw),而自此,根据第127位的氨基酸确定了w1-w4型,并根据第177或178位氨基酸的额外突变确定了q-分类。因此,目前已知的有10种亚型。
同时,近年来,随着核苷酸序列分析的普及,根据核苷酸序列中的差异而不是血清型反应,将HBV分成了8个基因型(A-H)。这些基因型基于在整个病毒基因中超过8%的序列变异而进行了分类,并进一步基于4%的变异而分成了各基因亚型。
对于HBV的分类,血清型和基因型皆需进行考虑。然而,血清型和基因型之间的关系并非一直是不变的,通常是一种基因型共同存在两或三种血清型。此外,根据基因型,HBV表现出特定的地域分布。例如,在超过90%的韩国患者中,可观察到基因型C和adr血清型,但在中国,基因型B(主要是血清型adw2)和C以一定比例共存,该比例根据地域而有着轻度的变化。在印度,主要有基因型D(主要是血清型ayw2),而基因型A(主要是血清型adw2)则存在于部分区域。由于HBV的多样性具有这些特点,要求在V单克隆HBV中和抗体的开发中要选择结合于所有基因型上存在的共同位点的抗体。
公开内容
技术问题
据此,本发明人通过大量努力而解决了上述问题,结果开发了一种针对HBsAg的人单克隆抗体,并发现,该抗体针对多种乙肝病毒亚型具有中和效应,从而完成了本发明。
本发明的一个目的在于提供一种结合分子,其通过结合一个或多个选自adw、adr、ayw和ayr的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)亚型而具有乙肝病毒中和活性。
本发明的另一目的在于提供一种编码上述结合分子的多核苷酸。
本发明的又一目的在于提供一种含有上述多核苷酸的表达载体。
本发明的又一目的在于提供一种宿主细胞,其产生具有乙肝病毒中和活性的结合分子,所述宿主细胞含有转染至其中的上述表达载体。
本发明的又一目的在于提供一种含有上述结合分子的组合物。
本发明的又一目的在于提供一种治疗乙肝的方法,所述方法包括向感染了乙肝病毒的对象施用治疗有效量的上述组合物。
本发明的又一目的在于提供一种预防乙肝的方法,所述方法包括向对象施用治疗有效量的上述组合物。
本发明的又一目的在于提供一种使用上述组合物,从而诊断患者感染乙肝病毒的方法。
本发明的又一目的在于提供一种使用上述组合物,从而提供患者感染乙肝病毒的诊断信息的方法。
本发明的又一方面在于提供一种诊断乙肝病毒的试剂盒,所述试剂盒含有上述组合物。
技术方案
为了达到上述目的,在一实施例中,本发明提供了一种结合分子,其通过结合一种或多种选自adw、adr、ayw和ayr的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)亚型而具有乙肝病毒中和活性。
在另一实施例中,本发明提供了一种编码上述结合分子的多核苷酸。
在另一实施例中,本发明提供了一种含有上述多核苷酸的表达载体。
在另一实施例中,本发明提供了一种宿主细胞,其产生具有乙肝病毒中和活性的结合分子,所述宿主细胞含有转染至其中的上述表达载体。
在另一实施例中,本发明提供了含有上述结合分子的组合物。
在另一实施例中,本发明提供了一种治疗乙肝的方法,所述方法包括向感染了乙肝病毒的对象施用治疗有效量的上述组合物。
在另一实施例中,本发明提供了一种预防乙肝的方法,所述方法包括向对象施用治疗有效量的上述组合物。
在另一实施例中,本发明提供了一种诊断患者感染乙肝病毒的方法,所述方法包括步骤:i)将一样本与所述组合物接触;和ii)检测所述组合物和所述样本之间的反应。
在另一实施例中,本发明提供了一种提供患者感染乙肝病毒的诊断信息的方法,所述方法包括步骤:i)将一样本与所述组合物接触;和ii)检测所述组合物和所述样本之间的反应。
在另一实施例中,本发明提供了一种诊断乙肝病毒的试剂盒,所述试剂盒含有:i)上述组合物;和ii)一容器。
在下文,本发明将作进一步的具体描述。
本发明的一个实施例涉及一种结合分子,其通过结合一种或多种选自adw、adr、ayw和ayr的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)亚型而具有乙肝病毒中和活性。
本发明所述结合分子具有结合以及中和乙肝病毒基因型A、B、C、D、E、F、G和H的活性。
此外,本发明所述结合分子对拉米夫定、阿德福韦、克拉夫定或恩替卡韦耐药的乙肝病毒具有结合以及中和活性。
在本发明的一个实施例中,所述结合分子通过与HBsAg的第101、112、126、129、133、143、173、175、184、185或196位具有氨基酸突变的突变型抗原结合,从而可具有乙肝病毒中和活性,但不限于此。
在本发明的一个实施例中,所述突变型抗原可以是Q101R、K112R、T126N、I126S、Q129H、M133H、P143K、L173F、L175S、A184V、I185M或W196L突变型抗原,但不限于此。
在此,Q101R是一突变型抗原,其中HBsAg的第101位由谷氨酰胺替换为精氨酸。
K112R是一突变型抗原,其中HBsAg的第101位由赖氨酸替换为精氨酸。
T126N是一突变型抗原,其中HBsAg的第126位由苏氨酸替换为天冬酰胺。
I126S是一突变型抗原,其中HBsAg的第126位由异亮氨酸替换为丝氨酸。
Q129H是一突变型抗原,其中HBsAg的第129位由谷氨酰胺替换为组氨酸。
M133H是一突变型抗原,其中HBsAg的第133位由甲硫氨酸替换为组氨酸。
P143K是一突变型抗原,其中HBsAg的第143位由脯氨酸替换为赖氨酸。
L173F是一突变型抗原,其中HBsAg的第173位由亮氨酸替换为苯丙氨酸。
L175S是一突变型抗原,其中HBsAg的第175位由亮氨酸替换为丝氨酸。
A184V是一突变型抗原,其中HBsAg的第184位由丙氨酸替换为缬氨酸。
I185M是一突变型抗原,其中HBsAg的第185位由异亮氨酸替换为甲硫氨酸。
W196L是一突变型抗原,其中HBsAg的第196位由色氨酸替换为亮氨酸。
HBsAg的野生型氨基酸序列(基因型C)可如SEQIDNO.:44所示,其序列信息可见GenBankNo.GQ872210.1。
在本发明的一个实施例中,所述结合分子含有包括选自下组任一的多肽序列:i)一序列,包括根据Kabat法测定的如SEQIDNO.:1所示的CDR1区、如SEQIDNO.:2所示的CDR2区和如SEQIDNO.:3所示的CDR3区;ii)一序列,包括根据Kabat法测定的如SEQIDNO.:4所示的CDR1区、如SEQIDNO.:5所示的CDR1区和如SEQIDNO.:6所示的CDR3区;iii)一序列,包括根据Kabat法测定的如SEQIDNO.:7所示的CDR1区、如SEQIDNO.:8所示的CDR2区和如SEQIDNO.:9所示的CDR3区;iv)一序列,包括根据Kabat法测定的如SEQIDNO.:10所示的CDR1区、如SEQIDNO.:11所示的CDR2区和如SEQIDNO.:12所示的CDR3区。
在本发明的一个实施例中,所示结合分子含有一多肽序列,其包括根据Kabat法测定的如SEQIDNO.:1所示的CDR1区、如SEQIDNO.:2所示的CDR2区和如SEQIDNO.:3所示的CDR3区;以及如SEQIDNO.:4所示的CDR1区、如SEQIDNO.:5所示的CDR1区和如SEQIDNO.:6所示的CDR3区。
在本发明的另一实施例中,所述结合分子含有一多肽序列,其包括根据Kabat法测定的如SEQIDNO.:7所示的CDR1区、如SEQIDNO.:8所示的CDR2区和如SEQIDNO.:9所示的CDR3区;以及如SEQIDNO.:10所示的CDR1区、如SEQIDNO.:11所示的CDR2区和如SEQIDNO.:12所示的CDR3区。
