CN107616976A

CN107616976A - 一种雷替曲塞的药物组合物及其制备方法

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Publication number: CN107616976A
Application number: CN201710810406.XA
Authority: CN
Inventors: 蒋锡群; 武伟; 田舟山; 黄�俊; 吴晶; 柴雨柱; 王华萍; 徐丹; 朱春霞; 汪传军
Original assignee: Nanjing Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nanjing Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-09-11
Filing date: 2017-09-11
Publication date: 2018-01-23
Anticipated expiration: 2037-09-11
Also published as: CN107616976B

Abstract

本发明涉及一种安全性高的雷替曲塞药物组合物及其制备方法，所述药物组合物含有雷替曲塞以及含量不高于0.3％的噻吩类有关物质，其具有更好的安全性、有效性和稳定性，可以在一定程度上缓解雷替曲塞的血液毒性。

Description

一种雷替曲塞的药物组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于抗癌药物领域，具体的涉及一种药物组合物及其制备方法。

背景技术

结肠直肠癌在全世界是较常见肿瘤之一，在我国随着经济发展，人们的饮食结构发生变化，导致结肠直肠癌的发病率在逐年增长。

雷替曲塞，是由英国的Royal Marsden医院的癌症研究署与Zeneca共同合作发展的药物。它是一种胸腺合成酶抑制剂，属于叶酸的衍生物，用于治疗晚期直肠结肠癌患者。1996年在英国首次上市，商品名Tomudex，同年在法国等国家上市。其作为晚期结直肠癌的一线治疗药物，具有给药方便、价格便宜等优点，在中国的需求量大，其具体结构如下：

其与5-氟尿嘧啶相比，由于特异的选择性，毒副作用明显降低，但是其还是存在一定的毒性。根据相关临床试验的结果显示，其主要毒性不良反应包括对胃肠道、血液系统及肝酶的可逆性影响。

其中，对于血液系统主要有关的不良反应为白细胞减少(特别是中性粒细胞减少)、贫血和血小板减少(发生率分别为22％、18％和5％)，可单独发生或同时发生，这些反应通常为轻到中度(WHO1/2)，于用药后第1或2周内发生，第3周前恢复。也有可能发生重度(WHO3/4级)白细胞减少(特别是中性粒细胞减少)和WHO4级的血小板减少，可能会危及生命或致命，尤其与胃肠道毒性反应同时发生时。

目前当出现严重的不良反应时，临床上常用的策略为减少雷替曲塞的用量或者暂停药品的使用，并无相关如何降低雷替曲塞毒副作用的报道。因此，深入研究雷替曲塞发生不良反应的原因，提高雷替曲塞的用药安全性和有效性，更好地发挥其临床疗效，降低其不良反应或副反应，具有一定的实践意义。

发明内容

为了降低雷替曲塞的血液系统毒副作用，在经过大量的研究后发现，通过控制雷替曲塞成品中噻吩类有关物质的含量，可以有效的降低雷替曲塞的血液系统的毒副作用，相关噻吩类有关物质结构如下：

本发明的目的在于提供一种血液系统毒副作用低的雷替曲塞的药物组合物，其中有关物质A的含量低于0.3％，优选低于0.2％，更优选的低于0.1％。

进一步有关物质B的含量低于0.3％，优选低于0.2％，更优选的低于0.1％。

进一步有关物质C的含量低于0.3％，优选低于0.2％，更优选的低于0.1％。

进一步的雷替曲塞在组合物中含量不低于98％，优选不低于99％，更优选的不低于99.5％。

进一步的所述药物组合物含有含量不低于99.5％的雷替曲塞，以及含量低于0.1％的有关物质A、B、C。

进一步本发明还提供一种上述含量不低于99.5％的雷替曲塞，以及含量低于0.1％的有关物质A、B、C的雷替曲塞组合物的制备方法，详细制备方法如下：

具体包括如下步骤：

1)5-硝基-2-噻吩甲酸，经乙醇酯化，HCl气体作催化剂，得到5-硝基-2-噻吩甲酸乙酯；

2)5-硝基-2-噻吩甲酸乙酯经Pd/C/NH₄COOH在甲醇中还原得到5-氨基-2-噻吩甲酸乙酯；

3)5-氨基-2-噻吩甲酸乙酯与原甲酸三甲酯生成席夫碱后，再经硼氢化钠还原得到5-甲胺基-2-噻吩甲酸乙酯；

4)5-甲胺基-2-噻吩甲酸乙酯在氢氧化钠作用下水解得到5-甲胺基-2-噻吩甲酸；

5)5-甲胺基-2-噻吩甲酸经SOCl₂氯代后，与L-谷氨酸二乙酯发生酰胺化反应得到N-(5-甲胺基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯；

