CN107603962A - 一种高活力小分子量谷胱甘肽过氧化物酶gpx3突变体 - Google Patents
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Abstract
一种高活力小分子量谷胱甘肽过氧化物酶GPX3突变体，属于谷胱甘肽过氧化物酶技术领域。本发明以人GPX3为模板，通过计算机模拟肽链删除和定点突变，得到一种新型的高活力小分子量谷胱甘肽过氧化物酶GPX3突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No:1～12所示。其与某些天然人GPX相比较，其不含有半胱氨酸，具有更高的GPX活力和更好的稳定性。产物的蛋白活力显著高于已报道的任何GPX3突变体，能利用血清中低浓度的GSH清除有害自由基，细胞生物学实验证实对过氧化氢损伤的心肌细胞有更强的保护作用。这些优点均有利于大规模生产，解决了天然GPX来源不足、性质不稳定和活力低的问题，在生物制药方面有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于谷胱甘肽过氧化物酶技术领域，具体涉及一种高活力小分子量谷胱甘肽过氧化物酶GPX3突变体。
背景技术
含硒的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的底物是谷胱甘肽(GSH)，催化基团是硒代半胱氨酸(SeCys)。在生物体内，GPX同超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)一起构成了机体抗氧化防御体系。GPX在该体系中发挥着重要的作用，它以底物GSH为还原剂，分解体内的过氧化氢和各类氢过氧化物，因而能清除体内活性氧(ROS)，防止脂质过氧化，治疗由活性氧引起的各种疾病，如衰老、紫外线辐射、心脑血管疾病、白内障、肿瘤等。与其它抗氧化酶不同，GPX除了能清除ROS外，还能降解脂质过氧化物，防止细胞过氧化损伤，这种独特的保护细胞的功能使它在抗氧化酶体系中占有特别重要的位置。然而，由于天然GPX的来源相当有限、稳定性差，致使它的人工产物及其模拟物的研究备受关注。
小分子模拟物主要有PZ51(ebselen)、AL3823A、BXT系列产品，它们的弱点是活力低，仅为天然GPX的千分之一左右。大分子的模拟物主要有抗体酶(中国专利94102481.4和96112628.0)和以谷胱甘肽硫转移酶(GST)为蛋白模板制备的GPX模拟酶，其活力显著高于小分子模拟物。显然，以具有谷胱甘肽(GSH)结合部位的蛋白为模板制备的大分子GPX模拟酶收到了更好的效果，因此开发制备这些高活力的GPX模拟酶制备技术就成了学术界的研究热点，对于分子生物学、生物工程学及医学等领域具有广阔的应用前景。迄今已成功开发的方法有：用化学法(中国专利94102481.4，96112628.0)或营养缺陷型原核表达系统(中国专利200810050556.6)在非GPX类模板蛋白中引入GPX的催化基团硒代半胱氨酸(SeCys)。
中国专利94102481.4，96112628.0，99104234.4，200810050556.6公开的各类含硒抗体酶的制备方法就是应用化学突变(修饰)法在抗体类模板蛋白中引入GPX的催化基团SeCys，有以下缺点：(1)在制备过程中，仅化学突变(修饰)这一步就会损失20～40％的酶蛋白，导致模拟酶产率显著下降；(2)制备模拟酶的周期长，操作繁琐，时间长；(3)在化学突变过程中需使用苯甲基磺酰氟、乙腈等，这些物质为有毒性的物质；(4)缺乏靶向性，对于大的蛋白分子而言，一次化学反应常在不同位点引入多个非特异性催化基团，因此化学突变引入催化基团无法达到基因突变法那样的专一性。
中国专利200810050556.6也公开了人源单链含硒抗体酶的另一种制备方法，是用营养缺陷型原核表达系统(大肠杆菌)和基因突变法引入催化基团，但其仅限于人源单链含硒抗体酶的制备，不包括谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)突变体及其它GPX模拟酶的制备方法。具有GPX活性的谷胱甘肽硫转移酶(GST)的制备方法(Yu,H.J.,Liu,J.Q.,A.,Li,J.,Luo,G.M.,and Shen,J.C.J.Biol.Chem.2005,280,11930-11935)亦见报道，这种方法虽然也采用营养缺陷型原核表达系统和基因突变法引入催化基团，但其仅限于以GST为模板蛋白制备GPX模拟酶，不包括以天然GPX为模板制备GPX突变体。用营养缺陷型原核表达系统在非GPX类模板蛋白中引入催化基团制备模拟酶的方法是将催化基团引入到与GPX有相同底物GSH结合部位的它种蛋白中使其产生GPX活力。
然而由于这些模板蛋白不具备天然GPX自身的催化基团，因此很难找到理想而准确的催化基团的位置；同时由于这些模板蛋白中也没有象天然GPX那样理想的催化三联体，因此这类模拟酶的催化效率不高。如果以天然GPX为模板用基因工程方法来制备GPX突变体则可克服这些缺点。由于编码GPX的催化基团SeCys的密码子UGA是终止密码子，在普通原核表达系统中，需在GPX基因的开放阅读框内、紧邻SeCys的密码子UGA下游引入颈环结构才能将UGA翻译成SeCys而不是终止密码子，而开放阅读框内颈环的引入必然会引起GPX空间构象的改变，进而影响酶活性。因此普通原核表达系统不适于直接表达具有GPX活性的含硒蛋白。
中国专利2013103027783、2013101428661等公开了系列高活力谷胱甘肽过氧化物酶突变体的制备方法，但它们都是对原有的一个或多个氨基酸进行突变，没有做任何肽链的剪切与删除，我们在最新研究中发现，删除氨基端部分氨基酸的小分子量GPX3突变体具有分子量小、酶活力高、稳定性强、耐高温和碱性环境，能利用血清中低浓度的谷胱甘肽(GSH)清除有害自由基，保护组织细胞免受氧化应激损伤，尤其适合作为抗氧化抗衰老药物等独特优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高活力小分子量谷胱甘肽过氧化物酶GPX3突变体。
应用基因工程技术、细胞培养技术、UAG通读技术、营养缺陷型原核表达技术和SPP(Single protein production，单一蛋白生产)系统低温表达技术及制备具有高活力且小分子量的谷胱甘肽过氧化物酶GPX3突变体，是用基因工程技术在哺乳动物细胞株或UAG通读或营养缺陷型原核表达系统及其SPP低温表达系统中直接表达具有高酶活性的小分子量GPX3突变体蛋白的方法。本方法不需化学修饰即可制备具有极高GPX活力的新型人工酶。本发明方法在生物制药方面具有广阔的应用前景。
本发明以人GPX3(参见NCBI,NM_002084.3)为模板，通过计算机模拟肽链删除和定点突变，得到一种新型的高活力小分子量谷胱甘肽过氧化物酶GPX3突变体，其由190个氨基酸组成，与某些天然人GPX相比较，其不含有半胱氨酸，具有更高的GPX活力和更好的稳定性，其是将人GPX3中所有半胱氨酸突变成丝氨酸，并去掉氨基端的17个氨基酸后所形成的小分子量GPX3，其第37位的硒代半胱氨酸(SeCys)单字母缩写为U，序列表中写成Xaa。所述的小分子量GPX3突变体的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示(实施例1-5)
进一步，所述的小分子量GPX3突变体，其氨基酸序列中第65、120位2个丝氨酸的任何一个或两个替换为丙氨酸后所形成的任何一个新型小分子量GPX3突变体。比如第65或120位丝氨酸分别替换为丙氨酸后所形成的序列SEQ ID No:2(实施例6)或SEQ ID No:3(实施例7)，第65和120位两个丝氨酸同时替换为丙氨酸后所形成的序列SEQ ID No:4(实施例8)。
进一步，所述的小分子量GPX3突变体，由于使用了便于靶蛋白纯化的pColdI(TAKARA公司)等分泌型原核或真核表达载体而在上述氨基酸序列的氨基端或羧基端引入该分泌型原核或真核表达载体上的组氨酸纯化标签和其它的氨基酸等所形成的任何一个新型小分子量GPX3突变体。比如在序列SEQ ID No:1、SEQ ID No:2和SEQ ID No:3、SEQ IDNo:4的氨基端引入pColdI(TAKARA公司)原核表达载体的组氨酸纯化标签和凝血因子Xa切割位点的氨基酸后所形成的序列SEQ ID No:5、SEQ ID No:6、SEQ ID No:7、或SEQ ID No:8(实施例9-12)及其用凝血因子Xa切割后所形成的序列SEQ ID No:9、SEQ ID No:10、SEQ IDNo:11、或SEQ ID No:12(实施例13-16)。
本发明具有以下特点：
(1)本发明使用简单的基因合成或扩增、基因突变和表达等基因工程技术，制备方法简单。