在本发明中,可变域的互补决定区(CDR)由Kabat(见Kabat等,免疫学兴趣基因序列第五版,国立健康研究院,贝塞斯达,MD.(1991)(Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(5th),NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991)))等所设计系统中的传统方法测定。本发明中所用的CDR根据Kabat法编号,但本发明也涵盖了含有采用其它方法测定的CDR的结合分子,包括IMGT法、乔西亚(Chothia)法以及AbM法。
在本发明另一实施例中,所述结合分子含有一多肽序列,其包括任一选自SEQIDNO.:13-16所示的多肽序列。
在本发明另一实施例中,所述结合分子含有如SEQIDNO.:13所示的可变区以及如SEQIDNO.:14所示的可变区。
在本发明的另一实施例中,所述结合分子含有如SEQIDNO.:15所示的可变区和如SEQIDNO.:16所示的可变区。
在本发明的另一个实施例中,所述结合分子含有一多肽序列,其包括任一选自SEQIDNO.:17-20所示的多肽序列。
在本发明的另一个实施例中,所述结合分子含有如SEQIDNO.:17所示的轻链和如SEQIDNO.:18所示的重链。
在本发明的另一个实施例中,所述结合分子含有如SEQIDNO.:19所示的轻链和如SEQIDNO.:20所示的重链。
在本发明的一个实施例中,所述结合分子是抗体或其片段。所述抗体可以是Fab片段、Fv片段、双抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体,但不限于此。在本发明的一个实施例中,提供了一种结合于HBsAg的完全人类抗体。在说明书中,术语“抗体”为广义的,且具体覆盖了完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(如,双特异性抗体)以及抗体片段,只要它们表现出所需的生物学活性。抗体是一种由免疫系统产生的蛋白,其能够识别并结合特异性抗原。就其结构而言,抗体是一种Y型蛋白,其由四条氨基酸链构成(两条重链和两条轻链)。各个抗体主要具有两个区域:可变区和恒定区。可变区位于Y臂部的末端,与靶抗原结合并相互作用。所述可变区含有互补决定区(CDR),其识别并结合于特定抗原的特异性结合位点。恒定区位于Y的尾部,由免疫系统识别并与之相互作用。靶抗原通常含有多个结合位点,也称为表位,其通过多种抗体的CDR识别。特异性结合于不同表位的各抗体具有不同结构。因此,一个抗原可以具有多个相应的抗体。
此外,本发明还涵盖了所述抗体的功能性变体。当抗体的变体能够与本发明抗体竞争特异性结合乙肝病毒或其表面抗原(HBsAg)亚型,就认为它们是本发明抗体的功能性变体。功能性变体包括但不限于:与主要结构序列基本相似的衍生物,但其含有,例如本发明亲代单克隆抗体中未发现的体外或体内修饰、化学药物和/或生化药物。这些修饰包括,例如乙酰化、酰化、核苷或核苷衍生物的共价结合、脂质或脂质衍生物的共价结合、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。此外,功能性变体还可以是这样的抗体,其所含的氨基酸序列相比于亲代抗体的氨基酸序列,包括一个或多个氨基酸的取代、插入、删除或其组合。此外,功能性变体可含有在氨基或羧基端一端或两端截短的氨基酸序列。本发明功能性变体与本发明亲代抗体相比,可具有相同或不同、更高或更低的结合亲和力,但其仍能结合于乙肝病毒或其表面抗原(HBsAg)亚型。例如,可修饰可变区的氨基酸序列,包括(但不限于)骨架区、超变区、尤其是CDR3区。通常,轻链或重链区含有三个超变区,其包括三个CDR区以及多个保守区,即所谓的骨架区(FR)。所述超变区含有来自CDR的氨基酸残基和来自超变环的氨基酸残基。落入本发明范围的功能性变体可具有与本文定义的亲代抗体约50-99%、约60-99%、约80-99%、约90-99%、约95-99%或约97-99%的氨基酸序列同源性。可任选本领域技术人员所熟知的计算机程序,例如Gap或Bestfit对所需比较的氨基酸序列进行比对,并定义相似或相同氨基酸残基。可通过(但不限于)本领域已知的通用分子生物学方法,包括PCR、寡核苷酸定向突变和定点突变来改变亲代单克隆抗体或其部分或通过有机合成法来获得功能性变体。
此外,抗体上还可连接有药物。具体地,本发明抗体还可以抗体-药物偶联物的形式使用。用于药物局部递送的抗体-药物偶联物(ADC),即,免疫偶联物能够将药物部分靶向递送至感染细胞,因为非偶联药物制剂的施用会对正常细胞造成无法接受水平的毒性。通过提高多克隆和单克隆抗体(Mab)的选择性以及药物-连接和药物-释放特性,可使ADC达到最大的效应以及最小的毒性。
常规的连接方法,即,通过共价键将药物部分连接至抗体,通常会导致分子的不均匀混合物,其中,抗体的很多位点上都连接有药物部分。例如,细胞毒性药物通常会通过抗体上常见的多个赖氨酸残基偶联于抗体,从而造成不均匀的抗体-药物偶联混合物。根据反应条件,不均匀混合物通常含有0-8或更多个连接于药物部分的抗体分布。此外,具有药物部分/抗体特定整数比的各偶联物亚群是潜在的不均匀混合物,其中药物部分连接在抗体的多个位点上。抗体是大型、复杂、结构各异的生物分子,通常具有多个反应性功能基团。其与连接剂和药物-连接子中间体的反应性取决于,例如pH、浓度、盐浓度和共溶剂之类的因素。
在另一实施例中,本发明涉及编码上述结合分子的多核苷酸。在实施例中,本发明涵盖了编码抗HBsAg单克隆抗体的分离的核酸分子。本发明所述核酸分子包括具有翻译自本发明抗体氨基酸序列的多核苷酸的所有本领域已知的核酸分子。因此,可产生具有ORF(开放阅读框)的多种多核苷酸序列,其均落入本发明核酸分子的范围中。
在另一实施例中,本发明涉及含有上述多核苷酸的表达载体。所述表达载体可以来源于自下组(但不限于):由赛特瑞恩有限公司(韩国)生产的MarEx表达载体(见韩国专利号10-1076602)(一种广泛市售可得的pCDNA载体)、F、R1、RP1、Col、pBR322、ToL、Ti载体、粘粒、噬菌体,如λ、λ形、M13、Mu、p1P22、Qμ、T-even、T2、T3、T7等;以及植物病毒。任何本领域已知的表达载体可用于本发明,且对表达载体的选择取决于具体宿主细胞的性质。可通过(但不限于)磷酸钙转染、病毒感染、DEAE右旋糖酐介导的转染、脂质体转染试剂转染或电穿孔等将表达载体导入宿主细胞,任何本领域技术人员可选择并采用适合所用表达载体和宿主细胞的导入方法。所述表达载体可含有(但不限于)一个或多可选择性标记,还可采用不含有选择性标记的载体。选择性标记的选择可取决于具体的宿主细胞,尽管这对于本发明并非至关重要,因为这是本领域技术人员已知的。为了便于纯化本发明核酸分子,可向表达载体内插入标签序列。标签的例子包括(但不限于):6-His标签、血球凝集素标签、myc标签或FLAG标签。任何本领域技术人员所知的有利于纯化的标签均可用于本发明。
在另一实施例中,本发明涉及生产具有乙肝病毒中和活性的结合分子的宿主细胞,所述宿主细胞内转染有上述表达载体。在本发明中,所述宿主细胞可包括(但不限于)哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细菌来源的细胞。本发明所用所述哺乳动物细胞可选自下组(但不限于):CHO细胞、F2N细胞、CSO细胞、BHK细胞、Bowes黑色素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、HEK293细胞和HEK293T细胞。本领域技术人员所知的可作为哺乳动物宿主细胞的任何细胞均可用于本发明。
在另一实施例中,本发明涉及一种含有上述结合分子的组合物。除了所述结合分子外,本发明组合物还可包括药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂是本领域技术人员所熟知的。在本发明的一个实施方式中,所述组合物可用于预防或治疗乙肝。在本发明另一实施例中,所述组合物可用于乙肝的诊断。
