CN107648305B - 一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有α‑葡萄糖苷酶抑制作用的提取物的制备方法，属于天然产物提取分离技术领域，包括以下步骤：1)将银杏叶与葛根混合物加乙醇提取浓缩；2)浓缩液加盐酸，加热沸腾水解4～5小时，热过滤，滤液冷却至50℃以下上D201大孔吸附树脂，收集、浓缩洗脱液；3)浓缩液用冰醋酸调pH值至4～5，加活性炭搅拌，静置24小时，过滤，弃去滤液，滤渣加甲醇热溶解，热过滤，去除活性炭，溶解液浓缩干燥即得。本发明分离时间短，分离量大，收率高，分离得到的提取物中银杏总黄酮、葛根素含量分别可达到13％、37％，具有显著的抑制α‑葡萄糖苷酶作用；且占地面积小，成本低，环境友好，适合工业化生产。

Description

一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的提取物的制备方法

技术领域

本发明属于天然产物提取分离技术领域，具体涉及一种从银杏叶、葛根混合物中分离提取具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的提取物的方法。

背景技术

银杏叶为银杏科植物银杏(Ginkgo biloba L.)的干燥叶，2015版药典一部收载。本药材具有活血化瘀、通络止痛作用，用于瘀血阻络、胸痹心痛、中风偏瘫、高血脂症等。

葛根为豆科植物野葛根(Pueraria lobata(Willd.)Ohwi)的干燥根。2015版药典一部收载。本药材具有生津止渴、升阳止泻作用，用于外感发热头痛、中风偏瘫等。

目前，银杏叶、葛根混提纯化主要用于半身不遂，以及脑血栓形成、动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞等症。

从中药材中分离具有抑制α-葡萄糖苷酶作用的提取物，用于糖尿病患者餐后血糖的控制，成为研究者关注的焦点。但目前，尚未见到银杏叶、葛根提取物具有显著糖苷酶抑制作用的文献，针对银杏叶、葛根单独或混合提取物的实验发现相应抑制作用不明显，抑制率小于10％，并且，提取物收率较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的提取物的制备方法，该方法操作简单、分离时间短、成本低，得到的产物抑制作用明显、收率高。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

1)将银杏叶与葛根的组合物料采用醇提法进行提取得提取液，组合物料中银杏叶:葛根的质量比为4～6:1(优选6:1)，将提取液浓缩，得提取浓缩液；

2)向提取浓缩液中加入浓盐酸后加热沸腾4～5h(即水解)，然后热过滤，待滤液冷却至50℃以下后依次进行柱层析和浓缩(本步浓缩目的：将洗脱液中的乙醇回收出来，使浓缩液成为水的浓缩液，无醇味。减压浓缩温度60～65℃，真空度0.09kPa)，得洗脱浓缩液，所述柱层析采用大孔吸附树脂层析柱；

3)将洗脱浓缩液调节为酸性后加入活性炭，然后于70～80℃搅拌2小时(目的包括：除杂、脱色等)，然后于10～25℃环境下(例如，室温)静置≥10小时(静置目的：使功效成分在酸性条件下充分沉淀结晶，优选24小时)；然后(10～25℃环境下)过滤，弃去滤液，滤渣加入甲醇后加热至70～80℃(使沉淀物或者结晶物充分溶解)，热过滤(70～80℃)，去除滤渣(主要为活性炭)，滤液冷却至室温后减压干燥(减压干燥温度35～40℃，真空度0.09kPa)，得淡黄色结晶体(即目标提取物)。

优选的，所述步骤1)具体包括以下步骤：将粉碎后的银杏叶与葛根按照所述质量比一并加入至80％乙醇中浸泡12h，然后加热回流(沸腾状态)3次，每次2～3h，且每次80％乙醇用量(以毫升计)为加入的银杏叶与葛根用量(以克计)的10倍，合并提取液；将提取液减压浓缩至婆美度为20～23(通过浓缩，不仅回收乙醇，而且浓缩多余的水减少体积，有利于下一步水解，浓缩在旋转蒸发仪中完成，减压浓缩温度60～65℃，真空度0.09kPa)。

