CN107621397B - 一种应拉木胶质层显微切片的染色方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种应拉木胶质层显微切片的染色方法，包括以下步骤：(1)将阔叶树材倾斜或弯曲的树干或树枝锯成圆盘，确定应拉木区域；(2)在所述步骤(1)确定后的应拉木区域选取木样，经水煮排气、软化后，切取横切面切片置于蒸馏水中洗涤；(3)将步骤(2)洗涤后的切片立即用番红‑星蓝乙醇染液或番红‑星蓝乙酸染液双重染色进行，染色过程中用梯度乙醇溶液进行脱水，得到脱水染色后的应拉木胶质层显微切片。该染色方法使用番红‑星蓝染液对应拉木进行染色，可清晰地将应拉木胶质层与相邻壁层区分开来，便于观察胶质层的微观结构，更有利于对图像按照饱和度和灰值进行处理和分析，为研究应拉木提供更多可行性。

Description

一种应拉木胶质层显微切片的染色方法

技术领域

本发明属于应拉木研究领域，尤其涉及一种应拉木胶质层显微切片的染色方法。

背景技术

由于受到风力、雨雪、斜坡等环境因素的影响，树木原本笔直的生长形态常常发生改变，产生倾斜生长。为了适应这种改变，阔叶材形成层往往分化应拉木以使树干或树枝保持其最佳的姿态。由于应拉木形成时产生的高拉伸应力，木材常产生开裂、翘曲等缺陷，对其加工和高效利用带来极大的不便。应拉木已成为阔叶材中一种较为普遍的构造，也成为当前的研究热点。

应拉木的解剖结构明显不同于正常木材，其纤维细胞壁除已木质化的三壁层外，次生壁内侧往往还具凝胶状的胶质层。胶质层外形类似于凝胶类物质，且高度折光，若用传统的单一染液染色方法，于光学显微镜下观察时，难与相邻壁层区别开，不能清晰的观察到胶质层的解剖特征。目前，国内外已有使用番红-固绿对染方法对应拉木切片进行染色的报道；番红可将具有木质素成分的细胞壁染成红色，而固绿又称快绿溶液，为酸性染料，能将细胞质、纤维素细胞壁染成鲜艳绿色，着色很快，还可将不具木素和具有木素的细胞壁都染成绿色，因此，具有木质素成分的细胞壁呈现出红色并伴随有不同程度的绿色，胶质层不含木质素，基本为纤维素细胞壁层，从而呈现出绿色。但在实际操作过程中，由于固绿均可对胶质层和相邻壁层着色，且着色很快，具体着色时间不好把握，且针对不同样品其着色时间不一，因此在实际操作中需要进行多次预实验进行确定，若固绿染色时间控制不当，胶质层与相邻壁层均呈现绿色，难以得到理想的观察效果。

胶质层作为应拉木的特有的细胞壁层，与应拉木异常的材性有直接关系。因此，研究胶质层的微观结构对探索应拉木高生长应力的产生，解决应拉木加工利用出现的问题具有重要理论意义，但目前，用于应拉木胶质层显微观察染色技术，染色效果不够理想，不能直观的将胶质层和其他壁层区分开，而星蓝染液用于应拉木染色的方法目前仍未被提及。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种能较好地将胶质层与其他壁层区分，获得理想的染色效果的应拉木胶质层显微切片的染色方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为提供一种应拉木胶质层显微切片的染色方法，包括以下步骤：

(1)将阔叶树材倾斜或弯曲的树干或树枝锯成圆盘，确定应拉木区域；

(2)在所述步骤(1)确定后的应拉木区域选取木样，经水煮排气、软化后，切取横切面切片置于蒸馏水中洗涤；

(3)将步骤(2)洗涤后的切片立即用梯度乙醇溶液脱水、番红-星蓝乙醇染液或番红-星蓝乙酸染液双重染色，得到脱水染色后的应拉木胶质层显微切片。

星蓝(可购自爱必信(上海)生物科技有限公司)分子式为C₄₇H₅₂CuN₁₄O₆S₃，粉末状颜色为淡绿色，溶入水中呈现绿色，是一种酸性染料，对纤维素有较强的亲和力，能够产生出Cu²⁺，属于偶氮类，发色基团为偶氮基(-N＝N-)，目前主要用于纺织纤维染色，本发明为本领域首次用星蓝染色对植物细胞进行染色。本发明使用番红-星蓝染液对应拉木进行染色，可将非木质化部分如胶质层染成蓝色，胶质层的相邻壁层染成红色，可清晰地将应拉木胶质层与相邻壁层区分开来，获得理想的染色效果，便于观察胶质层的微观结构，更有利于对图像按照饱和度和灰值进行处理和分析，为研究应拉木提供更多可行性，而且实际操作起来方便，针对不同样品其染色时间相对固定，着色时间相对于固绿更容易把握，有利于提高染色成功率和效率。

