CN108218966B

CN108218966B - 一种人工改造HtA蛋白及其编码基因与应用

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Publication number: CN108218966B
Application number: CN201810085973.8A
Authority: CN
Inventors: 李洪波; 康陆鸿; 蒋鹰
Original assignee: Huaihua University
Current assignee: Feng Wu
Priority date: 2018-04-06
Filing date: 2018-04-06
Publication date: 2019-10-08
Anticipated expiration: 2038-04-06
Also published as: CN108218966A

Abstract

本发明涉及一种人工改造HtA蛋白及其编码基因与应用，本发明提供的蛋白是由序列表1所示的一种经分子改造的源自汤普森多毛菌的核糖体毒素蛋白质分子，该蛋白质所对应的基因，是如下（1）‑（3）中的任一种DNA分子：（1）由序列表中序列2所示的DNA分子；（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码具有杀虫活性的蛋白的DNA分子；（3）与（1）限定的DNA序列至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有杀虫活性的蛋白的DNA分子。本发明优化了该杀虫毒蛋白的DNA序列，并提供了一种可以高效表达且纯化HtA重组蛋白的方法，对于抗虫领域，特别是培育抗虫植物品种有重要的价值，对提高农作物的产量具有重要的意义。

Description

一种人工改造HtA蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种经分子改造的源自汤普森多毛菌的核糖体毒素HtA重组基因及其制备蛋白的方法与应用。

背景技术

汤普森多毛菌（Hirsutella thompsonii）是一种真菌杀螨剂，早在上世纪70年代就被用来防治螨等害虫。近年来的研究发现，汤普森多毛菌产生的糖体毒素（HtA）与其杀虫活性之间存在紧密联系，其发酵液也存在杀虫活性，而从发酵液中纯化的核糖体毒素同样能杀死昆虫害虫。虽然该毒素表现了较强的杀虫活性，但为了能提高其应用价值天然毒素的杀虫活性仍需待提高，尤其是提高其口服杀虫活性。而提高毒素活性的最可行的方法之一就是对其加以分子改造。经过筛选，本发明从几十种改造后的HtA人工蛋白分子中获得了一种经过人工改造的HtA蛋白，该改造后的蛋白较天然HtA的杀虫活性大大增强尤其是口服活性得到了更为明显的提高。这些改造蛋白都是利用化学方法根据氨基酸的一级结构化学合成的，化学合成人工改造的HtA蛋白价格十分昂贵且周期较长，因此无法大量化学合成人工改造的HtA。为进一步研究该人工改造的HtA毒素对不同害虫的杀虫效果，这就需要建立一种高效的外源基因蛋白质表达体系。因此，建立高效的外源基因表达系统及其蛋白的制备方法将有助于解决无法获得大量蛋白的瓶颈。

而当前的大肠杆菌表达该蛋白还存在明显的不足之处：现有技术将毒素构建表达载体，然后转化到E. coli BL21(DE3)进行表达，但得到的都是无活性的包涵体，通过在体外合适的条件下进行溶解、变性、复性和纯化，从每升培养基仅能得到微量的可溶性蛋白质，生产量低。因此，通过改造毒素的DNA序列且优化其表达和纯化方法来高效生产重组蛋白将可以彻底解决该分子改造HtA蛋白在活性测定、杀虫谱分析和在抗虫中的应用等问题。因此，本发明不仅获得了一种可以提高杀虫活性的经分子改造的HtA蛋白质分子及其基因而且还提供一种可以大量制备该杀虫毒蛋白的可行方法。

发明内容

针对HtA蛋白的杀虫活性有待提高尤其是口服杀虫活性需要提升的需要，本发明的目的之一在于获得提供一种杀虫活性得到极大提高的人工改造HtA蛋白质分子，该蛋白质分子是由序列表中序列1所示一种蛋白质分子。该重组HtA蛋白与天然HtA蛋白质相比，其对昆虫的注射活性提高数倍以上；同时，该人工改造HtA蛋白与天然HtA蛋白质相比产生了明显的口服杀虫活性。