优选的，所述步骤1)中，银杏叶和葛根粉碎至粗粉(依照药典要求和规定)。

优选的，所述步骤2)中，层析柱的填料为D201大孔吸附树脂(乳白色或浅黄色不透明球状颗粒；粒径规模：0.3～1.25mm≥90％(60～16目)；含水量：65～75％；比表面积：≥150m²/g；对比吸附量：≥45mg/g(酚/干基)；堆积密度：0.65～0.7g/mL(湿态))，层析柱中大孔吸附树脂装填量按照提取浓缩液(mL):树脂(g)为1:3～4计算；将滤液于层析柱上样后用去离子水冲洗层析柱至底部流出液pH为4～5；然后用30％乙醇冲洗层析柱(低浓度乙醇洗脱杂质，如果不用30％乙醇除杂，那么直接用高纯度乙醇洗脱出来的提取物进行糖苷酶抑制实验，效果很低，只有30％醇除杂后抑制作用才明显)，然后用90％乙醇进行洗脱，收集(洗脱速率为5～20mL/min，洗脱时收集色带部分)洗脱液；将洗脱液减压浓缩(在旋转蒸发仪中完成浓缩，减压浓缩温度60～65℃，真空度0.09kPa，乙醇回收后继续浓缩，温度升至70℃以上)至婆美度为10～11。

所述步骤2)中，D201大孔吸附树脂使用前需进行酸碱处理，树脂用95％的乙醇浸泡12小时，8～10BV/h洗脱(将柱内乙醇排放所引起的洗脱)，然后用蒸馏水洗至无醇味，以除去树脂中醇溶性杂质，树脂层面上保持适量液体以免干柱；用质量分数3％HCl溶液以1～2BV/h淋洗树脂2～3h，用蒸馏水洗至中性，以除去树脂中的酸溶性杂质；用质量分数3％NaOH溶液以1～2BV/h淋洗树脂2～3h，用蒸馏水洗至中性，以除去树脂中的碱溶性杂质，备用。

优选的，所述步骤2)中，浓盐酸质量分数为35～37％，热过滤温度不低于60℃，浓盐酸和提取浓缩液的体积比为1～2:4～10(优选为2:7)。

优选的，所述步骤3)中，采用冰醋酸调节洗脱浓缩液的pH值至4～5；调节pH值时洗脱浓缩液温度为70℃～80℃。

优选的，所述步骤3)中，活性炭使用量为每300mL洗脱浓缩液加入40～80g活性炭。(优选50g)

优选的，所述步骤3)中，甲醇与滤渣的比例为10:1(mL:g，多加甲醇，以使功效成分最大限度的溶解)。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明将银杏叶和葛根按照一定比例共同进行醇提酸解以及纯化(柱层析等)除杂，所得提取物具有α-葡萄糖苷酶抑制作用，可用于降糖和血糖的控制。且本发明采用的提取物分离过程简单快捷，不仅最大限度的精制出具有降糖作用的黄酮提取物，而且分离时间短、分离量大，收率达到2％以上，得到的提取物中银杏总黄酮、葛根素含量比例约为1:3，分别可达到13％、37％。

同时，本发明产生的废料少、收率高，所需的洗脱液体积小、占地面积小，降低了整个制备工艺的消耗成本，大孔吸附树脂及溶剂可回收利用，环境友好，适合工业化生产。

进一步的，酸解(浓盐酸水解)过程目的是将4’-葡萄糖葛根素、6’-木糖葛根素、3-甲氧葛根素等水解为葛根素，增加葛根素的收率，同时将银杏总黄酮水解成为槲皮素、山奈素、异鼠李素，是一个协同的过程，通过此步骤提取物中成分配比发生了变化，抑制率明显提高。