除了所述结合分子外,本发明组合物还可含有作为抗病毒药物的干扰素、抗HBV单克隆抗体、抗HBV多克隆抗体、核苷类似物、DNA聚合酶抑制剂、siRNA试剂或治疗性疫苗。
含有本发明结合分子的所述组合物可根据常规方法制成以下形式(但不限于):无菌注射溶液、冻干制剂、预装注射器溶剂、口服制剂、外用制剂或栓剂。
本发明诊断组合物中所采用的结合分子优选作可检测标记。可采用多种技术来标记生物分子,其均为本领域熟知并在本发明的范围内。可用于本发明的标记的例子包括酶、放射性同位素、胶体金属、荧光化合物、化学发光性化合物和生物发光性化合物。常用的标记包括(特别是)荧光染料(如荧光素、若丹明、德克萨斯红等)、酶(如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶)、放射性同位素(如32P或125I)、生物素、地高辛、胶体金属、化学或生物发光化合物(如二氧杂环丁烷、发光氨或吖啶类)。标记方法,如将酶或生物素基团进行共价偶联、碘化反应、磷酸化作用、生物素酰化等,均为现有技术熟知。检测方法包括(但不限于):放射自显影、荧光显微法、直接或间接酶反应等。常用的检测方法包括放射性同位素或非放射性同位素法。它们还尤其包括免疫印迹法、铺覆测定法、RIA(放射性免疫测定)和IRMA(免疫放射性免疫测定)、EIA(酶免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、FIA(荧光免疫测定)和CLIA(化学发光免疫测定)。
在另一实施例中,本发明涉及一种治疗乙肝的方法,其包括步骤:向感染乙肝病毒的对象施用治疗有效量的所述组合物。在本发明的治疗方法中,可将本领域技术人员已知的治疗剂与所述组合物共同施用。在本发明的治疗方法中,施用途径可分为口服和胃肠外途径。例如,施用途径可以是(但不限于)静脉内施用。
在本发明另一实施例中,所述治疗方法还包括施用抗病毒药的步骤。抗病毒药可以是(但不限于)干扰素、核苷/核苷酸类似物、抗HBV单克隆抗体、抗HBV多克隆抗体、DNA聚合酶抑制剂、siRNA试剂或治疗性疫苗。所述核苷/核苷酸类似物可以是(但不限于)拉米夫定、恩替卡韦、克拉夫定或阿德福韦酯。
在另一实施例中,本发明涉及一种预防乙肝的方法,包括步骤:向一对象施用治疗有效量的所述组合物。在本发明的预防方法中,可将本领域技术人员已知的预防性药剂与所述组合物共同施用。在本发明的预防方法中,施用途径可分为口服和胃肠外途径。例如,施用途径可以是(但不限于)静脉内施用。
可通过将本发明组合物施用于哺乳动物(包括人类)来预防或治疗HBV感染或由HBV感染引起的疾病。在此,根据所需治疗的对象、疾病或病况的严重性、施用频率以及主治医生的决定来确定所述结合分子(如抗体)的剂量。作为活性成分的所述结合分子可按0.001-10mg/kg(体重)或0.005-1mg/kg(体重)每天的剂量经胃肠外施用于哺乳动物。在不引起副作用的一些情况下,更优选为比上述范围下限更低的剂量,或比上述范围上限更高的剂量。比上述范围上限更高的剂量可分为多个日剂量。
在另一实施例中,本发明涉及一种诊断患者感染乙肝病毒的方法,所述方法包括步骤:i)将样本与所述组合物接触;和ii)检测所述组合物和所述样本之间的反应。在本发明的诊断方法中,如若必要,可按照本领域技术人员已知的任何方法将本发明结合分子(如单克隆抗体)与用于诊断和检测的标签相连。
在本发明的诊断方法中,所述样本可选自(但不限于):痰液、唾沫、血液、肺细胞、肺组织粘液、呼吸组织和唾液。所述样本可通过本领域技术人员所知的任何常规方法制备。
在另一实施例中,本发明涉及一种提供患者感染乙肝病毒诊断信息的方法,所述方法包括步骤:i)将样本与所述组合物接触;和ii)检测所述组合物和所述样本之间的反应。
在另一实施例中,本发明涉及一种诊断乙肝病毒的试剂盒,所述试剂盒包括i)上述组合物;和ii)一容器。在本发明诊断试剂盒中,所述容器2)可含有一固体载体。本发明所述结合分子可连接于所述固体载体,且该固体载体可是多孔或非多孔的、平面或非平面的。
在另一实施例中,本发明涉及一种检测乙肝病毒存在的方法,所述方法包括步骤:将所述组合物与分离自患者的样本接触。
在下文,将对本发明所用术语进行定义。
“乙肝病毒(HBV)”是一种属于肝脱氧核糖核酸病毒科的DNA病毒,是肝硬化和肝癌的主要原因。
基于HBV基因组的核苷酸序列多样性为8%或更高,将“基因型”分为8种基因型(A、B、C、D、E、F、G和H)。基于核苷酸序列多样性为4%或更高,所述基因型再分为各亚型。因此,各基因型还被分为A1-A5、B1-B5、C1-C5、D1-D4、E、F1-F4、G、和H。
通过第124-147位氨基酸的a决定簇、第122位氨基酸的d/y决定簇以及第160位氨基酸的w/r决定簇,将“血清型”分为4种主要亚型(adw/adr/ayw/ayr)。a决定簇通常在所有血清型中出现,而d/y和w/r决定簇仅在第122和160位氨基酸是赖氨酸或精氨酸时出现。除了这些主要的血清型,目前已知通过多个氨基酸位点的亚决定簇确定的多种亚血清型。基于第127位氨基酸是脯氨酸、苏氨酸或亮氨酸,将w血清型的亚型确定为w1/2、w3或w4,而根据第158位和159位氨基酸或第177位和178位氨基酸是否突变而将其分为q+或q-血清型。此外,已知第134、143、159、161和168位的氨基酸会影响亚血清型。总之,HBV的血清型可以在大方向上分成4种血清型(adw/adr/ayw/ayr),还可再分为总共10种血清型(adw2、adw3、adw4q-、adrq+、adrq-、ayw1、ayw2、ayw3、ayw4和ayr)。
“乙肝病毒表面抗原(HBsAg)”指在HBV的三种表面蛋白(即L(前S1+前S2+S)、M(前S2+S)和S(小)蛋白)中由226个氨基酸构成的S蛋白,其是病毒体和22nm亚病毒颗粒的主要构件。其是完全疏水性的,但有两个部分亲水的区域。第一区域由氨基酸30-79构成并存在于病毒内,而第二区域则暴露在病毒外表面,由氨基酸99-168构成,被称为主要亲水区(MHR)。在MHR抗原-抗体反应中作为主要靶点的“a”决定簇由氨基酸124-147构成。
如本文所用,术语“结合分子”指的是完整免疫球蛋白,包括单克隆抗体,例如嵌合的、人源化的或人单克隆抗体,或指可变区、底物结合酶、受体或蛋白,其包括与完整免疫球蛋白竞争特异性结合免疫球蛋白结合伴侣的免疫球蛋白片段,例如甲型流感病毒的HA单体或HA三聚体。无论结构如何,所述抗原结合片段结合完整免疫球蛋白识别的相同抗原。抗原结合片段可含有一肽或多肽,其包括的氨基酸序列由结合分子氨基酸序列中至少2、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、或250个连续氨基酸残基构成。“抗原结合片段”包括(特别是)Fab、F(ab′)、F(ab′)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体(single-chainphageantibody)、双抗体、三抗体、四抗体、多肽,其含有至少一个足以使得特异性抗原结合于该多肽的免疫球蛋白片段。上述片段可经合成、或酶法、或通过对完整免疫球蛋白的化学切割而制备,或通过重组DNA技术进行遗传工程改造。其生产的方法在本领域中众所周知。
如本文所用,术语“药学上可接受的赋形剂”指的是任何惰性物质,其与活性分子(例如药物、试剂、或结合分子)组合用于制备适用的或便捷的剂型。所述药学上可接受的赋形剂是一种在所用剂量和浓度下对受者无毒的赋形剂,其能与制剂的其它成分(包括药物、试剂或结合分子)相容。
如本文所用,术语“治疗有效量”指的是有效预防或治疗由于甲型流感病毒感染造成的病情的结合分子用量。
【有益效果】
