CN107603950A - 一种小鼠髓源树突状细胞分离及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种小鼠髓源树突状细胞分离及培养方法，包括步骤：(a)腹腔注射戊巴比妥钠处死小鼠，剪刀取下小鼠的双下肢股骨，去除毛皮后及多余的肌肉，将剥除肌肉后的股骨置于酒精中浸泡消毒；(b)冲洗髓腔收集骨髓悬液，连续筛网过滤，Ficoll分离，离心获取细胞沉淀；(c)完全培养基1重悬细胞沉淀，接种，差速贴壁法结合半量更换完全培养基2获得骨髓源树突状细胞；(d)特异性免疫磁珠分选得到纯化的骨髓源树突状细胞。本发明提供了一种简单、高效、稳定的分离纯度及存活率高的髓源树突状细胞的方法。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种小鼠髓源树突状细胞分离及培养方法。
背景技术
树突状细胞(Dendritic cells，DC)作为机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells，APC)，能够高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，启动特异性免疫应答。本发明旨在提供一种高效分离培养纯度及存活率高的髓源树突状细胞的方法。
发明内容
本发明的目的是建立一种简单、稳定、高效，且获得纯度高，存活率高的小鼠髓源树突状细胞分离培养的方法。
为了解决上述所涉及到的问题，本发明采取如下方法获得小鼠髓源树突状细胞：
小鼠髓源树突状细胞分离方法的步骤包括：(a)腹腔注射戊巴比妥钠处死小鼠，剪刀取下小鼠的双下肢股骨，去除毛皮后及多余的肌肉，将剥除肌肉后的股骨置于酒精中浸泡消毒；(b)冲洗髓腔收集骨髓悬液，连续筛网过滤，Ficoll分离，离心获取细胞沉淀；(c)完全培养基1重悬细胞沉淀，接种，差速贴壁法结合半量更换完全培养基2获得骨髓源树突状细胞；(d)特异性免疫磁珠分选得到纯化的骨髓源树突状细胞。
可选的小鼠为6-8周龄，体重22-28g的小鼠。
可选的筛网过滤的方法为将收集的悬液依次通过80目、100目、200目的筛网。
可选的细胞分离的方法为Ficoll分离法获得小鼠髓源树突状细胞。
可选的完全培养基1为含5％FCS和5％FBS的RPMI-1640培养基。
可选的差速贴壁方法为在37℃培养箱中培养10h-12h，吸弃上清，预冷无血清培养基清洗2-3次，再加入完全培养基继续培养。
可选的完全培养基2含8-10ng/ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、8-10ng/ml重组小鼠白细胞介素-4(IL-4)、2mM谷氨酰胺、50μM的2-ME和5％FCS和5％FBS的RPMI-1640培养基。
可选的半量换液的方法为细胞培养48h后半量更换完全培养基2，轻轻吹打细胞，收集悬浮细胞转移至新的细胞瓶中，继续培养。
可选的特异免疫磁珠纯化方法为将山羊抗兔的免疫磁珠在基础培养基中清洗3次后，在单克隆CD11c抗体中4℃孵育8-12h，完全培养基2清洗3次，加入到权利要求8所述的细胞悬液中，4℃旋转轻摇孵育30-60min后，完全培养基2清洗磁珠2-3次，最后将其加入完全培养基2中，置于37℃、5％(m/v)的CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
本发明提供一种连续筛网过滤结合Ficoll分离，差速贴壁结合半量换液的方法获得小鼠髓源树突状细胞的方法，并利用免疫磁珠进行纯化，不仅操作简便，耗时短，而且获得的髓源树突状细胞纯度高可达95％。
附图说明
图1培养2w的细胞图片(100×)
图2培养2w的细胞图片(200×)
具体实施方式
为了使本发明的目的及优势更清新地展现，现将具体实施方式进一步阐述。此处所阐述的具体实施方式仅针对本发明进行解释，并不用于限定本发明。
本发明选择6-8周龄，体重22-28g的小鼠，分离髓源树突状细胞。具体操作如下：
1、脱颈的方法处死小鼠，剪刀取下小鼠的双下肢股骨，去除毛皮后及多余的肌肉，将剥除肌肉后的股骨置于酒精中浸泡消毒；
2、将股骨两端用无菌剪刀剪去后用10ml注射器配上1ml的针头，从骨髓一段刺入骨髓腔，将骨髓细胞冲入无菌平皿中，反复冲洗骨髓腔至骨头变白，收集骨髓悬液，1500rpm离心10min，弃上清；
3、将得到的细胞沉淀重悬后，依次经过80目、100目、200目的滤网过滤，收集滤液，2000rpm离心10min，弃上清；
4、适量完全培养基1重悬沉淀，用Ficoll-Paque淋巴细胞分离液梯度离心，2000rpm离心15-20min，吸取中间白膜层，PBS洗涤3次后，收集沉淀的骨髓细胞；
5、以含5％FCS和5％FBS的RPMI-1640完全培养基1重悬细胞沉淀，37℃、5％(m/v)的CO2、饱和湿度的培养箱中培养10h-12h，吸弃上清，预冷无血清培养基清洗2-3次；
6、加入含8-10ng/ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、8-10ng/ml重组小鼠白细胞介素-4(IL-4)、2mM谷氨酰胺、50μM的2-ME和5％FCS和5％FBS的RPMI-1640完全培养基2，37℃、5％(m/v)的CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养；
7、培养48h后半量更换完全培养基2，轻轻吹打细胞，收集悬浮细胞转移至新的细胞瓶中，继续培养7d后收集细胞；
8、将山羊抗兔的免疫磁珠在基础培养基中清洗3次后，在单克隆CD11c抗体中4℃过夜孵育，然后在完全培养基2中清洗3次，然后加入到细胞悬液中，4℃旋转轻摇孵育30-60min，然后用完全培养基2清洗磁珠2-3次，最后将其加入完全培养基2中，置于37℃、5％(m/v)的CO2、饱和湿度的培养箱中培养增殖；