另外，针对现有技术中的缺陷，本发明的另一目的在于提供一种人工HtA蛋白的基因及重组蛋白的制备方法与应用。

本发明提供基因，为编码人工重组HtA蛋白的基因，为如下（1）-（3）中任意一种的DNA分子：

（1）由序列表中序列2所示的DNA分子；

（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码具有毒杀昆虫活性的蛋白的DNA分子；

（3）与（1）限定的DNA序列至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有毒杀昆虫活性的蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5 M Na₃PO₄和1 mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5 MNa₃PO₄和1 mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5 M Na₃PO₄和1 mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5 ×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5 M Na₃PO₄和1 mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5 M Na₃PO₄和1 mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1% SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5% SDS的溶液中，在65^oC下杂交,然后用2×SSC,0.1% SDS和1×SSC,0.1% SDS各洗膜一次。

其中，序列表中的序列2由462个脱氧核苷酸组成，本序列包括人工改造的HtA基因的读码框、克隆用双酶切位点、组氨酸标签和止密码子等，编码具有序列表中序列1的147个氨基酸残基序列的蛋白质。

由上述序列表中的序列1编码得到的蛋白属于本发明的保护范围。

本发明提供蛋白，是如下（1）或（2）：

（1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（2）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有毒杀昆虫活性的由序列2衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由462个脱氧核苷酸组成，本序列包括人工改造的HtA基因（RHtA）的读码框、克隆用双酶切位点、组氨酸标签和止密码子等。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体具体为将上述基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。所述重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体pPICZαA的XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

本发明的第三个目的是提供一种制备蛋白的方法，包括以下步骤：

S1：将权利要求2所述的基因和表达载体pPICZα分别用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切并纯化回收，然后利用连接酶在16°C连接，得重组载体pPICZαA-RHtA；

S2：将所述重组载体pPICZαA-RHtA用SacⅠ单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆；

S3：将所述阳性克隆转接至含有1000~1500 μg/mL Zeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，将所述高抗性转化子用BMGY培养基培养至OD₆₀₀为10~15，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1.0%~1.5%，诱导72小时收集发酵的上清液。

S4：扩大培养采用在28°C继续诱导培养72小时，每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1.0%~1.5%。

S5：将所述S4培养获得的发酵液利用NaOH调节pH在7.8~8.2以大于或等于15000 g的转速离心10~20分钟，将获得的上清液上样到经pH在7.8~8.2 50 mMPBS缓冲液平衡后的镍亲合层析柱，用5~10倍层析柱体积的7.8~8.2的含20 mM 咪唑和100 ~300 mM NaCl的PBS缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱；

S6：用含400 mM 咪唑和100 ~300 mM NaCl的PBS缓冲液洗脱所述所述镍亲合层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为10 kDa的透析袋于20 mM PBS缓冲液中透析，然后超滤浓缩，将所述超滤浓缩得到的产品在-80°C下速冻，然后冷冻干燥。

根据上述任一种制备蛋白的方法制备得到的蛋白也属于本发明的保护范围。

通过步骤S3筛选得到的稳定且能高水平分泌表达核糖体毒素HtA的酵母转化子也属于本发明保护的范围。

上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗虫领域中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第三个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是将上述蛋白的编码基因导入到目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的抗虫性高于所述目的植物。

上述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。将所述基因导入目的植物，会使所述蛋白质目的植物中合成，进而是目的植物的抗虫性能得到改良。

本发明还提供一种培育转基因病毒的方法，是将上述蛋白的编码基因转入到目的病毒中，得到转基因病毒，所述转基因病毒的抗虫性高于所述目的病毒，所述目的病毒优选为杆状病毒、核型多角体病素和质型多角体病毒中的一种。

本发明提供的重组蛋白生产的技术方案具有以下优点：一是根据本技术方案所述的表达方法分泌表达和纯化得到的具有更高生物活性的重组HtA能够有效防止宿主菌对表达产物的降解，减轻宿主细胞代谢的负荷和表达产物对宿主的毒性作用；二是利用酵母载体pPICZαA-RHtA上的分泌信号α-因子信号肽引导目的蛋白的基因分泌表达，目的蛋白会大量分泌到培养液中，且能形成准确的空间结构，从而保持重组HtA的活性；三是通过筛选得到了稳定且能高水平分泌表达得HtA的酵母转化子；四是摸索出用真核宿主毕赤酵母来表达人工改造的核糖体毒素HtA的方法和快速高效纯化人工改造的核糖体毒素HtA的方法，可以降低成本且实现大量生产；五是纯化的重组蛋白对昆虫害虫具有显著增强的杀虫活性尤其是产生了口服杀虫活性。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例中的真核表达载体pPICZαA-RHtA构建示意图；