上述的染色方法，优选的，所述步骤(1)中，圆盘的厚度为20-30mm。

优选的，所述步骤(1)中，确定应拉木区域采用观察法或氯锌碘溶液法。

优选的，所述观察法为将所述圆盘的端面砂光后进行肉眼或用10倍放大镜进行观察，在年轮偏宽和起毛一侧区域即为所述应拉木区域。

优选的，所述氯锌碘溶液法为将所述圆盘的端面砂光后用氯锌碘溶液进行涂刷观察并显色反应，呈现深褐色的区域即为所述应拉木区域，呈现浅黄色的区域则为正常木区域。

优选的，所述氯锌碘溶液的制备方法包括如下步骤：将75-85质量份的氯化锌和34-45质量份的水配制成I液，将8-9质量份的碘化钾、0.3-0.5质量份的碘和15-25质量份的水配制成II液，然后将所述I液和II液混合即得到所述的氯锌碘溶液。

优选的，所述步骤(2)中，水煮排气的时间为3-5h；软化采用水煮法、酒精甘油体积比1∶1混合液浸泡法或酒精甘油体积比1∶1混合液回流煮沸法，软化时间为24-72h；切取横切面切片采用滑走式切片机或瑞士便捷切片机，所述切片厚度为10-20um。

软化时，密度较小的木材可采用水煮法、酒精和甘油1∶1混合液浸泡法，密度较大的木材可采用酒精和甘油混合液1∶1回流煮沸法。其中，密度0.4以下的木材可直接水煮，木材细胞壁因润湿而软化，水煮软化法需将木材用水煮几次至试件下沉为止；密度0.4-0.75的木材需要煮沸软化后立即趁热切片，因热可更进一步软化木材。酒精甘油体积比1∶1混合液回流煮沸法，是将已排除空气的木材放入装有酒精甘油混合液的三角烧瓶中，瓶口用木栓塞盖好，栓塞中央插入一回流冷凝管，以石棉粉密封交接处，使瓶内混合液不至溢出，同时分别在冷凝管的进水口和排水口套入橡胶管，通至水源和排水处，使管内保持冷水流动，防止加热过程中混合液的挥发，在电炉与三角烧瓶之间，当没有调温设备情况下，用铁盆盛细砂以便控制煮沸后的温度升高或降低。

优选的，所述步骤(3)中，用于脱水的梯度乙醇溶液体积浓度为30-100％。

优选的，所述步骤(3)中，所述步骤(3)中，番红-星蓝乙醇染液采用的番红染液质量浓度为1-2％，番红染液的溶剂为体积浓度50％的乙醇溶液，采用的星蓝染液质量浓度为1％，星蓝染液的溶剂为无水乙醇；番红-星蓝乙酸染液采用的番红染液质量浓度为1-2％，番红染液的溶剂为体积浓度50％的乙醇溶液，采用的星蓝染液质量浓度为1％，星蓝染液的溶剂为体积浓度3％的乙酸溶液。

以乙醇为溶剂的星蓝染液和以乙酸为溶剂的星蓝染液均可达到不同细胞壁层的显微观察要求，各有特点，前者易配制且操作过程同常规步骤，后者因引入乙酸，对操作者的眼和鼻有一定刺激且染色步骤需调整，但是染色效果要稍优于前者。

优选的，将步骤(3)脱水染色后得到的切片放置于载玻片上，滴加加拿大树胶或中性快干胶，盖上盖玻片，制成永久切片，并于光学显微镜下观察。具体操作为将脱水染色后的切片放在载玻片上，然后滴一滴加拿大树胶或中性快干胶，用镊子持盖玻片从切片短边的一端朝长边方向徐徐放下，在其上用镊子头轻轻施压力，使树胶均匀散布，并令盖玻片与载玻片紧接封固切片，同时排除气泡。