进一步的，酸性条件下进行活性炭的吸附，是保证葛根素等不转化为异黄酮，甲醇热溶解是防止葛根素在常温下析出晶体，从而提高了分离效果和活性。

附图说明

图1为本发明分离得到的提取物中银杏总黄酮各成分的HPLC色谱图；其中，峰1：槲皮素、峰3：山奈素、峰4：异鼠李素。

图2为本发明分离得到的提取物中葛根素的HPLC色谱图；其中，峰2：葛根素。

图3为本发明分离所得提取物的α-葡萄糖苷酶抑制曲线图；其中，实心块标注为阿卡波糖抑制曲线，空心块标注为本发明中提取物的抑制曲线。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

(一)本发明所用的试剂及实验仪器

1、试剂：乙醇、浓盐酸、冰醋酸、甲醇均为分析纯，水为二次重蒸水(去离子水)；

其中，乙醇具体包括90％乙醇、80％乙醇、30％乙醇，就是指质量分数90％、80％、30％的乙醇水溶液。

2、实验仪器：本发明浓缩采用了进口旋转蒸发仪，产品分析使用的高效液相色谱仪为美国(Waters)生产。其他为辅助设备。

(二)具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的提取物的制备工艺

实施例1

1)将银杏叶与葛根粉碎至粗粉，取粉碎后的银杏叶300g及葛根50g于5000mL圆底烧瓶中，加80％乙醇3500mL，浸泡12小时，加热回流三次，每次3小时，合并提取液，共计8400mL，减压回收乙醇，浓缩至婆美度为23；浓缩液体积为200mL。

2)200mL浓缩液中加入浓盐酸57mL水解，加热沸腾5小时，加热完毕后直接热过滤(75℃)，滤液冷却至50℃上D201大孔吸附树脂(树脂重800g)；用去离子水冲柱至底部流出液pH为5；用200mL 30％乙醇洗柱，洗脱液弃去，再用90％乙醇洗脱，收集洗脱液；洗脱液浓缩(80℃)至婆美度为11；浓缩液体积为120mL。

3)将120mL浓缩液(80℃)用冰醋酸调pH值至5，加活性炭20g搅拌2小时，室温静置24小时，过滤，弃去滤液，滤渣加甲醇热溶解(80℃)，热过滤(80℃)，去除活性炭，溶解液(滤液)冷浓缩，浓缩液干燥即得7.2g提取物。参见图1、图2，银杏总黄酮、葛根素含量分别达到13％、37％。

实施例2

1)将银杏叶与葛根粉碎至粗粉，取粉碎后的银杏叶300g及葛根50g于5000mL圆底烧瓶中，加80％乙醇3500mL，浸泡12小时，加热回流三次，每次2.5小时，合并提取液，共计8500mL，减压回收乙醇，浓缩至婆美度为22；浓缩液体积为220mL。

2)220mL浓缩液中加入浓盐酸60mL水解，加热沸腾5小时，加热完毕后直接热过滤(75℃)，滤液冷却至45℃上D201大孔吸附树脂(树脂重800g)；用去离子水冲柱至底部流出液pH为4.5；用220mL 30％乙醇洗柱，洗脱液弃去，再用90％乙醇洗脱，收集洗脱液；洗脱液浓缩(75℃)至波美度为10；浓缩液体积为150mL。

3)将150mL浓缩液(75℃)用冰醋酸调pH值至4.5，加活性炭25g搅拌2小时，室温静置24小时，过滤，弃去滤液，滤渣加甲醇热溶解(75℃)，热过滤(75℃)，去除活性炭，溶解液(滤液)冷浓缩，浓缩液干燥即得6.9g提取物。银杏总黄酮、葛根素含量分别达到12％、35％。

实施例3

1)将银杏叶与葛根粉碎至粗粉，取粉碎后的银杏叶300g及葛根50g于5000mL圆底烧瓶中，加80％乙醇3500mL，浸泡12小时，加热回流三次，每次2小时，合并提取液，共计8700mL，减压回收乙醇，浓缩至婆美度为20；浓缩液体积为240mL。