(2)本发明方法制备的小分子量GPX3突变体蛋白活力，显著高于已报道的任何GPX3突变体，能利用血清中低浓度的GSH清除有害自由基，细胞生物学实验已证实对过氧化氢损伤的心肌细胞有更强的保护作用。
(3)本发明所述的小分子量GPX3突变体蛋白具有超强的稳定性，不易失活，耐高温和强碱，分子量小，易于通过生物膜，因此能高效发挥清除自由基、抗衰老的功效，这一特性弥补了天然GPX的缺陷，也是其它突变体无法替代的。
(4)本发明使用的分泌型表达载体，能将小分子量GPX3突变体蛋白以可溶性形式表达并分泌到大肠杆菌的周质腔或哺乳类细胞的体外，引导蛋白分泌表达的前导信号肽由菌体或细胞自动切除，所表达的蛋白为可溶性，具有天然蛋白的空间构象和更高的活性，不需复性，可避免包涵体复性过程造成的产率下降和失活，因而生产周期短。
(5)本发明使用的新型杂合tRNA与UAG通读工程菌联合应用，通过常规氨基酸进入肽链的方式实现硒代半胱氨酸在UAG密码子处的定点编码与插入，从而提高通读效率和产率，因此具有高效高产的双重优势。
(6)本发明使用的营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用Cys的密码子合成SeCys，直接表达出在底物GSH的结合部位含有SeCys的小分子量GPX3突变体；本发明使用的SPP低温表达系统能利用MazF蛋白酶特异性识别并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌体只能合成编码基因中无ACA序列的蛋白质，因此新合成的蛋白主要是外源蛋白,从而提高产率和Cys向SeCys的转化率，因此具有活力高、产率高的双重优势。
(7)本发明所用的真核表达直接使用GPX自身的硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)，不需另外引入SECIS进入表达载体，因而操作简单且可用常规真核表达载体实施。
这些优点均有利于大规模生产，为今后的实际应用打下了坚实的基础，解决了天然GPX来源不足、性质不稳定和活力低的问题，在生物制药方面有广阔的应用前景。
附图说明
图1：纯化得到的小分子量GPX3突变体蛋白的SDS-PAGE(上)和Western blot(下)结果：其中M是蛋白分子量Marker，1-16泳道分别对应实施例1～16制备的靶蛋白。
具体实施方式
实施例1：用合成的杂合tRNA序列和靶基因联合UAG通读原核表达系统制备小分子量GPX3突变体蛋白
根据已获授权通知的发明专利2015104313601公开的序列1(SEQ ID No:1)所述的tRNA碱基序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在UAG通读工程菌株中表达序列1(SEQID No:1)所述杂合tRNA的基因，确保杂合tRNA基因的5′端含有lpp启动子序列和ClaI酶切位点，3′端含有rrnc终止子序列和ClaI酶切位点，其序列是：
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATGTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCGCAGGTTCGAATCCTGTCATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTTATCGATGG；用限制性核酸内切酶ClaI单酶切杂合tRNA的基因后，连接到同样用ClaI单酶切的pCold III载体上(TAKARA,Cat.#3369，ClaI为pCold III多克隆位点以外的单独存在酶切位点，在该处插入外源序列不影响载体本身其他功能)，所获得的载体为pCold III-tRNA。
根据本发明序列1(SEQ ID No:1)所述的小分子量GPX3突变体的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在UAG通读工程菌株(C321.ΔA.exp)中表达本发明序列1(SEQ ID No:1)所述的小分子量GPX3突变体蛋白的基因，确保其5′端含有起始密码子(ATG)和EcoR I酶切位点，3′端含有终止密码子和Hind III酶切位点，其第37位Sec的编码序列TGA替换为琥珀型终止密码子(TAG)，用限制性核酸内切酶EcoR I和Hind III双酶切后，连接到同样酶切的pCold III-tRNA载体上，构建的质粒为pCold III-tRNA-小GPx3。
用装有杂合tRNA和小分子量GPX3基因的载体(pCold III-tRNA-GPx1)转化UAG通读工程菌C321.ΔA.exp的感受态细胞，涂含有100μg/mL Amp的营养琼脂平板，筛选阳性菌株。将阳性转化子接种于1.2L营养琼脂培养基(含100μg/mL氨苄青霉素和50uM亚硒酸钠)中，在37℃空气浴中160rpm震荡培养至OD600为0.5。将菌液置于30℃低温摇床中80rpm震荡培养5h，之后加入终浓度为0.1mmol/L IPTG，30℃振荡培养5h，使小分子量GPX3蛋白以可溶性形式表达在菌体的周质腔里。收集菌体(6000rpm，10min)并用等体积的缓冲液T(50mMTris buffer，pH7.5，含1mM EDTA)洗涤两次。用缓冲液T重悬菌体沉淀，加入终浓度1mM的PMSF(苯甲基磺酰氟)，超声破碎菌体，4℃，12000rpm离心30min，收集上清。按说明书处理GSH亲合柱，应用缓冲液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡,将上清液加入GSH亲合柱上,用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，用10mmol/L GSH洗脱目的蛋白。将洗脱液透析并冻干，即得小分子量GPX3突变体蛋白。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)鉴定靶蛋白，其分子量为20.7kDa，且与抗GPX3抗体特异性结合，证明成功获得了目标蛋白，见图1的第1泳道。其GPX活力为3529U/umol蛋白，显著高于已报道的GPX3突变体。
实施例2：
用合成的杂合tRNA序列2(SEQ ID No:2)和靶基因联合UAG通读原核表达系统制备小分子量GPX3突变体蛋白。具体方法与实施例1完全相同，只是根据发明专利2015104313601公开的杂合tRNA序列2(SEQ ID No:2)所述的tRNA碱基序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在UAG通读工程菌株中表达序列2(SEQ ID No:2)所述杂合tRNA的基因，确保杂合tRNA基因的5′端含有lpp启动子序列和ClaI酶切位点，3′端含有rrnc终止子序列和ClaI酶切位点，合成的具体基因序列是：
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATGTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCGCAGGTTCGACTCCTGTCATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTTATCGATGG；制备的小分子量GPX3突变体蛋白见图1的第2泳道。其GPX活力为3428U/umol，显著高于已报道的GPX3突变体。
实施例3：
用合成的杂合tRNA序列5(SEQ ID No:5)和靶基因联合UAG通读原核表达系统制备小分子量GPX3突变体蛋白。具体方法与实施例1完全相同只是根据发明专利2015104313601公开的杂合tRNA序列5(SEQ ID No:5)所述的tRNA碱基序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在UAG通读工程菌株中表达序列5(SEQ IDNo:5)所述杂合tRNA的基因，确保杂合tRNA基因的5′端含有lpp启动子序列和ClaI酶切位点，3′端含有rrnc终止子序列和ClaI酶切位点，合成的具体基因序列是：CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATCTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCGCAGGTTCGAATCCTGTGATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTTATCGATGG；制备的小分子量GPX3突变体蛋白见图1的第3泳道。其GPX活力为3412U/umol，显著高于已报道的GPX3突变体。
实施例4：用合成的靶基因联合SPP和营养缺陷型原核表达系统制备基因工程小分子量GPX3突变体蛋白