本发明结合分子具有优异的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)结合能力,因此可结合HBV全部四种主要亚型(adw、adr、ayw和ayr)并表现出针对各亚型的中和效应。此外,本发明所述结合分子表现出对多种HBsAg突变抗原的中和效应。因此,其非常有助于乙肝的预防和治疗。
【附图说明】
图1显示了所进行的ELISA结果,其确认了在16种抗体中,4号和40号抗体(根据发明实施例的初步筛选)与乙肝病毒表面抗原(HBsAg)亚型adr的结合。
图2显示了所进行的ELISA结果,其确认了在16种抗体中,4号和40号抗体(根据发明实施例的初步筛选)与乙肝病毒表面抗原(HBsAg)亚型ad、ay、adr和adw结合。
图3显示了所进行的ELISA结果,其确认了在12种抗体中,4号和40号抗体(根据发明实施例的二级筛选)与“a”决定簇的多种突变抗原的结合。
图4a-4d显示了4种抗体中,根据本发明实施例中第三筛选步骤选择的4号和40号抗体对四种乙肝病毒基因型(A、B、C和D)的体外中和试验结果,并显示了通过实时PCR基于HBV增殖DNA水平检测胞内病毒水平的结果。
图5a-5d显示了5种抗体中,根据本发明实施例中第三筛选步骤选择的4号和40号抗体对四种乙肝病毒基因型(A、B、C和D)的体外中和试验结果,并显示了通过化学荧光免疫测定法(CLIA)基于HBsAg水平检测增殖的和胞外分泌病毒水平的结果。
图6a-6d显示了通过克隆根据本发明实施例筛选的4号和40号抗体的轻链和重链获得的载体图谱。
图7a和7b显示了含有根据本发明实施例筛选的4号和40号抗体的轻链和重链的表达载体图谱。
图8显示了所进行的夹心ELISA结果,其确认了4号和40号抗体对分离自感染7种HBV基因型(A、B、C、D、E、F和H)患者的15种HBV表面抗原血清样本的结合亲和力。
图9显示了所进行的夹心ELISA结果,其确认了4号和40号抗体对4种耐药(拉米夫定、阿德福韦、克拉夫定和恩替卡韦)病毒的结合亲和力。
【最佳方式】
自此,将参考实施例对本发明进行具体描述。然而应理解,这些实施例仅作示例目的而非对本发明的现在。在本发明中引用的参考文献在此全文引入参考。
实施例
实施例1:自急性乙肝恢复患者血液中分离PBMC
对由急性乙肝恢复患者组成的供血组进行血液检查确认,并在伦理审查委员会(IRB)的批准下进行供者筛选和血液采集。这些供者具有以下特征:(1)所述供者无HBsAg抗原;(2)所述供者有针对HBsAg和HBcAg的抗体;和(3)所述供者对其它感染性病毒呈阴性,即,抗HCV抗体和抗HIV抗体。在对供者进行选择后,自供者采集约100ml全血,并采用LymphoprepTM(Axis-Shield,挪威,1114545)从采集的血液分离外周血单核细胞(PBMC)。所分离的PBMC用磷酸缓冲盐水洗涤三次,以2×107细胞/ml的浓度悬浮于KM库II冰冻培养基(Cosmobio,日本,KOJ-16092010)并储藏于液氮罐中。
实施例2:单克隆抗体的初步筛选
采用Jin等(JinA.等,2009.Nat.Med.15,1088-1092)描述的方法对分泌抗原特异性抗体的B细胞进行了筛选。简而言之,将实施例1中分离的PBMC以1个细胞/孔的密度加入准备好的微阵列芯片的各孔中。通过预包覆抗-人IgG抗体,对单个细胞分泌的抗体进行了确认。采用经标记的HBsAg抗原,经ELISPOT(酶联免疫斑点法:SedgwickJ.D.,2005,MethodsMolBiol.Vol.302,pp.314)对经筛选的抗体分泌细胞是否分泌HBsAg-结合抗体进行了分析。通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),从各抗体分泌细胞获得抗体重链和轻链的基因序列。将所获的重链和轻链DNA插入到pcDNA3.1(+)表达载体(英杰公司,美国,V790-20)从而制备各自产生抗体轻链和重链的表达载体。将所制备的表达载体转染至F2N细胞(韩国专利号10-1005967;专利权人:赛特瑞恩有限公司)。然后,利用转染的F2N细胞所产生的抗体,通过以下实施例3所述的ELISA法对与HBsAg结合的16种抗体(抗体编号3、4、5、12、22、23、25、28、29、30、32、34、35、37、38和40)进行了初步筛选。在此,将各抗体样品不经分离和纯化就在培养基中连续稀释,选择在稀释因子下表现出与HBsAg的适当反应性,而没有非特异性反应的所有抗体。
为了确认经初步筛选的16种抗体与HBsAg的反应性并获得用于二级筛选的纯化抗体,用各提取的抗体转染悬浮培养的F2N细胞系,从而制备产生单克隆抗体的瞬时细胞系。所述转染按以下方式进行。
按生产商的说明书,采用阳离子聚合物FreeStyleTMMax(英杰公司,美国,16447-100)进行细胞的瞬时转染。在转染前一天,,或取2将在EX-CELL293无血清培养基(SAFC,LIK,14571C;下文称为“EX-CELL293培养基”)中培养的F2N细胞进行离心,并以1×106个细胞/ml的细胞浓度悬浮于改良的EX-CELL293培养基中(SAFC,LIK,65237;定制),取80ml的细胞悬浮液接种于250ml的锥形烧瓶中00ml的细胞悬浮液接种在1L的锥形烧瓶中。在转染当天,在接种了80ml细胞悬浮液的情况中,将100μg的单克隆抗体编码DNA和100μl的FreeStyleTMMax试剂用OptiPROSFMII培养基(英杰公司,美国,12309)各自稀释到1.6ml的体积,然后轻柔搅拌。在接种了200ml的细胞悬浮液的情况中,采用OptiPROSFMII培养基(英杰公司,USA,12309)将250μg的DNA和250μl的FreeStyleTMMax试剂各稀释到4ml体积,然后轻柔搅拌。在搅拌操作后,立即将含有FreeStyleTMMax的稀释溶液与含有DNA的稀释溶液混合,将混合溶液在室温下孵育19分钟。在室温下孵育19分钟期间,采用新鲜的改良EX-CELL293培养基将所接种的F2N细胞稀释到0.8×106个细胞的细胞浓度。在孵育19分钟后,用含有DNA和FreeStyleTMMax试剂的混合溶液对F2N细胞进行处理并转染。在转染当天,向转染细胞中加入相同量的EX-CELL293培养基,然后孵育7-8天,由此制备了单克隆抗体。
再次采用ELISA分析16个分离并纯化的抗体对抗原(HBsAg)的结合亲和力,这些抗体中,4号和40号抗体的分析结果如图1所示。在初步筛选中所采用的抗原均为表达于CHO细胞中的HBsAgadr亚型抗原,而对这些抗原具有结合亲和力的抗体被认为能与adr亚型抗原进行特异性反应。
实施例3:单克隆抗体的二级筛选
为了确认16种初步筛选抗体与HBsAg亚型以及二次筛选抗体与全部4种主要亚型(adw、adr、ayw和ayr)结合的特异性,采用了HBsAg多种亚型进行了ELISA检测。用于确认与d/y决定簇结合特异性的HBsAgad/ay亚型购自Acris(德国)。这两种抗原分离自乙肝患者的血液。采用HBsAg的adw/adr亚型来确认d/r决定簇的结合特异性,该亚型均为购自ProspecBio(以色列)的重组蛋白。
采用抗体和抗原,经ELISA测定抗体(HBsAg)和抗体的反应性。具体地,ELISA按以下方式进行。
首先,各取100μl的HbsAgad/ay和adw/adr亚型抗原(400ng/ml)吸附于96孔微量滴定板(Nunc,丹麦,449824)的各孔上。采用含有1%小牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(Teknova,美国,D5120)对板进行封闭,然后向滴定板的各孔加入稀释的1μg/ml抗体样本。接着,将滴定板在室温下孵育1小时,再用过氧化物酶标记的山羊抗-人γ抗体(Zymed,美国,62.8420)处理。在室温下孵育1小时后,将滴定板与四甲基联苯胺(TMB;西格玛-奥德里奇,美国,T0440)一起孵育,加入1NH2SO4终止孵育。用板读数器(Spectramaxplus384,分子设备公司(MolecularDevice))测定450/620nm下的吸光度,并用医学图表绘制程序(Graphpadprismprogram)(图表绘制软件公司,美国,(GraphPadSoftwareInc.USA))将抗原-抗体反应以图表形式示出。当吸光度为0.5或更高时,确定抗体反应为阳性,而当吸光度低于0.5时确定为阴性。