2)240mL浓缩液中加入浓盐酸69mL水解，加热沸腾5小时，加热完毕后直接热过滤(75℃)，滤液冷却至45℃上D201大孔吸附树脂(树脂重800g)；用去离子水冲柱至底部流出液pH为4；用240mL 30％乙醇洗柱，洗脱液弃去，再用90％乙醇洗脱，收集洗脱液；洗脱液浓缩(70℃)至婆美度为10；浓缩液体积为160mL。

3)将160mL浓缩液(70℃)用冰醋酸调pH值至4，加活性炭约27g搅拌2小时，室温静置24小时，过滤，弃去滤液，滤渣加甲醇热溶解(70℃)，热过滤(70℃)，去除活性炭，溶解液(滤液)冷浓缩，浓缩液干燥即得6.8g提取物。银杏总黄酮、葛根素含量分别达到12.3％、35.7％。

综上，本发明通过醇提、酸解(酸化)、柱层析等过程完成分离，过程简单快捷，有效保证了抑制α-葡萄糖苷酶成分不会损失，分离过程用时短，分离量大，收率能够达到2％以上，且分离得到的提取物中银杏总黄酮、葛根素含量分别达到12％～13％、35％～37％(比例约为1:3)。本方法运行成本低，大孔吸附树脂可以长期重复循环使用，溶剂可回收重复使用，分离时间短，适合工业化生产。

本发明分离纯化得到的提取物具有显著的抑制α-葡萄糖苷酶作用(图3)，抑制率达到80％以上。不仅可以用于降糖，而且该提取物作为一种从银杏叶及葛根中提取的总黄酮，可竞争性地抑制α-葡萄糖苷酶活性，阻断碳水化合物分解成单个葡萄糖，抑制餐后的高血糖，可用于糖尿病患者餐后血糖的控制。

Claims (5)

1.一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将银杏叶与葛根的组合物料采用80％乙醇提取得提取液，组合物料中银杏叶:葛根的质量比为4～6:1，将提取液减压浓缩，得提取浓缩液，通过浓缩回收乙醇；

2)向提取浓缩液中加入浓盐酸后加热沸腾4～5h，然后热过滤，待滤液冷却至50℃以下后依次进行柱层析和浓缩，得洗脱浓缩液，所述柱层析采用大孔吸附树脂层析柱；

3)将洗脱浓缩液调节为酸性后加入活性炭，然后于70～80℃搅拌2小时，然后于10～25℃环境下静置≥10小时；然后过滤，弃去滤液，滤渣加入甲醇后加热至70～80℃，然后热过滤，去除滤渣，滤液冷却后减压干燥；

所述步骤3)中，采用冰醋酸调节洗脱浓缩液的pH值至4～5；调节pH值时洗脱浓缩液温度为70～80℃；

所述步骤3)中，活性炭使用量为每300mL洗脱浓缩液加入40～80g活性炭。

2.根据权利要求1所述一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤1)具体包括以下步骤：将粉碎后的银杏叶与葛根按照所述质量比一并加入至80％乙醇中浸泡12h，然后加热回流，得提取液；将提取液减压浓缩至婆美度为20～23，得提取浓缩液。

3.根据权利要求2所述一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，银杏叶和葛根粉碎至粗粉。

4.根据权利要求1所述一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，层析柱的填料选自粒径规模：0.3～1.25mm≥90％、含水量：65～75％、比表面积：≥150m²/g、对比吸附量：≥45mg/g、堆积密度：0.65～0.7g/mL的大孔吸附树脂；将滤液于层析柱上样后用去离子水冲洗层析柱至底部流出液pH为4～5；然后用30％乙醇冲洗层析柱，然后用90％乙醇进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液减压浓缩至婆美度为10～11，得洗脱浓缩液。

5.根据权利要求1所述一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，浓盐酸质量分数为35～37％，热过滤温度不低于60℃，浓盐酸和提取浓缩液的体积比为1～2:4～10。

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