图2为本发明实施例中高水平分泌表达重组RHtA的酵母转化子的SDS-PAGE检测结果图；

图3为本发明实施例中在甲醇诱导下不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图；

图4为本发明实施例中洗脱所得纯化得RHtA蛋白的SDS-PAGE检测结果图；

图5为本发明实施例中纯化RHtA蛋白浓缩后的SDS-PAGE检测结果图；

图6为本发明实施例中优化后的重组HtA蛋白的细胞水平生物学活性结果示意图；

图7为本发明实施例中优化后重组HtA蛋白的昆虫注射水平生物学活性结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明选用毕赤酵母菌株和整合性表达质粒pPICZαA均购自美国Invritrogen公司。

所用培养基配方如下：

1）酵母生长培养基（BMGY）：

完全溶解10 g 酵母提取物，20 g 蛋白胨，定容到800 mL。121 ℃蒸气高压灭菌15-20 min，冷却到室温，加入100 mL 1 M磷酸钾溶液，100 mI YNB，2 mL 500×生物素，20mL 50%灭菌甘油；

2）酵母诱导培养基（BMMY）

完全溶解10 g 酵母提取物，20 g蛋白胨，定容到800 mL。121 ℃蒸气高压灭菌15-20 min，冷却到室温，加入100 mL 1 M磷酸钾溶液，100 mL YNB，2 mL500×生物素，10 mL甲醇；

3）YPD培养基

完全溶解10 g 酵母提取物，20 g蛋白胨，定容到900 mL，121 ℃蒸气高压灭菌15-20 min，冷却至70℃左右再加入100 mL20%灭菌葡萄糖溶液。在其中加入1.5-1.8%的琼脂可制得YPD固体培养基。

实施例一

本实施例提供了一种人工改造的HtA蛋白质，这种人工改造的蛋白是从几十种经改造的HtA蛋白中筛选出来的。这些蛋白是利用化学方法合成的多肽。一种人工改造的HtA蛋白质人具体序列如序列表中的序列1所示。人工改造的HtA蛋白与天然序列HtA蛋白质相比，其在细胞水平和昆虫动物水平都有显著更高的生物活性。

将本实施例利用多肽化学合成的办法分别得到改造的HtA蛋白和天然序列的HtA蛋白，并对以上合成的蛋白质进行生物学活性分析，具体分析方法和结果如下。

实验方法一：在10 cm 培养皿中将昆虫细胞SF9于昆虫细胞培养基中培养至90%生长密度，胰酶消化并将细胞浓度调整至5×10⁵ cell/mL，向 96孔细胞培养板中每孔加入100 μl的昆虫SF9细胞悬液，培养过夜后，向各培养孔分别加入不同终浓度的人工改造的HtA蛋白和天然序列HtA蛋白(0、1、5、10、20 ng/mL ) ，每个浓度3个平行孔，将上述细胞于标准条件下培养48小时，MTT法测定细胞的生长成况。

实验结果一：表1为本发明实施例中人工改造的HtA蛋白与天然HtA蛋白对SF9细胞增殖活性测定结果。如表1所示，与天然序列HtA蛋白相比，在1 ng/mL时人工改造的HtA蛋白所测得的吸光值与5 ng/mL时天然序列的HtA蛋白抑制昆虫细胞SF9的生长所测得的吸光值相近；在5 ng/mL时人工改造的HtA蛋白所测得的吸光值与20 ng/mL时天然序列的HtA蛋白抑制昆虫细胞SF9的生长所测得的吸光值相近；当浓度大于10 ng/mL时人工改造的HtA蛋白所测得的对应孔的吸光值已经接近于0，说明细胞已无活细胞存在，而对照20 ng/mL的天然HtA蛋白对应孔的吸光值为0.15。细胞增殖活性测定结果表明，本发明所采用的工改造的HtA蛋白具有较天然序列的HtA蛋白具有更高的生物学活性。

表1 细胞水平生物学活

实验方法二：用PBS将化学合成的人工改造HtA蛋白和天然序列HtA蛋白都稀释至1mg/mL，按4 μg/g体重注射大腊螟幼虫（0.3 ±0.05g），每组30只，各注射3组；同时以注射相同体积PBS的大腊螟幼虫为对照，统计大腊螟幼虫的死亡情况。