根据本发明序列1(SEQ ID No:1)所述的小分子量GPX3突变体的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在营养缺陷型菌株中表达序列1(SEQ ID No:1)所述的小分子量GPX3突变体蛋白的基因，确保小分子量GPX3突变体基因的5′端含有起始密码子(ATG)和Nde I酶切位点，3′端含有终止密码子和Hind III酶切位点，小分子量GPX3突变体基因的第37号SeCys的编码序列TGA替换为Cys的密码子(TGC)，且基因全长不含有ACA序列；具体的靶基因序列是将GPX3(参见NCBI,NM_002084.3)氨基端第2-18位氨基酸去掉后所得的小分子量GPX3基因中第65和120位的半胱氨酸的编码序列替换为丝氨酸的密码子(依次是：AGC、AGT)，将小分子量GPX3基因中第37位硒代半胱氨酸的密码子替换为半胱氨酸的编码序列(TGC)，再根据密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，将小分子量GPX3基因中所有ACA序列突变掉，获得无ACA序列的小分子量GPX3突变体基因，确保该基因能编码本发明序列1(SEQ ID No:1)所述的小分子量GPX3突变体蛋白，且靶基因的5′端含有起始密码子(ATG)和Nde I酶切位点，3′端含有终止密码子和Hind III酶切位点；用限制性核酸内切酶Nde I和Hind III双酶切后，连接到同样酶切的pCold III(TAKARA,Cat.#3369)载体上。
用装有小分子量GPX3突变体基因的载体(pCold III-小GPX3突)转化营养缺陷型大肠杆菌BL21(DE3)Cys，涂含有Cys的营养琼脂平板，筛选阳性菌株。再将表达核酸内切酶MazF的质粒pMazF(TAKARA,Cat.#3369)转化到该阳性菌株中。将菌液均匀涂布在含100μg/mL Amp、25μg/mL Kana和25μg/mL的M9-CAA固体培养基中筛选阳性转化子。将阳性转化子接种于1.2L M9缺陷表达培养基(在M9培养基中加入100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素、50μg/ml Cys和除了Cys之外的19种氨基酸各100μg/ml)中至OD600为0.5。将菌液置于-20℃冰箱中5min，使菌液迅速冷却，之后将菌液置于15℃中继续振荡培养45min。15℃5000rpm离心5min，弃上清。用0.9％NaCl重悬菌体沉淀，15℃5000rpm离心5min，弃上清，重复该步骤。然后用生产培养基(在M9培养基中加入除了Cys之外的19种氨基酸各50-400μg/ml)重悬菌体，加入终浓度为1mmol/L IPTG和终浓度为2 00μg/mL SeCys，15℃振荡培养16-72h，使小分子量GPX3突变体蛋白以可溶性形式表达在菌体的周质腔里，而MazF能通过识别并切断单链RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白质的表达。收集菌体(6000rpm，10min)并用等体积的bufferT(50mM Tris buffer，pH7.5，含1mM EDTA)洗涤两次。用BufferT重悬菌体沉淀，加入终浓度1mM的PMSF(苯甲基磺酰氟)，超声破碎菌体，4℃，12000rpm离心30min，收集上清。按说明书处理GSH亲合柱，应用缓冲液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡,将上清液加入GSH亲合柱上，用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，用10mmol/L GSH洗脱目的蛋白。将洗脱液透析并冻干，即得小分子量GPX3突变体蛋白。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Westernblot)鉴定靶蛋白，其分子量为20.7kDa，且与抗GPX3抗体特异性结合，证明成功获得了目标蛋白，见图1的第4泳道。其GPX活力为3501U/μmol，显著高于已报道的GPX3突变体。
实施例5：用合成的基因和哺乳细胞表达系统制备小分子量GPX3突变体蛋白
1.表达载体的构建：根据本发明序列1(SEQ ID No:1)所述的小分子量GPX3突变体的氨基酸序列在生物试剂公司用DNA合成仪人工合成小分子量GPX3突变体基因，确保基因的5′端含有起始密码子(ATG)和Hind III酶切位点，3′端在小分子量GPX3突变体基因终止密码子下游含有GPX3基因的3′端非翻译区的全部碱基序列和BamHI酶切位点；具体的靶基因序列是将GPX3(参见NCBI,NM_002084.3)氨基端的第2-18位氨基酸去掉后得到的小分子量GPX3基因中第65和120位的半胱氨酸的密码子替换为丝氨酸的编码序列(AGC和AGT)所得到的能编码本发明序列1(SEQ ID No:1)所述的小分子量GPX3突变体蛋白的基因，且靶基因的3′端含有GPX3基因的3′端非翻译区的全部碱基序列(从GPX3基因的终止密码子后第一个碱基到多聚寡核苷酸A前一个碱基，具体序列参见NCBI,NM_002084.3)，并在多聚寡核苷酸A前一个碱基后插入BamHI酶切位点。用先酶切后连接的方法，通过Hind III/BamHI酶切位点将小分子量GPX3突变体基因连同硒代半胱氨酸插入序列连接到同样酶切的哺乳类细胞表达载体pSecTag2A(Invitrogen公司)上；同理根据基因文库中人硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2(SBP2，NCBI，NM_024077.3)羧基端343-854位的512个氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成仪人工合成其编码基因，确保基因的5′端含有起始密码子(ATG)和XbaI酶切位点，3′端含有终止密码子和EcoRI酶切位点。用先酶切后连接的方法，通过XbaI/EcoRI酶切位点将SBP2的羧基端(343-854aa)基因组装到同样酶切的胞内型哺乳类细胞表达载体pcDNA3.1/myc-His A(Invitrogen公司)上。
2.阳性细胞株的筛选：当细胞生长到1×106/ml的密度时，用含有SBP2和GPX3突变体基因的表达载体在Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen，按说明书使用)介导下共转染293F细胞(Invitrogen，R79007)，转染后72小时将细胞转入培养皿中开始贴壁培养，贴壁培养48(通常2-50)小时后换含有G418和Zeocin的培养液，筛选具有两种抗性即同时稳定表达SBP2和小分子量GPX3突变体两种外源蛋白的阳性细胞克隆，期间G418和Zeocin浓度分别从800-200μg/ml和400-100μg/ml逐步递减，每次分别减200μg/ml和100μg/ml，每个浓度使用5天，2-3天换一次培养液，筛选培养20天后将阳性细胞克隆用96、48、24、12和6孔培养板逐级放大培养。用抗GPX3多克隆抗体和ELISA技术检测小分子量GPX3突变体蛋白的表达量，挑选靶蛋白表达量高的细胞株用于扩培养和冻存。
3.蛋白的表达与纯化：在大容量含有1-10μM亚硒酸钠的293F表达培养基中扩培养2中筛选获得的同时稳定表达SBP2和小分子量GPX3突变体两种外源蛋白的细胞株。在SBP2、SECIS和293细胞中其它蛋白因子的共同参与下，小分子量GPX3突变体蛋白以可溶性形式表达并分泌于培养基中，每48小时收集一次培养液。培养液经10KDa分子量超滤膜浓缩20倍后，用GSH亲和层析柱纯化小分子量GPX3突变体蛋白，收集含有小分子量GPX3的洗脱液，透析除去小分子物质，冻干即得小分子量GPX3突变体蛋白。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)鉴定靶蛋白，其分子量为20.7kDa，且与抗GPX3抗体特异性结合，证明成功获得了目标蛋白，见图1的第5泳道。其GPX活力为3375U/μmol，显著高于已报道的GPX3突变体。
实施例6：
与实施例1制备方法完全相同，只是合成小分子量GPX3突变体的编码基因时将第65位丝氨酸的编码序列替换为丙氨酸的密码子，最后获得的小分子量GPX3突变体蛋白的第65位是丙氨酸，而不是丝氨酸，其它氨基酸序列与第一种方法完全相同，即本发明序列2(SEQ ID No:2)所述的小分子量GPX3突变体蛋白。该突变体分子量仅有微小的变化，在SDS-PAGE和Western Blot结果上没有区别，见图1的第6泳道。其GPX活力为3202U/μmol，显著高于已报道的GPX3突变体。
实施例7：