实验结果表明,16种抗体中的4种抗体未识别w决定簇和/或y决定簇,但其它12种抗体均能与抗原的所有亚型轻易反应。在这些抗体中,4号和40号抗体对HBV表面抗原亚型的特异性测定结果如图2所示。
下表1对上述的结果进行了总结。在表1中,符号“+”表示阳性,而符号“-”表示阴性。
表1:用于检测4号和40号抗体的亚型特异性的ELISA结果
HBsAg | 4 | 40 |
ad | + | + |
ay | + | + |
adr | + | + |
adw | + | + |
实施例4:对在“a”决定簇种具有突变的多种突变抗原的结合亲和力检测
为了检测以上实施例中筛选所得12种抗体与在“a”决定簇中具有突变的8个突变抗原的反应性,如以上实施例3所述的相同方式进行ELISA测试。这些抗原各自在第126、129、133和143位氨基酸具有突变,可在乙肝患者中实际报道的乙肝免疫球蛋白(HBIg)或疫苗逃逸性突变体中找到,且存在表面抗原未能在诊断中经适当测定的问题(Horvat等,检验医学(Labmedicine),第42卷(8):488-496,2011)。重组蛋购自ProspecBio。
图3显示了4号和40号抗体各自与在“a”决定簇中有突变的多种突变抗原的反应性,且下表2对该反应性的检测结果进行了总结。在表2中,符号“+”表示存在反应性,而符号“-”表示不存在反应性。
表2:检测4号和40号抗体与在“a”决定簇有突变的突变HBsAg结合亲和力的
ELISA结果
HBsAg | 4 | 40 |
adw T126N | + | + |
adw Q129H | + | + |
adw M133H | + | + |
adw T143K | + | + |
实施例5:抗乙肝病毒的体外中和效应的验证
在12种抗体中,选取了5种对在“a”决定簇有突变的突变抗原具有优异反应性的抗体。为了验证所选抗体对多种乙肝病毒基因型的中和活性,进行了体外中和试验。
HBV的体外中和试验是一种在病毒增殖最活跃的时间点对胞内和胞外病毒水平进行测定从而评估各抗体中和活性的方法,用于检测各抗体对感染病毒的人肝细胞的病毒感染抑制程度。细胞内病毒水平通过增殖HBV的DNA水平来测定,增殖的以及胞外分泌的病毒水平则通过培养基内HBVDNA和HBsAg的水平来测定。在此,采用TaqMan探针,经实时PCR对HBVDNA进行定量,并采用化学发光免疫测定(CLIA)对HBsAg进行定量。
5-1:首次体外中和测试
在病毒感染前一天,采用2步胶原酶灌注法,从具有人源化肝脏的uPA/SCID小鼠制备乙肝病毒感染所需的人肝细胞。将分离的肝细胞按每孔4×105个细胞的密度接种于包覆了1型胶原的24孔板上。取含有10%FBS(阿特拉斯生物制剂(AtlasBiologicals),美国,F0500A)、1X青霉素/链霉素(Gibco,美国,15140)以及20mMHEPES(Gibco,美国,15630)的DMEM(Gibco,美国,11965)作为培养基加入各孔。将所制备的肝细胞于37℃、5%CO2下在湿化孵育器中培养24小时。
采用具有人源化肝脏的嵌合子小鼠制备的四种基因型HBV(基因型A(Genbank登录号:AB246345.1)、基因型B(Genbank登录号:AB246341)、基因型C(Genbank登录号:AB246338.1)和基因型D(Genbank登录号:AB246347))进行病毒感染。各基因型的HBV按2×106病毒浓度在含有所选抗体的混合物中一起在细胞中感染。具体操作如下。
A.含病毒混合物的制备
采用dHCGM培养基(DMEM+10%FBS、44mMNaHCO3、15ug/mlL-脯氨酸、0.25ug/ml胰岛素、50nM地塞米松、5ng/mlEGF、0.1mMAsc-2p、和2%DMSO)将病毒和各抗体混合至终体积并在室温下孵育1小时。在此,病毒的使用浓度是2×106病毒,并将所选的抗体各自稀释至4种浓度(10、1、0.1和0.01ug/ml)。
B.病毒感染
向的dHCGM培养基中加入的40%PEG(西格玛,美国,P1458),并加入上述“A”部分中制备的病毒/抗体混合物,从而制备病毒感染混合物。从所制备的细胞中去除培养基,然后向细胞中加入感染混合物,再培养24小时。
C.培养基更换、培养以及分析样本的制备
在感染病毒后,肝细胞总共培养12天。在第1、2和7天,洗涤细胞并更换培养基。在去除了现有的培养基后,用的DMEM+10%FBS洗涤细胞,并向细胞内加入相同量的新鲜dHCGM培养基。在第7天,收集和培养基分别用于对细胞生产和分泌的胞外HBsAg和HBVDNA进行定量,储存于-20℃下直至分析。
经过12天完整的培养,同时取细胞和培养基对胞内和胞外病毒进行定量。收集培养基,按现有技术中相同方法进行HBsAg测定以及HBVDNA测定,用的DMEM+10%FBS洗涤各孔一次从而收集细胞,然后向各孔中加入的SMITEST溶液(医学和生物实验室有限公司(Medical&BiologicalLaboratoriesCo.,Ltd.))以裂解细胞。根据制造商(医学和生物实验室有限公司)的方法提取HBVDNA。
D.样本分析
利用TaqMan探针、TaqManPCR核心试剂(CoreReagents)(生命科技(LifeTechnologies),美国)和ABIPrism7500序列检测系统(应用生物系统(AppliedBiosystems),美国),经实时PCR对HBVDNA进行定量。采用CLIA方法,经自动化系统ARCHITECT(雅培(Abbott),USA)对HBsAg进行定量。
表3:HBV定量的实时PCR的引物/探针序列
表4:实时PCR程序
程序 | 循环 |
50℃,2分钟 | 1 |
95℃,10分钟 | 1 |
95℃,20秒→60℃,1分钟 | 53 |
阈值 | 0.1 |
4号和40号抗体对各病毒基因型的测定结果如图4a-4d及5a-5d所示。
当比较分析在各抗体治疗浓度下的胞内HBVDNA水平时,可见实验中所采用的5种抗体均对基因型C具有强烈的中和活性,这是因为它们是基于分类为基因型C的HBsAgadr亚型的结合亲和力而初步筛选得到的。作为阳性对照的HBIg显示,与作为阴性对照的抗Her2抗体(CT-P6)相比,HBVDNA水平有着至少400倍的大幅下降,且用1ug/ml(1/10的HBIg浓度)的40号抗体处理的样本在病毒DNA水平上表现出相同的下降。即使在0.1ug/ml的低浓度下,4号抗体在HBVDNA水平上也表现出了100倍的下降,表明其维持了较高水平的中和活性。此外,与阳性对照HBIg相比,4号和40号抗体对基因型A和B的最高中和活性表现出2倍的提高,而即使在低浓度(1ug/ml(40号抗体)或1ug/ml(4号抗体))下,其对基因型D也保持着高度的中和活性(图4a-4d)。
可以发现,在培养基中测定的胞外HBsAg定量结果同样反映出4号和40号抗体对四种基因型(A、B、C和D)的中和活性(图5a-5d)。
综合上述结果,对经数个步骤筛选的5种抗体针对4种基因型(A、B、C和D)的体外中和活性进行了验证,结果可见,4号和40号抗体对所有采用的病毒都具有很高的中和活性水平。
实施例6:含有4号和40号抗体的表达载体以及产生抗体细胞系的制备
6-1:表达载体的制备