6)N-(5-甲胺基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯与6-溴甲基-3，4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮发生缩合反应得到N-[[5-[N-(3，4-二氢-2-甲基-4-氧代-6-喹唑啉基) -甲基]-N-甲基]氨基-2-噻吩甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯；

7)N-[[5-[N-(3，4-二氢-2-甲基-4-氧代-6-喹唑啉基)-甲基]-N-甲基]氨基-2-噻吩甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯在氢氧化钠的作用下，水解得到雷替曲塞。

本发明所述的有关物质是指除雷替曲塞以外的相关有关物质，包括但不限于有关物质A、B、C。

除非另有说明，本发明所述的百分含量均为质量百分含量。

本发明的另一目的在于提供本发明所述的药物组合物用于制备治疗癌症药物中的应用，其中优选结直肠癌。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1)公开雷替曲塞的噻吩类有关物质，并对其活性进行了研究，其毒性以及对造血系统的影响远远大于雷替曲塞；

2)公开了雷替曲塞的制备方法，按照上述制备方法能制备出含量不低于99.5％的雷替曲塞，以及含量低于0.1％的有关物质A、B、C的雷替曲塞组合物。

3)本发明通过深入研究发现，当将噻吩类有关物质含量控制在0.2％及其以下时，可以有效的减少严重性血液系统副作用的发生。

说明书附图

图1实施例4制备的雷替曲塞的HPLC图谱。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1 有关物质A的制备

①5-硝基-2-噻吩甲酰氯的制备

在50ml三颈瓶中加入10g 5-硝基-2-噻吩甲酸及29.1ml氯化亚砜，升温回流反应3～4小时，TLC监测反应至终点(正己烷:乙酸乙酯＝1:1)。将反应液转移至100ml单口瓶中减压浓缩至无液滴，不经纯化直接用于下一步，收率按100％计。

②N-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯的制备

在250ml三颈瓶中加入130ml二氯甲烷、19.0g L-谷氨酸二乙酯和51.5ml三乙胺，搅拌降温至0～5℃，控制内温≤5℃，缓慢滴加5-硝基-2-噻吩甲酰氯的二氯甲烷(26ml)溶液，滴毕，升温至室温搅拌反应0～1小时，TLC监测反应至终点(正己烷:乙酸乙酯＝1:1)。反应完毕，反应液用150ml 2N盐酸平均分两次洗涤，再用150ml饱和碳酸氢钠平均分两次洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。抽滤，减压浓缩得棕色油状物25g。不经纯化直接用于下一步。

③N-(5-氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯的制备

在250ml三颈瓶中加入30ml乙腈、20ml水、18ml冰醋酸及9.3g还原Fe 粉，搅拌活化10～15分钟，控制内温≤50℃，滴加10.0g N-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-L- 谷氨酸二乙酯的乙腈(30ml)溶液，滴毕，升温至70～80℃反应1～2小时，TLC 监测反应至终点(正己烷:乙酸乙酯＝1:1.5)。降温至10～30℃，垫一层硅藻土抽滤，滤饼用20ml乙腈淋洗，抽滤至无液滴。滤液于60～70℃减压浓缩，平均分两次加入50ml甲苯带除冰醋酸，浓缩至无液滴。残余物加入30ml乙酸乙酯，充分搅拌10～15分钟，抽滤，滤液中加入30ml水，并用20％碳酸钠溶液调节pH 至8～9，搅拌分液，分出有机相，水相再用30ml*2乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，无水硫酸钠干燥。抽滤，减压浓缩得棕色油状物8.5g。

上述油状物用乙酸乙酯溶解，用11.7g硅胶制砂、97.8g硅胶装柱，用正己烷/乙酸乙酯＝3/1洗脱，TLC显示为唯一斑点时收集洗脱液，得淡黄色油状物，即N-(5-氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯，重量6.5g。