与实施例1制备方法完全相同，只是合成小分子量GPX3突变体的编码基因时将第120位丝氨酸的编码序列替换为丙氨酸的密码子，最后获得的小分子量GPX3突变体蛋白的第120位是丙氨酸，而不是丝氨酸，其它氨基酸序列与第一种方法完全相同，即本发明序列3(SEQ ID No:3)所述的小分子量GPX3突变体蛋白。该突变体分子量仅有微小的变化，在SDS-PAGE和Western Blot结果上没有区别，见图1的第7泳道。其GPX活力为3217U/μmol，显著高于已报道的GPX3突变体。
实施例8：
与实施例1制备方法完全相同，只是合成小分子量GPX3突变体的编码基因时将第65和120位丝氨酸的编码序列替换为丙氨酸的密码子，最后获得的小分子量GPX3突变体蛋白的第65和120位是丙氨酸，而不是丝氨酸，其它氨基酸序列与第一种方法完全相同，即本发明序列4(SEQ ID No:4)所述的小分子量GPX3突变体蛋白。该突变体分子量仅有微小的变化，在SDS-PAGE和Western Blot结果上没有区别，见图1的第8泳道。其GPX活力为3253U/μmol，显著高于已报道的GPX3突变体。
实施例9：
除将实施例1所用的表达载体pCold III(TAKARA,Cat.#3369)换成带组氨酸纯化标签的pCold I(TAKARA,Cat.#3367)，其余与实施例1完全相同，即最终将获得本发明序列5(SEQ ID No:5)所述的小分子量GPX3突变体蛋白。该突变体在氨基端引入了载体上包括6个组氨酸在内的16个外源氨基酸，因此分子量有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot结果上可以看到，见图1的第9泳道，其优点是也可以用镍亲和层系纯化靶蛋白。其GPX活力为3168U/μmol，略低于实施例1，用凝血因子Xa切割去掉标签后活力没有显著变化，证明纯化标签对蛋白的活力没有明显影响，切割后的序列即为SEQ ID No:9，见图1的第13泳道。
实施例10：
除将实施例6所用的表达载体pCold III(TAKARA,Cat.#3369)换成带组氨酸纯化标签的pCold I(TAKARA,Cat.#3367)，其余与实施例6完全相同，即最终将获得本发明序列6(SEQ ID No:6)所述的小分子量GPX3突变体蛋白。该突变体在氨基端引入了载体上包括6个组氨酸在内的16个外源氨基酸，因此分子量有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot结果上可以看到，见图1的第10泳道，其优点是也可以用镍亲和层系纯化靶蛋白。其GPX活力为3115U/μmol，略低于实施例6，用凝血因子Xa切割去掉标签后活力没有显著变化，证明纯化标签对蛋白的活力没有明显影响，切割后的序列即为SEQ ID No:10，见图1的第14泳道。
实施例11：
除将实施例7所用的表达载体pCold III(TAKARA,Cat.#3369)换成带组氨酸纯化标签的pCold I(TAKARA,Cat.#3367)，其余与实施例7完全相同，即最终将获得本发明序列7(SEQ ID No:7)所述的小分子量GPX3突变体蛋白。该突变体在氨基端引入了载体上包括6个组氨酸在内的16个外源氨基酸，因此分子量有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot结果上可以看到，见图1的第11泳道，其优点是也可以用镍亲和层系纯化靶蛋白。其GPX活力为3057U/μmol，略低于实施例7，用凝血因子Xa切割去掉标签后活力没有显著变化，证明纯化标签对蛋白的活力没有明显影响，切割后的序列即为SEQ ID No:11，见图1的第15泳道。
实施例12：
除将实施例8所用的表达载体pCold III(TAKARA,Cat.#3369)换成带组氨酸纯化标签的pCold I(TAKARA,Cat.#3367)，其余与实施例8完全相同，即最终将获得本发明序列8(SEQ ID No:8)所述的小分子量GPX3突变体蛋白。该突变体在氨基端引入了载体上包括6个组氨酸在内的16个外源氨基酸，因此分子量有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot结果上可以看到，见图1的第12泳道，其优点是也可以用镍亲和层系纯化靶蛋白。其GPX活力为3086U/μmol，略低于实施例8，用凝血因子Xa切割去掉标签后活力没有显著变化，证明纯化标签对蛋白的活力没有明显影响，切割后的序列即为SEQ ID No:12，见图1的第16泳道。
〈110〉吉林大学
〈120〉一种高活力小分子量谷胱甘肽过氧化物酶GPX3突变体
〈160〉12
〈210〉1
〈211〉190
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（1)...(190）
〈223〉由人GPx3氨基酸序列突变得到，作为高活力及超稳定的抗氧化酶
〈220〉
〈221〉MUTAGEN
〈222〉（65,120）
〈223〉由半胱氨酸突变为丝氨酸
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（37）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈400〉1
Met Gly Thr Ile Tyr Glu Tyr Gly Ala Leu Thr Ile Asp Gly Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Ile Pro Phe Lys Gln Tyr Ala Gly Lys Tyr Val Leu Phe
20 25 30
Val Asn Val Ala Ser Tyr Xaa Gly Leu Thr Gly Gln Tyr Ile Glu
35 40 45
Leu Asn Ala Leu Gln Glu Glu Leu Ala Pro Phe Gly Leu Val Ile
50 55 60
Leu Gly Phe Pro Ser Asn Gln Phe Gly Lys Gln Glu Pro Gly Glu
65 70 75
Asn Ser Glu Ile Leu Pro Thr Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly
80 85 90
Gly Phe Val Pro Asn Phe Gln Leu Phe Glu Lys Gly Asp Val Asn
95 100 105
Gly Glu Lys Glu Gln Lys Phe Tyr Thr Phe Leu Lys Asn Ser Ser
110 115 120
Pro Pro Thr Ser Glu Leu Leu Gly Thr Ser Asp Arg Leu Phe Trp
125 130 135
Glu Pro Met Lys Val His Asp Ile Arg Trp Asn Phe Glu Lys Phe
140 145 150
Leu Val Gly Pro Asp Gly Ile Pro Ile Met Arg Trp His His Arg
155 160 165
Thr Thr Val Ser Asn Val Lys Met Asp Ile Leu Ser Tyr Met Arg
170 175 180
Arg Gln Ala Ala Leu Gly Val Lys Arg Lys
185 190
〈210〉2
〈211〉190
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（1）...（190）
〈223〉由人GPx3氨基酸序列突变得到，作为高活力及超稳定的抗氧化酶
〈220〉
〈221〉MUTAGEN
〈222〉（65）
〈223〉由半胱氨酸突变为丙氨酸
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（37）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈220〉
〈221〉MUTAGEN
〈222〉（120）
〈223〉由半胱氨酸突变为丝氨酸
〈400〉2
Met Gly Thr Ile Tyr Glu Tyr Gly Ala Leu Thr Ile Asp Gly Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Ile Pro Phe Lys Gln Tyr Ala Gly Lys Tyr Val Leu Phe
20 25 30
Val Asn Val Ala Ser Tyr Xaa Gly Leu Thr Gly Gln Tyr Ile Glu
35 40 45
Leu Asn Ala Leu Gln Glu Glu Leu Ala Pro Phe Gly Leu Val Ile
50 55 60