采用分别含有重链基因和轻链基因的初始pcDNA质粒作为模板,在下述条件下用聚合酶链式反应(PCR)对重链基因和轻链基因进行了扩增:在95℃下热变性1分钟,然后进行30个循环,每个循环为95℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟。所扩增的重链基因和轻链基因经限制性内切酶NheI和PmeI处理,然后分别插入用相同限制性内切酶处理的CT184质粒和pCT146质粒。pCT184和pCT146质粒均由赛特瑞恩有限公司构建,用于分别克隆各抗体的重链和轻链(图6a-6d)。然后,为了构建同时含有重链转录单元(启动子-重链基因-聚合A)和轻链转录单元(启动子-轻链基因-聚合A)的表达载体,采用限制性内切酶PacI和AscI处理含有重链基因的pCT184质粒,从而获得重链转录单元,再采用相同限制性内切酶处理含有轻链基因的pCT146质粒,然后插入重链转录单元,从而构建了同时含有重链转录单元和轻链转录单元的质粒(图7a和7b)。所构建的质粒用Endofree质粒maxi试剂盒(凯杰公司(QIAGEN),德国,货号12362)提取,并分析所提取DNA的核苷酸序列,从而测定抗体的核苷酸序列。
6-2:制备产生抗体的细胞系
将所提取抗体的DNA转染至CHO-K1细胞系,从而制备产生单克隆抗体的细胞系。按以下方法进行转染。
根据制造商说明书,采用LipofectamineLTX&PLUS(英杰公司,美国,货号15338-100)将抗体转染至CHO-K1细胞。在转染前一天,采用含有10%dFBS(渗析胎牛血清,Gibco,货号26400)的MEMα培养基,将培养在SFM4CHO培养基(Hyclone,货号SH30549.02)中的CHO-K1细胞按每孔0.5×106个细胞的密度接种于6孔板。在转染当日,取2.5ug的抗体DNA和2.5ul的PLUS试剂混合于500ul的OptiPROSFMII(英杰公司,美国,12309)中,5分钟后,加入6.25ul的LipofectamineLTX试剂,然后室温下孵育5分钟。在室温下孵育的30分钟内,将接种的CHO-K1细胞培养基换成MEMα培养基。孵育30分钟后,采用含有抗体DNA和LipofectamineLTX试剂的混合溶液处理并转染CHO-K1细胞。在转染后4小时,将培养基替换成含10%dFBS的MEMα培养基,然后再孵育3天。在转染后第3天,采用含有甲氨蝶呤(MTX)的SFM4CHO培养基,将细胞按1000个细胞的密度接种于96孔板中。然后,逐步增加甲氨蝶呤的浓度以诱发基因扩增,从而选出高产抗体的前克隆子。将所选出的克隆子进行有限稀释克隆,从而获得单个细胞来源的克隆。
实施例7:检测来源于慢性乙肝患者的多种病毒基因型的表面抗原的结合亲和力
为了测试抗体No.4和40是否真的能通过对全世界流行的病毒的多种基因型的结合力而表现出中和活性,采用了来自患者血清病毒多种基因型构成的世界卫生组织(WHO)参考谱系(panel)(用于HBsAg测定的乙肝基因型第一WHO国际参考谱系(panel),PEI码6100/09)进行夹心ELISA。参考谱系的具体信息如表5所示,并按以下方式进行测试。
将两种抗体各吸附至包覆有抗-人IgGFcγ(gamma)抗体(Jackson免疫研究(ImmunoResearch),美国,109-006-098)的96孔微滴定板上。洗涤后,由含3%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲盐水(Teknova,美国,D5120)处理并封闭滴定板。再次洗涤后,取HBsAg基因型谱系的15份血清样本各接种到滴定板上并在37℃下孵育90分钟。在此,各份血清样本经含1%BSA的磷酸缓冲盐水(Teknova,美国,D5120)适当稀释,使其在450/620nm下具有0.8-1.2的吸光度。为了检测HBsAg与抗体的反应,将滴定板置于37℃下,用过氧化物酶标记的家兔抗-HBV表面抗原抗体(赛默飞世尔(ThermoScientific),美国PA1-73087)处理60分钟。采用如实施例3和4所述的相同方法,进行显色、终止孵育以及吸光度测定。采用Excel(微软,美国)对两种抗体与各基因型HBV表面抗原的反应性进行了图表分析(图8)。
该分析结果显示,4号和40号抗体较易结合于15份HBsAg样品。如上所述,表面抗原样本由真实患者血液制备而得的血清,其在HBV的总共8种基因型里涵盖了除基因型G以外的7种基因型(A至H)。此外,具有几种基因亚型的基因型A、B、C、D和F包括在各基因型中主导的2-3种基因亚型和亚型(血清型),提示该实验中所采用的WHOHBV基因型谱系(panel)基本代表了世界上流行的大多数HBV基因型。尽管基因型G未在该谱系中,但还未有基因型G的基因亚型报道,且基因型G被分类至adw2亚型(血清型)。因此,(根据)谱系中所包括的5种adw2样本的实验结果,可估计4号和40号抗体对基因型G的结合亲和力。
因此,4号和40号抗体对所有15份样品的高结合亲和力提示这两种抗体可结合于世界上流行的所有HBV基因型,并对所有的HBV基因型表现出中和活性。
表5:患者来源血清HBV表面抗原谱系的详细信息(用于HBsAg测定的HBV基因型
第一WHO国际参考谱系(panel),PEI码6100/09)
实施例8:对多种耐药病毒的结合亲和力测定
采用实施例8中所采用的夹心ELISA法,对4号和40号抗体与耐药(拉米夫定(LMV)、阿德福韦(ADV)、克拉夫定(CLV)和恩替卡韦(ETV),均为治疗慢性乙肝患者的HBV聚合酶抑制剂)突变株之间的结合亲和力进行了测定。所有在实验中用到的耐药突变病毒(包括野生型病毒)均由建国大学药学院药理学系采用从对药物治疗产生耐药性的患者血液中分离所得的HBVDNA克隆而成,而该耐药性则采用Huh7细胞系或HepG2细胞系(Ahn等,病毒学杂质(JournalofVirology),88(12):6805-6818,2014),通过转染实验进行经验性确认。所有病毒为基因型C病毒,各病毒特征如下表6所示。
采用脂质体转染试剂Lipofectamine2000(生命科技,11698019)将上述制备的各HBV表达载体转染到在T75烧瓶中生长的Huh7细胞系(BD生物科技,353136),并对细胞培养3天以产生病毒。所培养的病毒采用Centricon(密理博(Millipore),美国)浓缩,并采用MonolisaHBsAgUltra(BR公司-BioRad,72346)ELISA试剂盒,基于HBsAg水平对样本的病毒水平进行比较。然后,将病毒进行适当稀释以具有相似值,并用于实验。
实验结果表明,4号和40号抗体对拉米夫定(LMV)、阿德福韦(ADV)、克拉夫定(CLV)和恩替卡韦(ETV)耐药的病毒和野生型病毒具有相同水平的结合亲和力(见图9)。图9可见,对ADV耐药的病毒亲和力稍低于对其它病毒的,但据信这是因为相应样本的产量低于其它样本。
该事实提示,4号和40号抗体不仅对实验中所用的各耐药病毒,且对于相应药物耐药的大多数病毒也具有结合亲和力和中和活性。这是因为导致HBV耐药的突变与HBV聚合酶的逆转录酶(RT)结构域中一个特定氨基酸突变相关,如图6所示,该突变对于各药物来说是特定的。由于共享同一基因的HBV特征,该聚合酶的特定突变导致了HBsAg特定的突变。例如,聚合酶的rtM204I突变导致HBsAg的W196L突变,而rtA181V突变导致HBsAg的L173F突变(见表6)。可见,无论耐药突变导致的表面抗原如何突变,4号和40号抗体抗体均能较易与其结合。
此外,除了上述耐药特异性的表面抗原突变,本实验所用的各耐药病毒可具有非特异性出现的许多表面抗原(见表6)。该实验的结果表明4号和40号抗体对在HBsAg第101(Q101R)、112(K112R)、126(I126S)、175(L175S)、184(A184V)或185(I185M)位有突变的病毒具有结合以及中和活性。
表6:实验中所采用的耐药病毒信息
Claims (33)
1.一种结合分子,其通过结合于一个或多个选自adw、adr、ayw和ayr的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)亚型而具有乙肝病毒中和活性。