实验结果二：注射人工改造的HtA蛋白与注射天然HtA蛋白的大腊螟的死亡情况如表2所示。人工改造的HtA蛋白在注射6小时后就有虫子死亡，而天然序列的HtA蛋白在注射12小时后才检测到虫子死亡；人工改造的HtA蛋白在注射24小时后检测到的死亡率达到100%，天然序列的HtA蛋白在注射48小时后仍有虫子存活，而注射PBS的对照组在注射后没有虫子死亡。因此，昆虫注射实验结果表明，人工改造的HtA蛋白比天然HtA蛋白具有更强的注射活性。大腊螟幼虫注射死亡率具体结果如表2所示：

表2 注射生物学活

实验方法三：用PBS将化学合成的人工改造HtA蛋白与天然序列HtA蛋白都稀释至2mg/mL，按20 μL/cm²均匀涂布到小白菜菜叶上，口服小菜夜蛾幼虫（100 ±20 mg），每组25只，各口服4组；同时以口服相同体积PBS涂布的菜叶为对照，统计夜蛾幼虫的死亡率。

实验结果三：口服化学合成的人工改造HtA蛋白与天然HtA蛋白的小菜夜蛾幼虫的死亡情况如表3所示。人工改造的HtA蛋白在口服3天后就有虫子死亡，而天然序列HtA蛋白在口服3天后未检测到虫子死亡；人工改造HtA蛋白在口服5天后检测到的死亡率达到25%，而天然序列HtA蛋白在口服5天后仍未检测到虫子死亡；人工改造HtA蛋白在口服7天后检测到的死亡率达到44%，而天然序列HtA蛋白在口服7天后的死亡率仍为0，口服PBS的对照组在口服7天后同样没有虫子死亡。因此，昆虫口服杀虫实验结果表明，人工改造HtA蛋白产生了口服活性。小菜夜蛾幼虫口服死亡率具体结果如表3所示：

表3 口服生物学活

实施例二

本实施例提供了一种优化的化学合成的人工改造后的HtA基因，具体序列如序列表中的序列2所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的序列1所示。优化后的DNA序列经NCBI比对，没有找到明显相似性的DNA序列。

将人工改造后的HtA蛋白对应的DNA连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上，得到重组载体，然后利用Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法分别将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌X-33中，转化后分别用含有100 µg/mL Zeocin抗生素的YPD平板进行筛选，利用PCR对转化子进行验证，将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线分别接种至含有不同浓度的 Zeocin抗生素的YPD平板，筛选得到高抗性的毕赤酵母转化子，然后分别用BMMY小量诱导表达，再进行SDS-PAGE分析。分析结果显示人工合成的DNA构建得到的毕赤酵母转化子能表达并分泌目标蛋白。

实施例三

本实施例提供一种制备蛋白的方法，具体包括如下步骤：

S1：构建表达载体及转化：将实施例一的优化后的人工合成的DNA连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA，得到重组载体pPICZαA-RHtA，载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的真核表达载体pPICZαA- RHtA构建示意图。主要的载体构建步骤优选如下：

（1）用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切含合成的HtA基因的质粒，获得目的片断，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：

含合成的RHtA基因的质粒 15 μL

10×M 缓冲液 5 μL

XhoⅠ 5 U

XbaⅠ 5 U

无菌水至50 μL

（2）用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切pPICZαA，获得载体片断，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：

质粒pPICZαA 15 μL

10×M 缓冲液 5μL

XhoⅠ 5U

XbaⅠ 5U

无菌水至50μL

（3）将步骤（1）和（2）得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行；

（4）将步骤（3）回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶（购自大连TAKARA公司）进行连接反应，目的基因准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下：

载体pPICZαA片段 1 μL

目的片段落 3 μL

10× 缓冲液 1 μL

T4连接酶 0.5 μL

无菌水至10 μL

S2：重组质粒的转化：将所述重组载体pPICZαA-HtA用SacⅠ单酶切线性化，按照Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法，将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌中，本实施例选用的是X-33。转化后用含有100 µg/mL Zeocin抗生素的YPD平板进行筛选，利用PCR对转化子进行验证。