Leu Gly Phe Pro Ala Asn Gln Phe Gly Lys Gln Glu Pro Gly Glu
65 70 75
Asn Ser Glu Ile Leu Pro Thr Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly
80 85 90
Gly Phe Val Pro Asn Phe Gln Leu Phe Glu Lys Gly Asp Val Asn
95 100 105
Gly Glu Lys Glu Gln Lys Phe Tyr Thr Phe Leu Lys Asn Ser Ser
110 115 120
Pro Pro Thr Ser Glu Leu Leu Gly Thr Ser Asp Arg Leu Phe Trp
125 130 135
Glu Pro Met Lys Val His Asp Ile Arg Trp Asn Phe Glu Lys Phe
140 145 150
Leu Val Gly Pro Asp Gly Ile Pro Ile Met Arg Trp His His Arg
155 160 165
Thr Thr Val Ser Asn Val Lys Met Asp Ile Leu Ser Tyr Met Arg
170 175 180
Arg Gln Ala Ala Leu Gly Val Lys Arg Lys
185 190
〈210〉3
〈211〉190
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（1）...（190）
〈223〉由人GPx1氨基酸序列突变得到，作为高活力及超稳定的抗氧化酶
〈220〉
〈221〉MUTAGEN
〈222〉（65）
〈223〉由半胱氨酸突变为丝氨酸
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（37）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈220〉
〈221〉MUTAGEN
〈222〉（120）
〈223〉由半胱氨酸突变为丙氨酸
〈400〉3
Met Gly Thr Ile Tyr Glu Tyr Gly Ala Leu Thr Ile Asp Gly Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Ile Pro Phe Lys Gln Tyr Ala Gly Lys Tyr Val Leu Phe
20 25 30
Val Asn Val Ala Ser Tyr Xaa Gly Leu Thr Gly Gln Tyr Ile Glu
35 40 45
Leu Asn Ala Leu Gln Glu Glu Leu Ala Pro Phe Gly Leu Val Ile
50 55 60
Leu Gly Phe Pro Ser Asn Gln Phe Gly Lys Gln Glu Pro Gly Glu
65 70 75
Asn Ser Glu Ile Leu Pro Thr Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly
80 85 90
Gly Phe Val Pro Asn Phe Gln Leu Phe Glu Lys Gly Asp Val Asn
95 100 105
Gly Glu Lys Glu Gln Lys Phe Tyr Thr Phe Leu Lys Asn Ser Ala
110 115 120
Pro Pro Thr Ser Glu Leu Leu Gly Thr Ser Asp Arg Leu Phe Trp
125 130 135
Glu Pro Met Lys Val His Asp Ile Arg Trp Asn Phe Glu Lys Phe
140 145 150
Leu Val Gly Pro Asp Gly Ile Pro Ile Met Arg Trp His His Arg
155 160 165
Thr Thr Val Ser Asn Val Lys Met Asp Ile Leu Ser Tyr Met Arg
170 175 180
Arg Gln Ala Ala Leu Gly Val Lys Arg Lys
185 190
〈210〉4
〈211〉190
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（1）...（190）
〈223〉由人GPx3氨基酸序列突变得到，作为高活力及超稳定的抗氧化酶
〈220〉
〈221〉MUTAGEN
〈222〉（65,120）
〈223〉由半胱氨酸突变为丙氨酸
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（37）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈400〉4
Met Gly Thr Ile Tyr Glu Tyr Gly Ala Leu Thr Ile Asp Gly Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Ile Pro Phe Lys Gln Tyr Ala Gly Lys Tyr Val Leu Phe
20 25 30
Val Asn Val Ala Ser Tyr Xaa Gly Leu Thr Gly Gln Tyr Ile Glu
35 40 45
Leu Asn Ala Leu Gln Glu Glu Leu Ala Pro Phe Gly Leu Val Ile
50 55 60
Leu Gly Phe Pro Ala Asn Gln Phe Gly Lys Gln Glu Pro Gly Glu
65 70 75
Asn Ser Glu Ile Leu Pro Thr Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly
80 85 90
Gly Phe Val Pro Asn Phe Gln Leu Phe Glu Lys Gly Asp Val Asn
95 100 105
Gly Glu Lys Glu Gln Lys Phe Tyr Thr Phe Leu Lys Asn Ser Ala
110 115 120
Pro Pro Thr Ser Glu Leu Leu Gly Thr Ser Asp Arg Leu Phe Trp
125 130 135
Glu Pro Met Lys Val His Asp Ile Arg Trp Asn Phe Glu Lys Phe
140 145 150
Leu Val Gly Pro Asp Gly Ile Pro Ile Met Arg Trp His His Arg
155 160 165
Thr Thr Val Ser Asn Val Lys Met Asp Ile Leu Ser Tyr Met Arg
170 175 180
Arg Gln Ala Ala Leu Gly Val Lys Arg Lys
185 190
〈210〉5
〈211〉206
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（-16）...(190）
〈223〉由人GPx3氨基酸序列突变得到，作为高活力及超稳定的抗氧化酶
〈220〉
〈221〉MUTAGEN
〈222〉（65,120）
〈223〉由半胱氨酸突变为丝氨酸
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（37）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈400〉5
Met Asn His Lys Val His His His His His His Ile Glu Gly Arg His
-15 -10 -5
Met Gly Thr Ile Tyr Glu Tyr Gly Ala Leu Thr Ile Asp Gly Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Ile Pro Phe Lys Gln Tyr Ala Gly Lys Tyr Val Leu Phe
20 25 30
Val Asn Val Ala Ser Tyr Xaa Gly Leu Thr Gly Gln Tyr Ile Glu
35 40 45
Leu Asn Ala Leu Gln Glu Glu Leu Ala Pro Phe Gly Leu Val Ile
50 55 60
Leu Gly Phe Pro Ser Asn Gln Phe Gly Lys Gln Glu Pro Gly Glu