本发明的染色方法在染色时不会破坏胶质层的微观结构，保证胶质层的完整性以及后续研究结果的可信度，而且整个染色过程避免使用传统切片常用的透明剂二甲苯，减小有毒实验试剂对人体造成的危害。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明的染色方法，使用番红-星蓝染液对应拉木进行染色，将非木质化部分如胶质层染成蓝色，胶质层的相邻壁层染成红色，可清晰地将应拉木胶质层与相邻壁层区分开来，便于观察胶质层的微观结构，更有利于对图像按照饱和度和灰值进行处理和分析，为研究应拉木提供更多可行性。

2、本发明的染色方法，染色时不会破坏胶质层的微观结构，保证胶质层的完整性以及后续研究结果的可信度，而且整个染色过程避免使用传统切片常用的透明剂二甲苯，减小有毒实验试剂对人体造成的危害。

3、本发明的染色方法，首次使用星蓝对应拉木进行染色，实际操作起来方便，针对不同样品其染色时间相对固定，着色时间相对于固绿更容易把握，有利于提高染色成功率和效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例1中经番红-星蓝乙醇对染后对应木横切显微图片。

图2是实施例1中经番红-星蓝乙醇对染后应拉木横切显微图片。

图3是实施例2中经番红-星蓝乙酸对染后对应木横切显微图片。

图4是实施例2中经番红-星蓝乙酸对染后应拉木横切显微图片。

图5是对比例1中经番红-固绿对染后对应木横切显微图片。

图6是对比例1中经番红-固绿对染后应拉木横切显微图片。

图7是对比例2中经番红染色后对应木横切显微图片。

图8是对比例2中经番红染色后应拉木横切显微图片。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种本发明的应拉木胶质层显微切片的染色方法，包括以下步骤：

(1)选取香樟倾斜树干木段，将木段锯成厚度为25mm的圆盘，并将圆盘端面砂光，然后将80g氯化锌、40g水配制成I液，将8.4g碘化钾、0.4g碘、20g水配制成II液，将I液和II液混合，避光放置，冷却至室温，将得到的氯锌碘溶液涂刷在香樟圆盘端面，呈现深褐色为应拉木区域，呈现浅黄色为正常木区域；

(2)在圆盘显示的应拉木区域中选取适量木材，制成尺寸为10×10×10mm的小木块，水煮3h煮至下沉，排除木块中的空气后，存放于酒精和甘油体积比1:1的混合液中浸泡24h进行软化，软化后的木块通过滑走式切片机切取厚度为10um的横切面切片，并将切取的切片置于蒸馏水中洗涤；

(3)经蒸馏水洗好的切片立即用梯度乙醇溶液进行脱水、番红-星蓝乙醇染液双重染色，番红染液质量浓度为2％，溶剂为体积浓度50％乙醇溶液，星蓝染液质量浓度为1％，溶剂为无水乙醇，所述梯度乙醇溶液进行脱水、番红/星蓝乙醇染液双重染色的具体流程为：30％乙醇溶液1min→50％乙醇溶液1min→番红染液24h→50％乙醇溶液5min→70％乙醇溶液5min→85％乙醇溶液5min→95％乙醇溶液5min→无水乙醇(体积浓度100％的乙醇溶液)5min→星蓝染液6min→无水乙醇5min→无水乙醇5min→无水乙醇5min(如表1所示)，得到脱水染色后的应拉木胶质层显微切片；

表1脱水、染色步骤(番红/星蓝乙醇染液)

(4)将步骤(3)得到的经脱水、染色的切片放置于载玻片上，滴加中性快干胶，用镊子持盖玻片从切片短边的一端朝长边方向徐徐放下，在其上用镊子头轻轻施压力，使树胶均匀散布，并令盖玻片与载玻片紧接封固切片，同时排除气泡，制成永久切片，于光学显微镜下观察，拍照。如图1和图2，分别为经番红-星蓝乙醇对染后对应木与应拉木横切显微图片，可以看出胶质层被染为蓝色，相邻壁层呈现红色。

实施例2：

一种本发明的应拉木胶质层显微切片的染色方法，包括以下步骤：

(1)选取香樟倾斜树干木段，将木段锯成厚度为30mm的圆盘，并将圆盘端面砂光，然后将80g氯化锌、40g水配制成I液，将8.4g碘化钾、0.4g碘、20g水配制成II液，将I液和II液混合，避光放置，冷却至室温，将得到的氯锌碘溶液涂刷在香樟圆盘端面，呈现深褐色为应拉木区域，呈现浅黄色为正常木区域；