④N-(5-甲氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯的制备

100ml三颈瓶中加入5g N-(5-氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯，57.7ml N,N-二甲基甲酰胺，1.4ml 2,6-二甲基吡啶和2.68g碘甲烷，升温至45～48℃搅拌 6小时，再升温至50～52℃反应6小时。停止反应，降温至10～30℃。加入38.6ml 水，用120ml乙酸乙酯平均分三次萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。抽滤，减压浓缩得棕色油状物6.23g。

上述油状物用乙酸乙酯溶解，用8.15g硅胶制砂、67.9g硅胶装柱，用正己烷/乙酸乙酯＝3/1洗脱，TLC显示为唯一斑点时收集洗脱液，得淡黄色油状物，即N-(5-甲氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯，重量3.5g。

⑤有关物质A的制备

100ml反应瓶中加入5.2g氢氧化钠和85ml水，预冷至10-15℃，加入N-(5- 甲氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯，在10-15℃下搅拌反应3-5小时，TLC监控反应完全，加入30ml乙酸乙酯萃取3次，水相重新冷却至10-15℃，用浓盐酸调pH到3-4，反应搅拌过夜。翌日，60℃下，减压旋干溶剂，残留物加入100ml 甲醇打浆，过滤，滤液60℃下，减压旋干溶剂，残留物加入60ml丙酮打浆30min，抽滤烘干得化合物2.1g，收率81％，HPLC为96.7％。¹HNMR，(d6-DMSO,500M) δ：1.8728-1.9330(2H，m)；2.1833-2.2253(2H，m)；2.7406-207497(3H，d)； 4.1824(1H，s)；5.8007-5.8088(1H，d)；6.8378-6.8476(1H，d)；7.3713-7.3794(1H，d)；7.5771(1H，s)；MS:found：285.1，[M-H]⁺。

实施例2 有关物质B的制备

①4-硝基-2-噻吩甲酸的制备

在100ml三颈瓶中加入32ml发烟硝酸，控制温度≤20℃下滴加24ml浓硫酸，滴毕，分批加入22.4g 2-噻吩甲酸，并控制温度不超过20℃，加毕，控制内温10～20℃继续搅拌反应3～4小时，TLC监测反应至终点(正己烷:乙酸乙酯＝1:1)。将反应液缓慢加入448ml冰水中，搅拌析晶1小时，抽滤，滤饼于40～45℃减压干燥8小时，得到18.2g 4-硝基-2-噻吩甲酸和5-硝基-2-噻吩甲酸的混合物，不经纯化直接用于下一步。

②4-硝基-2-噻吩甲酰氯的制备

在50ml三颈瓶中加入18.2g 4-硝基-2-噻吩甲酸和5-硝基-2-噻吩甲酸的混合物及29.1ml氯化亚砜，升温回流反应3～4小时，TLC监测反应至终点(正己烷: 乙酸乙酯＝1:1)。将反应液转移至100ml单口瓶中减压浓缩至无液滴，不经纯化直接用于下一步，收率按100％计。

③N-(4-硝基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯的制备

在250ml三颈瓶中加入182ml二氯甲烷、25.0g L-谷氨酸二乙酯和51.5ml三乙胺，搅拌降温至0～5℃，控制内温≤5℃，缓慢滴加4-硝基-2-噻吩甲酰氯和5- 硝基-2-噻吩甲酰氯的二氯甲烷(36.4ml)溶液，滴毕，升温至室温搅拌反应0～1 小时，TLC监测反应至终点(正己烷:乙酸乙酯＝1:1)。反应完毕，反应液用150ml 2N盐酸平均分两次洗涤，再用150ml饱和碳酸氢钠平均分两次洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。抽滤，减压浓缩得棕色油状物41.7g。

上述油状物用乙酸乙酯溶解，用50g硅胶制砂、625.5g硅胶装柱，用正己烷/乙酸乙酯＝7/1洗脱，TLC显示为唯一斑点时收集洗脱液，得淡黄色油状物，即N-(4-硝基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯，重量10.67g。