65 70 75
Asn Ser Glu Ile Leu Pro Thr Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly
80 85 90
Gly Phe Val Pro Asn Phe Gln Leu Phe Glu Lys Gly Asp Val Asn
95 100 105
Gly Glu Lys Glu Gln Lys Phe Tyr Thr Phe Leu Lys Asn Ser Ser
110 115 120
Pro Pro Thr Ser Glu Leu Leu Gly Thr Ser Asp Arg Leu Phe Trp
125 130 135
Glu Pro Met Lys Val His Asp Ile Arg Trp Asn Phe Glu Lys Phe
140 145 150
Leu Val Gly Pro Asp Gly Ile Pro Ile Met Arg Trp His His Arg
155 160 165
Thr Thr Val Ser Asn Val Lys Met Asp Ile Leu Ser Tyr Met Arg
170 175 180
Arg Gln Ala Ala Leu Gly Val Lys Arg Lys
185 190
〈210〉6
〈211〉206
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（-16）...（190）
〈223〉由人GPx3氨基酸序列突变得到，作为高活力及超稳定的抗氧化酶
〈220〉
〈221〉MUTAGEN
〈222〉（65）
〈223〉由半胱氨酸突变为丙氨酸
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（37）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈220〉
〈221〉MUTAGEN
〈222〉（120）
〈223〉由半胱氨酸突变为丝氨酸
〈400〉6
Met Asn His Lys Val His His His His His His Ile Glu Gly Arg His
-15 -10 -5
Met Gly Thr Ile Tyr Glu Tyr Gly Ala Leu Thr Ile Asp Gly Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Ile Pro Phe Lys Gln Tyr Ala Gly Lys Tyr Val Leu Phe
20 25 30
Val Asn Val Ala Ser Tyr Xaa Gly Leu Thr Gly Gln Tyr Ile Glu
35 40 45
Leu Asn Ala Leu Gln Glu Glu Leu Ala Pro Phe Gly Leu Val Ile
50 55 60
Leu Gly Phe Pro Ala Asn Gln Phe Gly Lys Gln Glu Pro Gly Glu
65 70 75
Asn Ser Glu Ile Leu Pro Thr Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly
80 85 90
Gly Phe Val Pro Asn Phe Gln Leu Phe Glu Lys Gly Asp Val Asn
95 100 105
Gly Glu Lys Glu Gln Lys Phe Tyr Thr Phe Leu Lys Asn Ser Ser
110 115 120
Pro Pro Thr Ser Glu Leu Leu Gly Thr Ser Asp Arg Leu Phe Trp
125 130 135
Glu Pro Met Lys Val His Asp Ile Arg Trp Asn Phe Glu Lys Phe
140 145 150
Leu Val Gly Pro Asp Gly Ile Pro Ile Met Arg Trp His His Arg
155 160 165
Thr Thr Val Ser Asn Val Lys Met Asp Ile Leu Ser Tyr Met Arg
170 175 180
Arg Gln Ala Ala Leu Gly Val Lys Arg Lys
185 190
〈210〉7
〈211〉206
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（-16）...（190）
〈223〉由人GPx3氨基酸序列突变得到，作为高活力及超稳定的抗氧化酶
〈220〉
〈221〉MUTAGEN
〈222〉（65）
〈223〉由半胱氨酸突变为丝氨酸
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（30）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈220〉
〈221〉MUTAGEN
〈222〉（120）
〈223〉由半胱氨酸突变为丙氨酸
〈400〉7
Met Asn His Lys Val His His His His His His Ile Glu Gly Arg His
-15 -10 -5
Met Gly Thr Ile Tyr Glu Tyr Gly Ala Leu Thr Ile Asp Gly Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Ile Pro Phe Lys Gln Tyr Ala Gly Lys Tyr Val Leu Phe
20 25 30
Val Asn Val Ala Ser Tyr Xaa Gly Leu Thr Gly Gln Tyr Ile Glu
35 40 45
Leu Asn Ala Leu Gln Glu Glu Leu Ala Pro Phe Gly Leu Val Ile
50 55 60
Leu Gly Phe Pro Ser Asn Gln Phe Gly Lys Gln Glu Pro Gly Glu
65 70 75
Asn Ser Glu Ile Leu Pro Thr Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly
80 85 90
Gly Phe Val Pro Asn Phe Gln Leu Phe Glu Lys Gly Asp Val Asn
95 100 105
Gly Glu Lys Glu Gln Lys Phe Tyr Thr Phe Leu Lys Asn Ser Ala
110 115 120
Pro Pro Thr Ser Glu Leu Leu Gly Thr Ser Asp Arg Leu Phe Trp
125 130 135
Glu Pro Met Lys Val His Asp Ile Arg Trp Asn Phe Glu Lys Phe
140 145 150
Leu Val Gly Pro Asp Gly Ile Pro Ile Met Arg Trp His His Arg
155 160 165
Thr Thr Val Ser Asn Val Lys Met Asp Ile Leu Ser Tyr Met Arg
170 175 180
Arg Gln Ala Ala Leu Gly Val Lys Arg Lys
185 190
〈210〉8
〈211〉206
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（-16）...（190）
〈223〉由人GPx3氨基酸序列突变得到，作为高活力及超稳定的抗氧化酶
〈220〉
〈221〉MUTAGEN
〈222〉（65,120）
〈223〉由半胱氨酸突变为丙氨酸
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（37）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈400〉8
Met Asn His Lys Val His His His His His His Ile Glu Gly Arg His
-15 -10 -5
Met Gly Thr Ile Tyr Glu Tyr Gly Ala Leu Thr Ile Asp Gly Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Ile Pro Phe Lys Gln Tyr Ala Gly Lys Tyr Val Leu Phe