(2)在圆盘显示的应拉木区域中选取适量木材，制成尺寸为10×10×10mm的小木块，水煮5h煮至下沉，排除木块中的空气后，存放于酒精和甘油体积比1:1的混合液中浸泡72h进行软化，软化后的木块通过滑走式切片机切取厚度为20um的横切面切片，并将切取的切片置于蒸馏水中洗涤；

(3)经蒸馏水洗好的切片立即用梯度乙醇溶液进行脱水、番红-星蓝乙酸染液双重染色，番红染液浓度为2％，溶剂为50％乙醇溶液，星蓝染液浓度为1％，溶剂为3％乙酸溶液，具体流程为：3％乙酸溶液5min→星蓝染液5min→蒸馏水1min→30％乙醇溶液1min→50％乙醇溶液1min→番红染液24h→50％乙醇溶液5min→70％乙醇溶液5min→85％乙醇溶液5min→95％乙醇溶液5min→无水乙醇5min→无水乙醇5min→无水乙醇5min(如表2所示)，得到脱水染色后的应拉木胶质层显微切片；

表2脱水、染色步骤(番红/星蓝乙酸染液)

(4)将步骤(3)得到的经脱水、染色的切片放置于载玻片上，滴加中性快干胶，用镊子持盖玻片从切片短边的一端朝长边方向徐徐放下，在其上用镊子头轻轻施压力，使树胶均匀散布，并令盖玻片与载玻片紧接封固切片，同时排除气泡，制成永久切片，于光学显微镜下观察，拍照。如图3和图4，分别为经番红-星蓝乙酸对染后对应木与应拉木横切显微图片，可以看出胶质层被染为蓝色，相邻壁层呈现红色。

与实施例1中使用番红-星蓝乙醇染液双重染色效果对比，实施例1使用番红-星蓝乙醇染液双重染色后，未木质化和木质化细胞壁分别被染成浅蓝色和红色，对比度不如实施例2。而实施例2中使用番红-星蓝乙酸染液双重染色的效果更优，未木质化细胞壁被染成深蓝色，木质化细胞壁被染成红色，对比度更鲜明。以乙醇为溶剂的星蓝染液和以乙酸为溶剂的星蓝染液均可达到不同细胞壁层的显微观察要求，各有特点，番红-星蓝乙醇染液易配制且操作过程同常规步骤，而番红-星蓝乙酸染液因引入乙酸，对操作者的眼和鼻有一定刺激且染色步骤需调整，但是染色效果要稍优于前者。

对比例1：

现有技术中应拉木胶质层显微切片的染色方法，包括以下步骤：

(1)选取香樟倾斜树干木段，将木段锯成厚度为20mm的圆盘，并将圆盘端面砂光，然后将80g氯化锌、40g水配制成I液，将8.4g碘化钾、0.4g碘、20g水配制成II液，将I液和II液混合，避光放置，冷却至室温，将得到的氯锌碘溶液涂刷在香樟圆盘端面，呈现深褐色为应拉木区域，呈现浅黄色为正常木区域；

(2)在圆盘显示的应拉木区域中选取适量木材，制成尺寸为10×10×10mm的小木块，水煮5h煮至下沉，排除木块中的空气后，存放于酒精和甘油体积比1:1的混合液中浸泡48h进行软化，软化后的木块通过滑走式切片机切取厚度为15um的横切面切片，并将切取的切片置于蒸馏水中洗涤；

(3)经蒸馏水洗好的切片立即用梯度乙醇溶液进行脱水、番红/固绿染液双重染色，番红染液浓度为2％，溶剂为50％乙醇溶液，固绿染液浓度为1％，溶剂为95％乙醇溶液，具体流程为：50％乙醇溶液5min→番红染液24h→50％乙醇溶液5min→70％乙醇溶液5min→85％乙醇溶液5min→95％乙醇溶液5min→固绿染液3min→95％乙醇溶液5min→无水乙醇5min→无水乙醇5min→无水乙醇5min，得到脱水染色后的应拉木胶质层显微切片；

(4)将步骤(3)得到的经脱水、染色的切片放置于载玻片上，滴加中性快干胶，盖上盖玻片，制成永久切片，于400倍光学显微镜下观察，拍照，如图5和图6，分别为经番红-固绿乙醇对染后对应木与应拉木横切显微图片，可以看出胶质层与相邻壁层均可被染为绿色，难以直观地区分开来。