④N-(4-氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯的制备

在250ml三颈瓶中加入30ml乙腈、20ml水、18ml冰醋酸及9.3g还原Fe 粉，搅拌活化10～15分钟，控制内温≤50℃，滴加10.0g N-(4-硝基-2-噻吩甲酰)-L- 谷氨酸二乙酯的乙腈(30ml)溶液，滴毕，升温至70～80℃反应1～2小时，TLC 监测反应至终点(正己烷:乙酸乙酯＝1:1.5)。降温至10～30℃，垫一层硅藻土抽滤，滤饼用20ml乙腈淋洗，抽滤至无液滴。滤液于60～70℃减压浓缩，平均分两次加入50ml甲苯带除冰醋酸，浓缩至无液滴。残余物加入30ml乙酸乙酯，充分搅拌10～15分钟，抽滤，滤液中加入30ml水，并用20％碳酸钠溶液调节pH 至8～9，搅拌分液，分出有机相，水相再用30ml*2乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，无水硫酸钠干燥。抽滤，减压浓缩得棕色油状物9.78g。

上述油状物用乙酸乙酯溶解，用11.7g硅胶制砂、97.8g硅胶装柱，用正己烷/乙酸乙酯＝3/1洗脱，TLC显示为唯一斑点时收集洗脱液，得淡黄色油状物，即N-(4-氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯，重量7.95g。

⑤N-(4-甲氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯的制备

100ml三颈瓶中加入5.95g N-(4-氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯，57.7ml N,N-二甲基甲酰胺，1.4ml 2,6-二甲基吡啶和2.68g碘甲烷，升温至45～48℃搅拌6小时，再升温至50～52℃反应6小时。停止反应，降温至10～30℃。加入38.6ml 水，用120ml乙酸乙酯平均分三次萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。抽滤，减压浓缩得棕色油状物6.79g。

上述油状物用乙酸乙酯溶解，用8.15g硅胶制砂、67.9g硅胶装柱，用正己烷/乙酸乙酯＝3/1洗脱，TLC显示为唯一斑点时收集洗脱液，得淡黄色油状物，即N-(4-甲氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯，重量5.12g。

⑥有关物质B的制备

250ml三颈瓶中加入5g氢氧化钠和125ml水，搅拌降温至0～10℃，加入 5.0gN-(4-甲氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯，搅拌反应2～3小时，TLC监测反应至终点(正己烷:乙酸乙酯＝1:1)。反应完毕，用2N盐酸溶液调节pH至3～4，控制内温0～10℃继续搅拌2小时，抽滤，滤饼于45～50℃减压干燥8h，得黄色固体，即N-(4-甲氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸，重量4.06g，纯度为97.7％，ESI-MS 得[M-H]^-为285.1，¹H NMR：δ1.9021-1.9370(2H,m)，δ2.2013-2.3211(2H,m)， δ2.8216(3H，s)，δ4.1784-4.1824(1H,d)，δ6.2596-6.2623(1H,d)，δ6.8210-6.8301 (1H,d)，δ7.3224-7.3254(1H,d)，δ7.6870(1H,s)。

实施例3 有关物质C的制备

①5-硝基-2-噻吩甲酰氯的制备

将30g 5-硝基-2-噻吩甲酸与50ml氯化亚砜投入100ml的三颈瓶中，升温，控制内温75℃～80℃搅拌反应2h后，取反应液约1ml，加入2ml无水甲醇衍生化，以5-硝基-2-噻吩甲酸为对照，TLC检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应终点。将反应液转移至250ml单口瓶中，浓缩至干，加入30ml甲苯减压带干，得绿色针状结晶。

②N-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯的制备

将35.0gL-谷氨酸二乙酯、150ml二氯甲烷及12.5ml二异丙基乙胺投入 250ml三颈瓶中，降温，控制内温0℃～5℃缓慢滴加50ml的二氯甲烷/5-硝基-2- 噻吩甲酰氯溶液，滴毕，保温0℃～5℃搅拌反应30min，取样约1ml进行TLC 检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应终点。反应毕，将反应液依次用2mol/L 盐酸100ml×2洗涤，饱和碳酸氢钠100ml×2洗涤，分取有机相，以5g无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干得N-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯38.2g。