S3：高水平分泌表达酵母转化子的筛选和蛋白的表达：将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线接种至含有不同浓度的 Zeocin抗生素的YPD平板，筛选得到1000-1500 µg/mL高Zeocin抗性的转化子，将高抗性的转化子用BMMY小量诱导表达，筛选得到高水平分泌表达目标蛋白的转化子，选取高水平分泌表达的酵母转化子单菌落，接种至装有50 mL YPD液体培养基的250 mL三角瓶中，在28℃，300 rpm培养条件下培养至菌体OD₆₀₀=6.0，取上述菌液，接种至含500 mL BMGY培养基的2 L摇瓶中，每甁接种5 mL，于28℃，250 rpm培养至OD₆₀₀=12；室温下2500 g离心5 min，收集菌体，用1/7原培养体积的BMMY重悬菌体，向培养基中添加100%甲醇至终浓度（质量分数）为1-1.5%，诱导24小时，在28°C继续诱导培养72小时，每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1-1.5%，收集发酵的上清液。

需要说明的是，将高Zeocin抗性的转化子用BMMY小量诱导表达，经SDS-PAGE分析，从6株高抗性(抗性水平大于或等于1000 µg/mL Zeocin)转化子中筛选得到了高水平分泌表达人工改造的HtA蛋白的酵母转化子，转化子筛选的SDS-PAGE结果如图2所示，结果表明，获得了高表达的酵母转化子。

利用筛选到的高表达转化子，经BMGY生长培养后收集菌体再用BMMY进行诱导表达，每24小时添加一次加醇至终深度在1.0%~1.5%，共诱导4天，每天取样一次。利用SDS-PAGE检测甲醇诱导下不同时间目标蛋白表达情况分析，电泳结果如图3所示，结果表明经诱导1~4天，在大于15 kDa左右均有明显目的蛋白表达，且通过继续补加甲醇，诱导得到的目的蛋白含量更高，但诱导时间超过3天目标蛋白的表达量反而开始下降，具体目的蛋白占全菌分泌蛋白的总量结果如下表4所示。

表4 不同诱导时间得到的目的蛋白占上清液蛋白的百分比含量结果

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					百分比含量（%）	8	16	27	22

实施例四

本实施例提供一种纯化人工改造的HtA蛋白的方法，在步骤S3之后，具体还包括如下步骤：

S4：扩大培养采用在28°C继续诱导培养72小时，每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1%~1.5%。

S5：将所述S4扩大培养获得的发酵液利用NaOH调节pH在7.8~8.2以大于或等于15000 g的转速离心10~20分钟，将获得的上清液上样到经pH在7.8~8.2 50 mM 的PBS缓冲液平衡后的镍亲合层析柱，用5~10倍层析柱体积的7.8~8.2的含20 mM 咪唑和100 ~300 mMNaCl的PBS缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱；

S6：用含400 mM 咪唑和100 ~300 mM NaCl的PBS缓冲液洗脱所述镍亲合层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为10 kDa的透析袋于20 mM PBS缓冲液中透析，然后超滤浓缩，将所述超滤浓缩得到的产品在-80°C下速冻，然后冷冻干燥。

需要说明的是，将步骤S6洗脱下来的纯化蛋白进行SDS-PAGE分析，结果如图4所示，图4为本发明实施例中可以看出洗脱得到了纯化的目标蛋白。将洗脱液利用分子量10kDa的透析袋于10 mM Tris-HCl缓冲液中透析后利用截留分子量10 kDa的15 mL超滤管将样品浓缩20倍。取20微克的纯化蛋白，SDS-PAGE检测结果如图5所示，仅在目标位有蛋白条带，说明得到了高纯度的人工改造的HtA重组蛋白。

将本实施例得到酵母表达的人工改造HtA蛋白进行生物学活性分析，具体分析方法和结果如下。

实验方法一：在10 cm 培养皿中将昆虫细胞SF9于昆虫细胞培养基中培养至90%生长密度，胰酶消化并将细胞浓度调整至5×10⁵ cell/mL，向 96孔细胞培养板中每孔加入100 μl的昆虫SF9细胞悬液，培养过夜后，向各培养孔分别加入不同终浓度的化学合成的人工改造的HtA蛋白、化学合成的天然序列HtA蛋白和利用酵母表达的人工改造的HtA蛋白(0、1、5、10、20 ng/mL ) ，每个浓度3个平行孔，将上述细胞于标准条件下培养48小时，MTT法测定细胞的生长成况。