2.如权利要求1所述的结合分子,其特征在于,所述结合分子具有与乙肝病毒基因型A、B、C、D、E、F、G和H结合以及中和的活性。
3.如权利要求2所述的结合分子,其特征在于,所述结合分子对拉米夫定、阿德福韦、克拉夫定或恩替卡韦耐药的乙肝病毒具有结合以及中和的活性。
4.如权利要求1-3任一所述的结合分子,其特征在于,所述结合分子通过与在HBsAg的第101、112、126、129、133、143、173、175、184、185或196位氨基酸具有突变的突变抗原结合,从而具有乙肝病毒中和活性。
5.如权利要求4所述的结合分子,其特征在于,所述突变抗原可以是Q101R、K112R、T126N、I126S、Q129H、M133H、P143K、L173F、L175S、A184V、I185M或W196L突变抗原,其中,
Q101R是一突变抗原,其中HBsAg的第101位由谷氨酰胺替换为精氨酸;
K112R是一突变抗原,其中HBsAg的第101位由赖氨酸替换为精氨酸;
T126N是一突变抗原,其中HBsAg的第126位由苏氨酸替换为天冬酰胺;
I126S是一突变抗原,其中HBsAg的第126位由异亮氨酸替换为丝氨酸;
Q129H是一突变抗原,其中HBsAg的第129位由谷氨酰胺替换为组氨酸;
M133H是一突变抗原,其中HBsAg的第133位由甲硫氨酸替换为组氨酸;
P143K是一突变抗原,其中HBsAg的第143位由脯氨酸替换为赖氨酸;
L173F是一突变抗原,其中HBsAg的第173位由亮氨酸替换为苯丙氨酸;
L175S是一突变抗原,其中HBsAg的第175位由亮氨酸替换为丝氨酸;
A184V是一突变抗原,其中HBsAg的第184位由丙氨酸替换为缬氨酸;
I185M是一突变抗原,其中HBsAg的第185位由异亮氨酸替换为甲硫氨酸;和
W196L是一突变抗原,其中HBsAg的第196位由色氨酸替换为亮氨酸。
6.如权利要求1-5任一所述的结合分子,其特征在于,所述结合分子含有包括选自下组任一种的多肽序列:
i)一序列,包括根据Kabat法测定的如SEQIDNO.:1所示的CDR1区、如SEQIDNO.:2所示的CDR2区和如SEQIDNO.:3所示的CDR3区;
ii)一序列,包括根据Kabat法测定的如SEQIDNO.:4所示的CDR1区、如SEQIDNO.:5所示的CDR1区和如SEQIDNO.:6所示的CDR3区;
iii)一序列,包括根据Kabat法测定的如SEQIDNO.:7所示的CDR1区、如SEQIDNO.:8所示的CDR2区和如SEQIDNO.:9所示的CDR3区;和
iv)一序列,包括根据Kabat法测定的如SEQIDNO.:10所示的CDR1区、如SEQIDNO.:11所示的CDR2区和如SEQIDNO.:12所示的CDR3区。
7.如权利要求6所述的结合分子,其特征在于,所示结合分子含有一多肽序列,其包括根据Kabat法测定的如SEQIDNO.:1所示的CDR1区、如SEQIDNO.:2所示的CDR2区和如SEQIDNO.:3所示的CDR3区;和
如SEQIDNO.:4所示的CDR1区、如SEQIDNO.:5所示的CDR1区和如SEQIDNO.:6所示的CDR3区。
8.如权利要求6所述的结合分子,其特征在于,所述结合分子含有一多肽序列,其包括根据Kabat法测定的如SEQIDNO.:7所示的CDR1区、如SEQIDNO.:8所示的CDR2区和如SEQIDNO.:9所示的CDR3区;和
如SEQIDNO.:10所示的CDR1区、如SEQIDNO.:11所示的CDR2区和如SEQIDNO.:12所示的CDR3区。
9.如权利要求1-5任一所述的结合分子,其特征在于,所述结合分子含有选自SEQIDNO.:13-16所示的任一多肽序列。
10.如权利要求9所述的结合分子,其特征在于,所述结合分子含有如SEQIDNO.:13所示的可变区以及如SEQIDNO.:14所示的可变区。
11.如权利要求9所述的结合分子,其特征在于,所述结合分子含有如SEQIDNO.:15所示的可变区和如SEQIDNO.:16所示的可变区。
12.如权利要求1-5任一所述的结合分子,其特征在于,所述结合分子含有选自SEQIDNO.:17-20所示的任一多肽序列。
13.如权利要求12所述的结合分子,其特征在于,所述结合分子含有如SEQIDNO.:17所示的轻链和如SEQIDNO.:18所示的重链。
14.如权利要求12所述的结合分子,其特征在于,所述结合分子含有如SEQIDNO.:19所示的轻链和如SEQIDNO.:20所示的重链。
15.如权利要求1-14任一所述的结合分子,其特征在于,所述结合分子是抗体或其片段。
16.如权利要求15所述的结合分子,其特征在于,抗体上还连接有药物。
17.如权利要求15所述的结合分子,其特征在于,所述抗体是Fab片段、Fv片段、双抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。
18.一种编码权利要求6-14任一所述结合分子的多核苷酸。
19.一种含有权利要求18所述多核苷酸的表达载体。
20.一种宿主细胞,其生产具有乙肝病毒中和活性的结合分子,所述宿主细胞包含转染于其中的权利要求19所述的表达载体。
21.如权利要求20所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞是选自下组的任一种:CHO细胞、F2N细胞、BHK细胞、SP2/0细胞、NS0细胞和HEK293细胞。
22.一种组合物,其含有权利要求1-17任一所述的结合分子。
23.如权利要求22所述的组合物,其特征在于,所述组合物用于预防或治疗乙肝。
24.如权利要求22所述的组合物,其特征在于,所述组合物用于乙肝诊断。
25.如权利要求22-24任一所述的组合物,其特征在于,所述组合物是无菌注射溶液、冻干制剂、预装注射器溶剂、口服制剂、外用制剂或栓剂。
26.一种治疗乙肝的方法,所述方法包括步骤:向感染乙肝病毒的对象施用治疗有效量的权利要求22所述组合物。
27.如权利要求26所述的方法,还包括施用抗病毒药物的步骤。
28.如权利要求27所述的方法,其特征在于,所述抗病毒药是干扰素、核苷/核苷酸类似物、抗HBV单克隆抗体、抗HBV多克隆抗体、DNA聚合酶抑制剂、siRNA试剂或治疗性疫苗。
29.如权利要求28所述的方法,其特征在于,所述核苷/核苷酸类似物是拉米夫定、恩替卡韦、克拉夫定或阿德福韦酯(adefovirdipivoxil)。
30.一种预防乙肝的方法,所述方法包括步骤:向一对象施用治疗有效量的权利要求22所述组合物。
31.一种诊断患者中乙肝病毒感染的方法,所述方法包括步骤:
i)将样本与权利要求22所述组合物接触;和
ii)检测所述组合物和所述样本之间的反应。
32.一种提供患者感染乙肝病毒诊断信息的方法,所述方法包括步骤:
i)将样本与权利要求22所述组合物接触;和
ii)检测所述组合物和所述样本之间的反应。
33.一种诊断乙肝病毒的试剂盒,包括:
i)权利要求22所述组合物;和
ii)一容器。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107648602A (zh) * | 2017-10-23 | 2018-02-02 | 苏州大学 | 二价乙肝疫苗及其制备方法 |
CN108624565A (zh) * | 2017-03-17 | 2018-10-09 | 艾博生物医药(杭州)有限公司 | 一种抗乙肝表面抗原的单抗隆抗体制备和筛选 |
CN108624564A (zh) * | 2017-03-17 | 2018-10-09 | 艾博生物医药(杭州)有限公司 | 抗乙肝表面抗原的单抗隆抗体的制备和筛选 |
WO2022025129A1 (ja) * | 2020-07-29 | 2022-02-03 | 日本赤十字社 | 新規な抗HBs免疫グロブリンの製造方法 |