③N-(5-氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯的制备

将上步制备得到的38.2gN-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯、76.4g 还原铁粉、30.6g硫酸亚铁、573ml甲醇、191ml纯化水投入1L的三颈瓶中，升温，控制内温60℃～65℃搅拌反应5h后取样约1ml进行TLC检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1.5)至反应终点。反应毕，布氏漏斗垫76.4g硅藻土抽滤，以76.4ml 甲醇洗涤滤饼，合并滤液减压浓缩至无液滴。旋蒸残留物以150ml×3二氯甲烷萃取，合并有机相，以5g无水硫酸钠干燥，抽滤，旋蒸至干得到棕色油状物 42.4g。该油状物以150ml二氯甲烷分散，55g硅胶(200～300目)拌样后进行柱层析(洗脱剂比例乙酸乙酯：正己烷＝1:1.5～1:1)分离共得到淡黄色油状物 28.7g。

④N-(5-二甲氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯

将上述得到的28.7g淡黄色油状物以287mlDMA溶解后加入到500ml的三颈瓶中，依次加入25.8g碘甲烷，6.6g吡啶后升温，控制内温50℃～55℃搅拌反应12h，取样1ml加入5ml纯化水淬灭后以1ml乙酸乙酯萃取，吸取有机相TLC 检测乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应结束。反应毕，以二氯甲烷150ml×3萃取，合并有机相以饱和氯化钠溶液150ml×2洗涤后分取有机相，以5g无水硫酸钠干燥，浓缩，得到21.1g棕色油状物，该油状物以150ml二氯甲烷分散，45g 硅胶(200～300目)拌样后进行柱层析(洗脱剂比例乙酸乙酯：正己烷＝1:2～1:1.5) 分离共得到淡黄色油状物18.7g。

⑤有关物质C的制备

将10gN-(5-二甲氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯以50ml无水乙醇分散后加入预先冷却至5℃～10℃氢氧化钠水溶液中(5gNaOH、80ml纯化水)，控制内温5℃～10℃搅拌反应5h，取样约1ml进行TLC检测(乙酸乙酯∶正己烷＝1∶1)至反应终点。反应毕，以50ml×2乙酸乙酯洗涤水相，分取水相，以 2mol/L的盐酸调节pH至3.5，将反应液减压浓缩至干进行脱盐操作(加入 50ml×3乙腈洗涤旋蒸后的残留物，合并乙腈浓缩至干)，共得到类白色有关物质C 6.7g，纯度为99.41％。ESI-MS得[M-H]^—为299.1，确证本品分子量为 300.1,¹H NMR：δ1.92(2H，tr)，δ2.25-2.28(2H，q)，δ2.94(6H，s)，δ4.20-4.22 (1H，d)，δ5.88-5.89(1H，d)，δ7.50-7.51(1H，d)，δ7.77(1H，s)。

实施例4 雷替曲塞的制备

①5-硝基-2-噻吩甲酸乙酯的制备

在1000ml三颈瓶中加入510ml乙醇，260g 5-硝基-2-噻吩甲酸，通入HCl 气体30min后，升温至回流反应1小时。反应结束后，减压浓缩至无液滴，加入130ml水，降温至0～10℃，用氨水调节pH至8～9，调节完毕，用二氯甲烷 (130ml*3)萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥。抽滤，减压浓缩，得到 297.0g 5-硝基-2-噻吩甲酸乙酯，收率98.3％。

②5-氨基-2-噻吩甲酸乙酯的制备

在3000ml三颈瓶中加入295.0g 5-硝基-2-噻吩甲酸乙酯、554.2g甲酸铵、 44.3g5％Pd/C及1475ml甲醇，于40～45℃搅拌反应1～2h，TLC监控反应进程。反应结束，抽滤，滤饼用130ml二氯甲烷淋洗，滤液减压浓缩至无液滴。加入 1475ml水和1475ml二氯甲烷，搅拌分液，有机相再用738ml水搅拌洗涤，分液，有机相无水硫酸钠干燥。抽滤，滤液减压浓缩至干得242.0g 5-氨基-2-噻吩甲酸乙酯，收率96.4％。

③5-甲胺基-2-噻吩甲酸乙酯的制备

240.0g 5-氨基-2-噻吩甲酸乙酯和1200.0g原甲酸三甲酯加热至80℃，搅拌反应2小时，TLC监控反应进程。反应结束，降温至50℃以下，减压浓缩除去原甲酸三甲酯，得5-(甲氧基亚甲基)氨基-2-噻吩甲酸乙酯，收率按100％计。