20 25 30
Val Asn Val Ala Ser Tyr Xaa Gly Leu Thr Gly Gln Tyr Ile Glu
35 40 45
Leu Asn Ala Leu Gln Glu Glu Leu Ala Pro Phe Gly Leu Val Ile
50 55 60
Leu Gly Phe Pro Ala Asn Gln Phe Gly Lys Gln Glu Pro Gly Glu
65 70 75
Asn Ser Glu Ile Leu Pro Thr Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly
80 85 90
Gly Phe Val Pro Asn Phe Gln Leu Phe Glu Lys Gly Asp Val Asn
95 100 105
Gly Glu Lys Glu Gln Lys Phe Tyr Thr Phe Leu Lys Asn Ser Ala
110 115 120
Pro Pro Thr Ser Glu Leu Leu Gly Thr Ser Asp Arg Leu Phe Trp
125 130 135
Glu Pro Met Lys Val His Asp Ile Arg Trp Asn Phe Glu Lys Phe
140 145 150
Leu Val Gly Pro Asp Gly Ile Pro Ile Met Arg Trp His His Arg
155 160 165
Thr Thr Val Ser Asn Val Lys Met Asp Ile Leu Ser Tyr Met Arg
170 175 180
Arg Gln Ala Ala Leu Gly Val Lys Arg Lys
185 190
〈210〉9
〈211〉191
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（-1）...(190）
〈223〉由人GPx3氨基酸序列突变得到，作为高活力及超稳定的抗氧化酶
〈220〉
〈221〉MUTAGEN
〈222〉（65,120）
〈223〉由半胱氨酸突变为丝氨酸
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（37）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈400〉9
His
-1
Met Gly Thr Ile Tyr Glu Tyr Gly Ala Leu Thr Ile Asp Gly Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Ile Pro Phe Lys Gln Tyr Ala Gly Lys Tyr Val Leu Phe
20 25 30
Val Asn Val Ala Ser Tyr Xaa Gly Leu Thr Gly Gln Tyr Ile Glu
35 40 45
Leu Asn Ala Leu Gln Glu Glu Leu Ala Pro Phe Gly Leu Val Ile
50 55 60
Leu Gly Phe Pro Ser Asn Gln Phe Gly Lys Gln Glu Pro Gly Glu
65 70 75
Asn Ser Glu Ile Leu Pro Thr Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly
80 85 90
Gly Phe Val Pro Asn Phe Gln Leu Phe Glu Lys Gly Asp Val Asn
95 100 105
Gly Glu Lys Glu Gln Lys Phe Tyr Thr Phe Leu Lys Asn Ser Ser
110 115 120
Pro Pro Thr Ser Glu Leu Leu Gly Thr Ser Asp Arg Leu Phe Trp
125 130 135
Glu Pro Met Lys Val His Asp Ile Arg Trp Asn Phe Glu Lys Phe
140 145 150
Leu Val Gly Pro Asp Gly Ile Pro Ile Met Arg Trp His His Arg
155 160 165
Thr Thr Val Ser Asn Val Lys Met Asp Ile Leu Ser Tyr Met Arg
170 175 180
Arg Gln Ala Ala Leu Gly Val Lys Arg Lys
185 190
〈210〉10
〈211〉191
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（-1）...（190）
〈223〉由人GPx3氨基酸序列突变得到，作为高活力及超稳定的抗氧化酶
〈220〉
〈221〉MUTAGEN
〈222〉（65）
〈223〉由半胱氨酸突变为丙氨酸
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（37）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈220〉
〈221〉MUTAGEN
〈222〉（120）
〈223〉由半胱氨酸突变为丝氨酸
〈400〉10
His
-1
Met Gly Thr Ile Tyr Glu Tyr Gly Ala Leu Thr Ile Asp Gly Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Ile Pro Phe Lys Gln Tyr Ala Gly Lys Tyr Val Leu Phe
20 25 30
Val Asn Val Ala Ser Tyr Xaa Gly Leu Thr Gly Gln Tyr Ile Glu
35 40 45
Leu Asn Ala Leu Gln Glu Glu Leu Ala Pro Phe Gly Leu Val Ile
50 55 60
Leu Gly Phe Pro Ala Asn Gln Phe Gly Lys Gln Glu Pro Gly Glu
65 70 75
Asn Ser Glu Ile Leu Pro Thr Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly
80 85 90
Gly Phe Val Pro Asn Phe Gln Leu Phe Glu Lys Gly Asp Val Asn
95 100 105
Gly Glu Lys Glu Gln Lys Phe Tyr Thr Phe Leu Lys Asn Ser Ser
110 115 120
Pro Pro Thr Ser Glu Leu Leu Gly Thr Ser Asp Arg Leu Phe Trp
125 130 135
Glu Pro Met Lys Val His Asp Ile Arg Trp Asn Phe Glu Lys Phe
140 145 150
Leu Val Gly Pro Asp Gly Ile Pro Ile Met Arg Trp His His Arg
155 160 165
Thr Thr Val Ser Asn Val Lys Met Asp Ile Leu Ser Tyr Met Arg
170 175 180
Arg Gln Ala Ala Leu Gly Val Lys Arg Lys
185 190
〈210〉11
〈211〉191
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（-1）...（190）
〈223〉由人GPx3氨基酸序列突变得到，作为高活力及超稳定的抗氧化酶
〈220〉
〈221〉MUTAGEN
〈222〉（65）
〈223〉由半胱氨酸突变为丝氨酸
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（30）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈220〉
〈221〉MUTAGEN
〈222〉（120）
〈223〉由半胱氨酸突变为丙氨酸
〈400〉11
His
-1
Met Gly Thr Ile Tyr Glu Tyr Gly Ala Leu Thr Ile Asp Gly Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Ile Pro Phe Lys Gln Tyr Ala Gly Lys Tyr Val Leu Phe
20 25 30