CN116199774A (zh) * | 2023-01-05 | 2023-06-02 | 北京科跃中楷生物技术有限公司 | 一种针对乙型肝炎病毒表面抗原突变株的单克隆抗体 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107001429B (zh) * | 2014-11-28 | 2022-01-04 | 赛特瑞恩股份有限公司 | 乙型肝炎病毒表面抗原的表位及与其特异性结合以中和乙型肝炎病毒的结合分子 |
KR102084912B1 (ko) * | 2019-01-17 | 2020-03-05 | 주식회사 녹십자 | B형 간염 바이러스 표면 항원의 입체 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체 |
CN116804053B (zh) * | 2023-08-02 | 2024-01-26 | 南方医科大学南方医院 | 一种抗HBcAg单克隆抗体及其应用 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5204096A (en) * | 1984-03-07 | 1993-04-20 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
KR19990077887A (ko) * | 1998-03-17 | 1999-10-25 | 이데이 노부유끼 | 정보처리장치 및 방법, 디지털신호복조장치 및 방법과 제공매체 |
US20030165816A1 (en) * | 2000-03-31 | 2003-09-04 | Jian Zheng | Novel hepatitis B virus |
US20040219154A1 (en) * | 2000-10-20 | 2004-11-04 | Colette Jolivet-Reynaud | Monoclonal antibodies directed against hepatitis b viruses |
CN1874787A (zh) * | 2003-08-29 | 2006-12-06 | 莱因新生物技术工艺和产品有限公司 | 预防/治疗hbv感染和hbv介导疾病的组合物 |
CN1896102A (zh) * | 2005-05-18 | 2007-01-17 | 希森美康株式会社 | 抗HBsAg单克隆抗体 |
CN102786592A (zh) * | 2011-05-17 | 2012-11-21 | 傅阳心 | Hbv特异性抗体 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ212546A (en) * | 1984-07-16 | 1988-09-29 | Abbott Lab | Immunoassay for detecting antibody to hepatitis b surface antigen/a |
EP0299242A3 (en) * | 1987-06-22 | 1989-01-25 | Medico Labs Ag | Heterologous viral peptide particle immunogens |
EP0533263A3 (en) * | 1991-09-20 | 1994-06-08 | Merck & Co Inc | A multivalent hepatitis b virus vaccine |
KR100246128B1 (ko) * | 1997-07-02 | 2000-03-15 | 박호군 | 비형 간염 바이러스의 표면항원 프리-에스1에 대한 생쥐 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 그의 제조방법 |
KR100246127B1 (ko) * | 1997-07-02 | 2000-03-15 | 박호군 | 비형 간염 바이러스의 표면항원 프리-에스1에 대한 생쥐 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 그의 제조방법 |
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Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5204096A (en) * | 1984-03-07 | 1993-04-20 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
KR19990077887A (ko) * | 1998-03-17 | 1999-10-25 | 이데이 노부유끼 | 정보처리장치 및 방법, 디지털신호복조장치 및 방법과 제공매체 |
US20030165816A1 (en) * | 2000-03-31 | 2003-09-04 | Jian Zheng | Novel hepatitis B virus |
US20040219154A1 (en) * | 2000-10-20 | 2004-11-04 | Colette Jolivet-Reynaud | Monoclonal antibodies directed against hepatitis b viruses |
CN1874787A (zh) * | 2003-08-29 | 2006-12-06 | 莱因新生物技术工艺和产品有限公司 | 预防/治疗hbv感染和hbv介导疾病的组合物 |
CN1896102A (zh) * | 2005-05-18 | 2007-01-17 | 希森美康株式会社 | 抗HBsAg单克隆抗体 |
CN102786592A (zh) * | 2011-05-17 | 2012-11-21 | 傅阳心 | Hbv特异性抗体 |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108624565A (zh) * | 2017-03-17 | 2018-10-09 | 艾博生物医药(杭州)有限公司 | 一种抗乙肝表面抗原的单抗隆抗体制备和筛选 |
CN108624564A (zh) * | 2017-03-17 | 2018-10-09 | 艾博生物医药(杭州)有限公司 | 抗乙肝表面抗原的单抗隆抗体的制备和筛选 |
CN107648602A (zh) * | 2017-10-23 | 2018-02-02 | 苏州大学 | 二价乙肝疫苗及其制备方法 |
CN107648602B (zh) * | 2017-10-23 | 2020-09-01 | 苏州大学 | 二价乙肝疫苗及其制备方法 |
WO2022025129A1 (ja) * | 2020-07-29 | 2022-02-03 | 日本赤十字社 | 新規な抗HBs免疫グロブリンの製造方法 |
CN116199774A (zh) * | 2023-01-05 | 2023-06-02 | 北京科跃中楷生物技术有限公司 | 一种针对乙型肝炎病毒表面抗原突变株的单克隆抗体 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105263522B (zh) | 2019-03-22 |
WO2014193122A1 (ko) | 2014-12-04 |
KR20140141460A (ko) | 2014-12-10 |
KR101646830B1 (ko) | 2016-08-08 |
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