将残留物溶解在2400ml甲醇中，降温至-5～0℃，控制内温≤0℃，分批加入63.6g硼氢化钠，加毕，升温至室温搅拌反应2小时，TLC监控反应进程。反应结束，降温至5℃以下，滴加丙酮淬灭反应。淬灭后，浓缩完毕至无液滴，向残留物中加入720ml二氯甲烷溶解，分别用水(480ml)、饱和食盐水(480ml) 搅拌洗涤，分出有机相，无水硫酸钠干燥。抽滤，减压浓缩。剩余物用乙酸乙酯：正己烷＝1：3精制，得到227.5g 5-甲胺基-2-噻吩甲酸乙酯，收率87.6％。

④5-甲胺基-2-噻吩甲酸的制备

将225.0g 5-甲胺基-2-噻吩甲酸乙酯溶解在1125ml乙醇中，加入1N氢氧化钠溶液1125ml，室温搅拌2小时，TLC监控反应进程。反应完毕，减压浓缩除去乙醇，用1N盐酸溶液调节pH至3～4，析出固体，抽滤，得到170.7g类白色固体，即5-甲胺基-2-噻吩甲酸，收率89.4％。

⑤N-(5-甲胺基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯的制备

170.0g 5-甲胺基-2-噻吩甲酸加入272ml氯化亚砜，升温至78～82℃搅拌反应3小时，TLC监控反应进程。反应结束，减压浓缩至无液滴，并用340ml甲苯平均分两次带除氯化亚砜，浓缩结束后，得到黄绿色5-甲胺基-2-噻吩甲酰氯，不经纯化，直接用于下步，收率按100％计。

将219.8g L-谷氨酸二乙酯、481.0ml三乙胺溶解在1650ml二氯甲烷中，降温至0～5℃，控制内温≤5℃，滴加5-甲胺基-2-噻吩甲酰氯的二氯甲烷(340ml) 溶液，滴毕，升温至室温搅拌反应1小时，TLC监控反应进程。反应结束，反应液分别用饱和碳酸氢钠(850ml*2)洗涤两次、2N盐酸(850ml*2)洗涤两次。洗涤结束后，有机相无水硫酸钠干燥。抽滤，滤液减压浓缩，得到332.2g淡黄色油状物N-(5-甲胺基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯，收率89.7％。

⑥N-[[5-[N-(3，4-二氢-2-甲基-4-氧代-6-喹唑啉基)-甲基]-N-甲基]氨基-2-噻吩甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯的制备

将330.0g N-(5-甲胺基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯溶解在1880mlN,N- 二甲基甲酰胺中，加入278.8g 6-溴甲基-3，4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮和103.3g 2,6-二甲基吡啶，于50～55℃搅拌反应12小时，反应完毕，加入5640ml水，剩余物用乙酸乙酯(1880ml*3)平均分三次萃取，合并有机相，再用饱和食盐水 (1880ml)洗涤，分出有机相，无水硫酸钠干燥。抽滤，减压浓缩，得到341.7g 淡黄色固体，即N-[[5-[N-(3，4-二氢-2-甲基-4-氧代-6-喹唑啉基)-甲基]-N-甲基] 氨基-2-噻吩甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯，收率68.9％。

⑥雷替曲塞的制备

将340.0g N-[[5-[N-(3，4-二氢-2-甲基-4-氧代-6-喹唑啉基)-甲基]-N-甲基]氨基-2-噻吩甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯分批加入到3N氢氧化钠溶液(6500ml) 中，室温搅拌反应2小时，TLC监控反应进程。反应完毕，用3N盐酸调节pH 至3～4，继续搅拌析晶1小时，抽滤，得到黄色固体。再用甲醇-水(4:1)重结晶，得到244.2g淡黄色固体，即雷替曲塞，收率80.6％，HPLC纯度为99.8％，并且ABC的含量为0.05％，0.03％，0.02％(详见附图1)。