9、细胞培养到第3天多数细胞贴壁生长，细胞形态呈小的圆形，但无明显树突状突起。培养至2W左右细胞呈典型的树突状细胞形态，继而呈集落样生长。细胞形态不规则，表面有多个大而长的突起，及一些短小的圆形或椭圆形突起。
以上已经对本发明创造的较佳实施例进行详细阐述，但本发明创造不限定于上述实施例，凡在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种小鼠髓源树突状细胞分离及培养方法，其特征在于，包括步骤：(a)腹腔注射戊巴比妥钠处死小鼠，剪刀取下小鼠的双下肢股骨，去除毛皮后及多余的肌肉，将剥除肌肉后的股骨置于酒精中浸泡消毒；(b)冲洗髓腔收集骨髓悬液，连续筛网过滤，Ficoll分离，离心获取细胞沉淀；(c)完全培养基1重悬细胞沉淀，接种，差速贴壁法结合半量更换完全培养基2获得骨髓源树突状细胞；(d)特异性免疫磁珠分选得到纯化的骨髓源树突状细胞。
2.根据权利要求1所述的小鼠髓源树突状细胞分离及培养方法，其特征在于，所述的小鼠为6-8周龄，体重22-28g的小鼠。
3.根据权利要求1所述的小鼠髓源树突状细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤b中筛网过滤的方法为将收集的悬液依次通过80目、100目、200目的筛网。
4.根据权利要求1所述的小鼠髓源树突状细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤b中收集的细胞滤液经Ficoll分离的方法获得小鼠髓源树突状细胞。
5.根据权利要求1所述的小鼠髓源树突状细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤c中完全培养基1为含5％FCS和5％FBS的RPMI-1640培养基。
6.根据权利要求1所述的小鼠髓源树突状细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤c中差速贴壁方法为在37℃培养箱中培养10h-12h，吸弃上清，预冷无血清培养基清洗2-3次，再加入完全培养基继续培养。
7.根据权利要求1所述的小鼠髓源树突状细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤c中半量换液的完全培养基2含8-10ng/ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、8-10ng/ml重组小鼠白细胞介素-4(IL-4)、2mM谷氨酰胺、50μM的2-ME和5％FCS和5％FBS的RPMI-1640培养基。
8.根据权利要求1所述的小鼠髓源树突状细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤c中细胞半量换液的方法为培养48h后半量更换完全培养基2，轻轻吹打细胞，收集悬浮细胞转移至新的细胞瓶中，继续培养。
9.根据权利要求1所述的小鼠髓源树突状细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤d的特异性免疫磁珠纯化细胞方法为：将山羊抗兔的免疫磁珠在基础培养基中清洗3次后，在单克隆CD11c抗体中4℃孵育8-12h，完全培养基2清洗3次，加入到权利要求8所述的细胞悬液中，4℃旋转轻摇孵育30-60min后，完全培养基2清洗磁珠2-3次，最后将其加入完全培养基2中，置于37℃、5％(m/v)的CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114058585A (zh) * | 2021-12-03 | 2022-02-18 | 无锡市第二人民医院 | 一种小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004059319A1 (fr) * | 2002-12-25 | 2004-07-15 | Pel-Freez Biotechnology (Beijing) Ltd. | Procedes individuels de mesure d'une fonction lymphocytaire specifique |
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2016
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| WO2004059319A1 (fr) * | 2002-12-25 | 2004-07-15 | Pel-Freez Biotechnology (Beijing) Ltd. | Procedes individuels de mesure d'une fonction lymphocytaire specifique |
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| 王宏伟等: "小鼠骨髓源性树突状细胞的体外诱导培养及功能分析", 《感染、炎症、修复》 * |
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| CN114058585A (zh) * | 2021-12-03 | 2022-02-18 | 无锡市第二人民医院 | 一种小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法 |
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