实验结果一：表5为本发明实施例中化学合成的人工改造HtA蛋白、利用酵母表达的人工改造的HtA蛋白和化学合成的天然序列HtA蛋白对SF9细胞增殖活性测定结果。如表5所示，与天然序列HtA蛋白相比，在1 ng/mL时人工改造的化学合成的HtA蛋白和从酵母中纯化的人工改造HtA蛋白所测得的吸光值与5 ng/mL时天然序列的HtA蛋白抑制昆虫细胞SF9的生长所测得的吸光值相近；在5 ng/mL时化学合成的人工改造HtA蛋白及从酵母中纯化的人工改造HtA蛋白所测得的吸光值与20 ng/mL时天然序列的HtA蛋白抑制昆虫细胞SF9的生长所测得的吸光值相近；当浓度大于10 ng/mL时化学合成的人工改造HtA蛋白及从酵母中纯化的人工改造HtA蛋白所测得的对应孔的吸光值都已经接近于0，说明细胞已无活细胞存在，而对照20 ng/mL的天然HtA蛋白对应孔的吸光值为0.17。细胞增殖活性测定结果表明，本发明所采用的化学合成的人工改造HtA蛋白及从酵母中纯化的人工改造HtA蛋白均较天然序列的HtA蛋白具有更高的生物学活性且化学合成的人工改造HtA蛋白与从酵母中纯化的人工改造HtA蛋白的生物学活性非常接近，这说明从酵母中纯化的人工改造HtA蛋白具有很强的生物学活性。

表5 细胞水平生物学活

实验方法二：用PBS将化学合成的人工改造HtA蛋白、从酵母中纯化的人工改造HtA蛋白和化学合成的天然序列HtA蛋白稀释至1 mg/mL，按4 μg/g体重注射大腊螟幼虫（0.3±0.05g），各注射40只，统计注射后的大腊螟幼虫死亡情况。

实验结果二：注射化学合成的人工改造HtA蛋白、从酵母中纯化的人工改造HtA蛋白和化学合成的天然序列HtA蛋白的大腊螟的死亡情况如表6所示。化学合成的人工改造HtA蛋白和从酵母中纯化的人工改造HtA蛋白在注射6小时后就有虫子死亡，而天然序列的HtA蛋白在注射12小时后才检测到虫子死亡；化学合成的人工改造HtA蛋白和从酵母中纯化的人工改造HtA蛋白在注射24小时后检测到的死亡率达到100%，天然序列的HtA蛋白在注射48小时后仍有虫子存活。因此，动物注射实验结果表明，化学合成的人工改造HtA蛋白和从酵母中纯化的人工改造HtA蛋白比天然HtA蛋白具有更强的注射活性，并且化学合成的人工改造HtA蛋白与从酵母中纯化的人工改造HtA蛋白具有相似的生物学活性。大腊螟幼虫注射死亡率具体结果如表6所示：

表6 注射生物学活

实验方法三：用PBS将化学合成的人工改造HtA蛋白、从酵母中纯化的人工改造HtA蛋白和化学合成的天然序列HtA蛋白稀释至2 mg/mL，按20 μL/cm²均匀涂布到小白菜菜叶上，口服小菜夜蛾幼虫（100 ±20 mg），每组25只，各口服4组；同时以口服相同体积PBS涂布的菜叶为对照，统计夜蛾幼虫的死亡率。

实验结果三：口服化学合成的人工改造HtA蛋白、从酵母中纯化的人工改造HtA蛋白和化学合成的天然序列HtA蛋白的供试虫子的死亡情况如表7所示。口服化学合成的人工改造HtA蛋白和从酵母中纯化的人工改造HtA蛋白在口服3天后就有虫子死亡，而天然序列的HtA蛋白在口服3天后未检测到虫子死亡；口服化学合成的人工改造HtA蛋白和从酵母中纯化的人工改造HtA蛋白在口服5天后检测到的死亡率都超过了20%，而天然序列的HtA蛋白在口服5天后仍未检测到虫子死亡；口服化学合成的人工改造HtA蛋白和从酵母中纯化的人工改造HtA蛋白在口服7天后检测到的死亡率都超过46%，而天然序列的HtA蛋白在口服7天后的死亡率仍为0。因此，动物口服实验结果表明，口服化学合成的人工改造HtA蛋白和从酵母中纯化的人工改造HtA蛋白有杀虫活性且活性比较接近，而化学合成的天然序列HtA蛋白没有口服杀虫活性。小菜夜蛾幼虫口服死亡率具体结果如表7所示：