实施例5 有关物质A、B、C的毒性研究

试验动物：SD大鼠300只，体重200g±20g；昆明种小白鼠300只，体重20g±2g。动物尾静脉注射给予雷替曲塞有关物质，给药剂量为： 1.0ml/100g(1mg/ml,用氯化钠溶液稀释至指定浓度)，小鼠为0.1ml/10g(1mg/ml，用氯化钠溶液稀释至指定浓度)，每天给药一次。给药后，连续观察2周。

观察指标：

(1)注射药物后，观察动物死亡时间及其死亡数量，并计算LD₅₀值；

(2)给药后中毒症状和持续时间；

(3)死亡动物立行解剖检查；在观察结束时，对存活动物进行解剖检查。

表1 雷替曲塞及其有关物质A、B、C的LD₅₀值

从上表数据可以看出，雷替曲塞的LD₅₀在SD大鼠和小鼠中的值均为有关物质A、B、C的50多倍以上，说明有关物质A、B、C的毒性远大于雷替曲塞的毒性，由此推测，其副作用与其有关物质有一定的相关性。

实施例6 雷替曲塞有关物质A、B、C对小鼠白细胞和粒细胞的影响

雌性昆明种小白鼠100只，体重20±2g，适应饲养后，随机分为溶剂对照组、雷替曲塞组、雷替曲塞有关物质A组、B组、C组，共5组。

受试药物：纯度为99.8％的雷替曲塞(市售雷替曲塞原料药由南京正大天晴有限责任公司生产提供)，黄色结晶粉末，实施例1制备的雷替曲塞有关物质A，实施例2制备的雷替曲塞有关物质B，实施例3制备的雷替曲塞有关物质C。

给药方法：小鼠尾静脉注射给药，给药体积为0.1ml/10g，连续给药4周，给药前，受试药物经0.9％的氯化钠溶液溶解，并按照剂量要求稀释至所需浓度。

剂量设计：根据雷替曲塞的人用临床剂量为(3mg/m²/天)，相当于70kg的人每天0.075mg/kg，以此设定小鼠的给药剂量为0.029mg/g。

雷替曲塞有关物质A、B、C的高剂量均为19mg/kg，中剂量为9mg/kg，低剂量为3mg/kg，

对照组给予等体积的生理盐水。

观察指标

血象检测：尾静脉取血20ul，以日产血象检测仪检测。各组小鼠在给药前、给药期间每周、给药结束一周各检测一次。结果见表2和表3。

表2 雷替曲塞有关物质A、B、C对小鼠外周血白细胞的影响(单位10⁹/L)

*表示与对照组相比，p＜0.05

由表2可见，与对照组相比，雷替曲塞白细胞含量有所下降，但是雷替曲塞有关物质A、B、C各剂量组动物的白细胞数下降都较大，与对照组相比呈现显著性差异。说明雷替曲塞有关物质A、B、C可致小鼠外周血的白细胞数减少，而雷替曲塞本身对外周白细胞的影响较小，故合理控制有关物质含量可以有效减少其严重血液系统副作用的发生。

表3 雷替曲塞有关物质A、B、C对小鼠粒细胞的影响

由表3可见，与对照组相比，雷替曲塞组的小鼠骨髓呈轻微被抑制状态，但是粒细胞系统总的比例变化不大，而且粒系各不同分化阶段的组成比例亦未出现明显差异；而雷替曲塞有关物质A、B、C组小鼠的骨髓均呈严重被抑制状态，而且粒系各不同分化阶段的组成比例亦出现明显差异。说明雷替曲塞有关物质A、 B、C可对小鼠粒细胞的生成和分化产生严重影响。

综上，可以看出雷替曲塞有关物质A、B、C对于小鼠血液系统的影响以及毒性均明显大于雷替曲塞，故合理控制其在最终成品中的含量，能有效减少与血液系统相关的严重副作用的发生，从而提升雷替曲塞在临床上应用的安全性。

实施例7 雷替曲塞组合物对小鼠粒细胞的影响

雌性昆明种小白鼠200只，体重20±2克，适应饲养后，随机分为溶剂对照组、雷替曲塞组、雷替曲塞与雷替曲塞有关物质A组、B组、C组，共5组。

受试药物：雷替曲塞对照组：按照文献Quinazoline Antifolate ThymidylateSynthase Inhibitors：Heterocyclic Benzoyl Ring Modifications，J.Med.Chem.1991，34，1594-1605中公开的方法进行制备；