对比例2：

现有技术中应拉木胶质层显微切片的染色方法，包括以下步骤：

(1)选取香樟倾斜树干木段，将木段锯成厚度为30mm的圆盘，并将圆盘端面砂光，然后将80g氯化锌、40g水配制成I液，将8.4g碘化钾、0.4g碘、20g水配制成II液，将I液和II液混合，避光放置，冷却至室温，将得到的氯锌碘溶液涂刷在香樟圆盘端面，呈现深褐色为应拉木区域，呈现浅黄色为正常木区域；

(2)在圆盘显示的应拉木区域中选取适量木材，制成尺寸为10×10×10mm的小木块，水煮5h煮至下沉，排除木块中的空气后，存放于酒精和甘油体积比1:1的混合液中浸泡72h进行软化，软化后的木块通过滑走式切片机切取厚度为20um的横切面切片，并将切取的切片置于蒸馏水中洗涤；

(3)经蒸馏水洗好的切片立即用梯度乙醇溶液进行脱水、番红染液染色，番红染液浓度为2％，溶剂为50％乙醇溶液，具体流程为：50％乙醇溶液5min→番红染液24h→50％乙醇溶液5min→70％乙醇溶液5min→85％乙醇溶液5min→95％乙醇溶液5min→无水乙醇5min→无水乙醇5min→无水乙醇5min，得到脱水染色后的应拉木胶质层显微切片；

(4)将步骤(3)得到的经脱水、染色的切片放置于载玻片上，滴加中性快干胶，盖上盖玻片，制成永久切片，于光学显微镜下观察，拍照，如图7和图8，分别为经番红染色后对应木与应拉木横切显微图片，可以看出胶质层与相邻壁层均可被染为红色，难以直观地区分开来。

Claims (7)

1.一种应拉木胶质层显微切片的染色方法，包括以下步骤：

（1）将阔叶树材倾斜或弯曲的树干或树枝锯成圆盘，确定应拉木区域；

（2）在所述步骤（1）确定后的应拉木区域选取木样，经水煮排气、软化后，切取横切面切片置于蒸馏水中洗涤；水煮排气的时间为3-5h；软化采用酒精甘油体积比1:1混合液浸泡法，软化时间为24-72h；切取横切面切片采用滑走式切片机或瑞士便捷切片机，所述切片厚度为10-20um；

（3）将步骤（2）洗涤后的切片立即用番红-星蓝乙酸染液进行双重染色，番红-星蓝乙酸染液采用的番红染液质量浓度为1-2%，番红染液的溶剂为体积浓度50%的乙醇溶液，采用的星蓝染液质量浓度为1%，星蓝染液的溶剂为体积浓度3%的乙酸溶液；染色过程中用体积浓度为30-100%的梯度乙醇溶液进行脱水，具体的染色、脱水步骤为：3%乙酸溶液5min，星蓝染液5min，蒸馏水1min，30%乙醇溶液1min，50%乙醇溶液1min，番红染液24h，50%乙醇溶液5min，70%乙醇溶液5min，85%乙醇溶液5min，95%乙醇溶液5min，无水乙醇5min，无水乙醇5min，无水乙醇5min；即得到脱水染色后的应拉木胶质层显微切片。

2.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，所述步骤（1）中，圆盘的厚度为20-30mm。

3.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于，所述步骤（1）中，确定应拉木区域采用观察法或氯锌碘溶液法。

4.根据权利要求3所述的染色方法，其特征在于，所述观察法为将所述圆盘的端面砂光后进行肉眼或用10倍放大镜进行观察，在年轮偏宽和起毛一侧区域即为所述应拉木区域。

5.根据权利要求3所述的染色方法，其特征在于，所述氯锌碘溶液法为将所述圆盘的端面砂光后用氯锌碘溶液进行涂刷观察并显色反应，呈现深褐色的区域即为所述应拉木区域，呈现浅黄色的区域则为正常木区域。

6.根据权利要求5所述的染色方法，其特征在于，所述氯锌碘溶液的制备方法包括如下步骤：将75-85质量份的氯化锌和34-45质量份的水配制成I液，将8-9质量份的碘化钾、0.3-0.5质量份的碘和15-25质量份的水配制成II液，然后将所述I液和II液混合即得到所述的氯锌碘溶液。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的染色方法，其特征在于，将步骤（3）脱水染色后得到的切片放置于载玻片上，滴加加拿大树胶或中性快干胶，盖上盖玻片，制成永久切片，并于光学显微镜下观察。

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