Val Asn Val Ala Ser Tyr Xaa Gly Leu Thr Gly Gln Tyr Ile Glu
35 40 45
Leu Asn Ala Leu Gln Glu Glu Leu Ala Pro Phe Gly Leu Val Ile
50 55 60
Leu Gly Phe Pro Ser Asn Gln Phe Gly Lys Gln Glu Pro Gly Glu
65 70 75
Asn Ser Glu Ile Leu Pro Thr Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly
80 85 90
Gly Phe Val Pro Asn Phe Gln Leu Phe Glu Lys Gly Asp Val Asn
95 100 105
Gly Glu Lys Glu Gln Lys Phe Tyr Thr Phe Leu Lys Asn Ser Ala
110 115 120
Pro Pro Thr Ser Glu Leu Leu Gly Thr Ser Asp Arg Leu Phe Trp
125 130 135
Glu Pro Met Lys Val His Asp Ile Arg Trp Asn Phe Glu Lys Phe
140 145 150
Leu Val Gly Pro Asp Gly Ile Pro Ile Met Arg Trp His His Arg
155 160 165
Thr Thr Val Ser Asn Val Lys Met Asp Ile Leu Ser Tyr Met Arg
170 175 180
Arg Gln Ala Ala Leu Gly Val Lys Arg Lys
185 190
〈210〉12
〈211〉191
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（-1）...（190）
〈223〉由人GPx3氨基酸序列突变得到，作为高活力及超稳定的抗氧化酶
〈220〉
〈221〉MUTAGEN
〈222〉（65,120）
〈223〉由半胱氨酸突变为丙氨酸
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（37）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈400〉12
His
-1
Met Gly Thr Ile Tyr Glu Tyr Gly Ala Leu Thr Ile Asp Gly Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Ile Pro Phe Lys Gln Tyr Ala Gly Lys Tyr Val Leu Phe
20 25 30
Val Asn Val Ala Ser Tyr Xaa Gly Leu Thr Gly Gln Tyr Ile Glu
35 40 45
Leu Asn Ala Leu Gln Glu Glu Leu Ala Pro Phe Gly Leu Val Ile
50 55 60
Leu Gly Phe Pro Ala Asn Gln Phe Gly Lys Gln Glu Pro Gly Glu
65 70 75
Asn Ser Glu Ile Leu Pro Thr Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly
80 85 90
Gly Phe Val Pro Asn Phe Gln Leu Phe Glu Lys Gly Asp Val Asn
95 100 105
Gly Glu Lys Glu Gln Lys Phe Tyr Thr Phe Leu Lys Asn Ser Ala
110 115 120
Pro Pro Thr Ser Glu Leu Leu Gly Thr Ser Asp Arg Leu Phe Trp
125 130 135
Glu Pro Met Lys Val His Asp Ile Arg Trp Asn Phe Glu Lys Phe
140 145 150
Leu Val Gly Pro Asp Gly Ile Pro Ile Met Arg Trp His His Arg
155 160 165
Thr Thr Val Ser Asn Val Lys Met Asp Ile Leu Ser Tyr Met Arg
170 175 180
Arg Gln Ala Ala Leu Gly Val Lys Arg Lys
185 190
Claims (3)
1.一种高活力小分子量谷胱甘肽过氧化物酶GPX3突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No:1～SEQ ID No:4之一所示。
2.一种高活力小分子量谷胱甘肽过氧化物酶GPX3突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No:5～SEQ ID No:8之一所示。
3.一种高活力小分子量谷胱甘肽过氧化物酶GPX3突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No:9～SEQ ID No:12之一所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710989578.8A CN107603962A (zh) | 2017-10-23 | 2017-10-23 | 一种高活力小分子量谷胱甘肽过氧化物酶gpx3突变体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710989578.8A CN107603962A (zh) | 2017-10-23 | 2017-10-23 | 一种高活力小分子量谷胱甘肽过氧化物酶gpx3突变体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107603962A true CN107603962A (zh) | 2018-01-19 |
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ID=61078838
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710989578.8A Pending CN107603962A (zh) | 2017-10-23 | 2017-10-23 | 一种高活力小分子量谷胱甘肽过氧化物酶gpx3突变体 |
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|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111729075A (zh) * | 2020-08-10 | 2020-10-02 | 吉林大学 | 重组谷胱甘肽过氧化物酶在制备抗氧化抗衰老保健品和药物或抗心肌梗死药物中的应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103320406A (zh) * | 2013-07-18 | 2013-09-25 | 吉林大学 | 高活力谷胱甘肽过氧化物酶gpx1突变体及其制备方法 |
| CN103881988A (zh) * | 2014-04-19 | 2014-06-25 | 吉林大学 | 高活力谷胱甘肽过氧化物酶gpx3突变体及其制备方法 |
| US20140377839A1 (en) * | 2012-06-21 | 2014-12-25 | Aron S. Workman | Monoatomic point mutant artificial oxidoreductases |
| CN104651329A (zh) * | 2014-02-18 | 2015-05-27 | 吉林大学 | 一种含有丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶gpx2突变体及其制备方法 |
-
2017
- 2017-10-23 CN CN201710989578.8A patent/CN107603962A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TUFT STAVNES H等: "Homo sapiens glutathione peroxidase 3 (GPX3), mRNA", 《GENBANK NM_002084》 * |
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