雷替曲塞：按照实施例4的制备方法制备的雷替曲塞；

有关物质A组：雷替曲塞与雷替曲塞有关物质A的组合物，其中有关物质 A占组合物的重量比分别为0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％(下称“A组合物”)；

有关物质B组：雷替曲塞与雷替曲塞有关物质B的组合物，其中有关物质A占组合物的重量比分别为0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％(下称“B组合物”)；

有关物质C组：雷替曲塞与雷替曲塞有关物质C的组合物，其中有关物质 A占组合物的重量比分别为0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％(下称“C组合物”)；

给药前，受试药物经注射用水溶解，并按剂量要求稀释至所需浓度。

给药方法：小鼠尾静脉注射给药，给药体积为0.1ml/10g体重，连续给药4 周。

剂量设计：根据雷替曲塞的人用临床剂量为(3mg/m²/天)，相当于70kg的人每天0.075mg/kg，以此设定小鼠的给药剂量为0.029mg/天，对照组给予等体积的生理盐水。

观察指标

血象检测：尾静脉取血20μl，以日产血象检测仪检测。各组小鼠在给药前、给药期间每周、给药结束一周各检测一次。结果见表4。

表4 雷替曲塞及其A、B、C组合物对小鼠骨髓涂片细胞分类计数结果的影响

由表4可见，雷替曲塞组小鼠的骨髓均呈轻微被抑制状态，粒细胞系统总的比例变化不大，而且粒系各不同分化阶段的组成比例亦未出现明显差异，且与雷替曲塞对照组相比其抑制状态更为轻微，故说明按照本发明所提供的制备方法能制备出质量更好的雷替曲塞原料药。

A、B、C组合物组表现可以看出，当组合物中雷替曲塞有关物质A、B、C 的含量≤0.30时，各组小鼠的骨髓均呈轻微抑制状态，粒细胞系统总的比例变化不大，而且粒系各不同分化阶段的组成比例亦未出现明显差异与雷替曲塞类似；当组合物中雷替曲塞有关物质A、B、C的含量达到0.4％、0.5％和0.6％，随着有关物质A、B、C含量的增大，小鼠的骨髓均呈被抑制状态越发加剧，而且粒系各不同分化阶段的组成比例亦出现的差异逐渐增大，说明雷替曲塞组合物可以对粒细胞的生成和分化产生严重影响。因此，为了保证用药的安全性，雷替曲塞有关物质A、B、C的含量不应高于0.30％。

Claims

1.一种雷替曲塞的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有雷替曲塞，及以下有关物质A、B、C

2.根据权利要求1所述的一种雷替曲塞的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中有关物质A的含量低于0.3％，优选低于0.2％，更优选的低于0.1％。

3.根据权利要求1所述的一种雷替曲塞的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中有关物质B的含量低于0.3％，优选低于0.2％，更优选的低于0.1％。

4.根据权利要求1所述的一种雷替曲塞的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中有关物质C的含量低于0.3％，优选低于0.2％，更优选的低于0.1％。

5.根据权利要求1所述的一种雷替曲塞的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中雷替曲塞含量不低于98％，优选不低于99％，更优选的不低于99.5％。

6.根据权利要求1-5所述的一种雷替曲塞的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中含有含量不低于99.5％的雷替曲塞，以及含量低于0.1％的有关物质A、B、C。

7.一种制备权利要求6所述的雷替曲塞药物组合物的办法，其特征在于，详细制备方法如下，

具体包括以下步骤：

6)N-(5-甲胺基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯与6-溴甲基-3，4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮发生缩合反应得到N-[[5-[N-(3，4-二氢-2-甲基-4-氧代-6-喹唑啉基)-甲基]-N-甲基]氨基-2-噻吩甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯；

8.根据权利要求7所述的雷替曲塞药物组合物制备方法，其特征在于，制备的雷替曲塞组合物中雷替曲塞的含量不低于99.5％，有关物质A、B、C的含量低于0.1％。

9.一种雷替曲塞的药物组合物在制备治疗癌症药物中的用途。

10.根据权利要求9所述的雷替曲塞的制备用途，其特征在于，所述癌症为结直肠癌。