表7 口服生物学活

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 怀化学院

<120> 一种人工改造HtA蛋白及其编码基因与应用

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 147

<212> PRT

<213> Hirsutella thompsonii

<400> 1

His His His His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro

1 5 10 15

Gln Ala Pro Ile Val Thr Cys Lys Pro Lys Leu Asp Gly Lys Glu Lys

20 25 30

Pro Phe Lys Val Asp Val Ala Thr Ala Gln Ala Gln Ala Lys Lys Ala

35 40 45

Gly Leu Thr Thr Gly Lys Ser Gly Asp Pro His Lys Tyr Phe Ala Gly

50 55 60

Asp His Ile Lys Trp Gly Val Asn Asn Cys Asp Lys Ala Asp Ala Ile

65 70 75 80

Leu Trp Glu Tyr Pro Ile Tyr Trp Val Gly Lys Asn Ala Glu Trp Ala

85 90 95

Lys Asp Val Lys Thr Ser Gln Gln Lys Gly Gly Pro Thr Pro Ile Lys

100 105 110

Val Val Tyr Ala Asn Ser Arg Gly Ala Val Gln Tyr Cys Gly Val Met

115 120 125

Thr His Ser Lys Val Asp Lys Asn Asn Gln Gly Lys Glu Phe Phe Glu

130 135 140

Lys Cys Asp

145

<210> 2

<211> 462

<212> DNA

<213> Hirsutella thompsonii

<400> 2

ctcgagaaaa gacatcacca tcaccatcac agaagaagga gaagaagaag gagaagacca 60

caagcaccaa tcgtcacctg caaaccaaag ttggacggta aagagaagcc attcaaggtc 120

gacgtcgcaa ctgcacaggc tcaagcaaaa aaggcaggct tgaccaccgg aaagtccggc 180

gacccacaca aatacttcgc aggcgaccac atcaaatggg gtgtcaacaa ctgcgacaag 240

gcagacgcca tcttgtggga gtacccaatc tactgggtcg gcaagaacgc cgagtgggca 300

aaggacgtca agacctccca gcagaagggt ggaccaaccc caatcaaagt tgtctacgca 360

aactccagag gcgcagtcca atactgcggc gtcatgaccc actccaaggt cgacaagaac 420

aaccagggca aggagttctt cgagaagtgc gactaatcta ga 462

Claims

1.一种人工改造的HtA蛋白，其特征在于，是序列表中序列1所示一种蛋白质分子。

2.一种基因，其特征在于，是序列表中序列2所示的DNA分子。

3.含有权利要求2所述基因的重组载体、表达盒或重组菌；

所述重组载体为将权利要求2所述基因插入表达载体pPICZαA的Xho I和Xba I酶切位点间，得到表达权利要求1所述蛋白的重组载体。

4.一种利用权利要求2所述的基因制备蛋白的方法，包括以下步骤：

S1：将权利要求2所述的基因和表达载体pPICZα分别用Xho I和Xba I双酶切并纯化回收，然后利用连接酶在16℃连接，得重组载体pPICZαA-HtA；

S2：将所述重组载体pPICZαA-HtA用Sac I单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆；

S3：将所述阳性克隆转接至含有1000～1500μg/mL Zeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，将所述高抗性转化子用BMGY培养基培养至OD₆₀₀为10～15，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1.0％～1.5％，诱导72小时收集发酵的上清液。

5.根据权利要求4所述的制备蛋白的方法，其特征在于：在步骤S3之后，还包括如下步骤：

S4：将所述上清液利用NaOH调节pH在7.8～8.2以大于或等于15000g的转速离心10～20分钟，将获得的上清液上样到经pH在7.8～8.2 50mMPBS缓冲液平衡后的镍亲合层析柱，用5～10倍层析柱体积的7.8～8.2的含20mM咪唑和100～300mM NaCl的PBS缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱；

S5：用含400mM咪唑和100～300mM NaCl的PBS缓冲液洗脱所述镍亲合层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为10kDa的透析袋于20mM PBS缓冲液中透析，然后超滤浓缩，将所述超滤浓缩得到的产品在-80℃下速冻，然后冷冻干燥。

6.权利要求1所述蛋白、权利要求2所述基因或权利要求3所述重组载体、表达盒或重组菌在抗虫领域中的应用。