CN107596387A - 金/碳化铁异质纳米颗粒及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种金/碳化铁异质纳米颗粒及其制备方法和应用。所述金/碳化铁异质纳米颗粒具有双面神的异质结构，可作为生物成像探针，通过其进行功能化修饰实现在多模态成像引导下(核磁共振成像/多光谱光声断层扫描成像/电子计算机断层扫描成像)的光热疗探针的应用。使探针特异性靶向肿瘤细胞，能够实现对特定肿瘤细胞的选择性光热杀伤。同时，探针本身所具有的光学和磁学性能，可作为多模态成像的造影剂而监测肿瘤治疗效果。

Description

金/碳化铁异质纳米颗粒及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种金/碳化铁异质纳米颗粒的制备和应用，尤其涉及一种金/碳化铁异质纳米颗粒在多模态成像引导下(核磁共振成像/多光谱光声断层扫描成像/电子计算机断层扫描成像)成像引导的光热疗中的应用。

背景技术

近些年来，精准治疗已经大家的关注点，它包括疾病的准确诊断、准确治疗以及治疗前后的实时监测，从而提高疾病诊治与预防的效益。纳米诊疗技术因为能利用纳米平台将诊断技术和治疗方法结合起来，从而为精确治疗提供了一种有发展潜力的途径。与传统的肿瘤治疗方法相比，光热疗法能够高效地杀死肿瘤细胞而把对正常细胞的伤害降到最低。作为一种微创局部肿瘤治疗手段，它不具备精确治疗的特性而极其需要临床成像手段的辅助。因而，成像手段引导下的光热疗法在精确治疗中可作为很有潜力的发展方向。

现在临床上有多种用于肿瘤诊断的技术，包括核磁共振成像，电子计算机断层扫描成像和正电子发射型计算机断层显像等。其中，核磁共振成像已成为临床上最可靠地临床技术之一，可以立体地显示机体解剖结构。多光谱光声断层扫描成像是一种新兴的成像模式，利用生物组织对光的吸收分布反映组织结构，从而区分正常组织和病变组织。电子计算机断层扫描成像因其高效、低成本和高分辨率等特点如今已成为医院中最方便的成像技术。然而，这些技术仍存在各自缺陷。例如，多光谱光声断层扫描成像被光的低穿透性所限制，核磁共振成像和电子计算机断层扫描成像只能探测到直径大于0.5cm的肿瘤。此外，它们只能对特定的器官提供高分辨率的成像效果。因此，发展一种多模态成像的探针是十分必要的，因为它可实现在分子水平的上的疾病诊断并具有很好的临床应用前景。

已报导的多模态成像探针多是通过将多种成像的造影探针通过连接或者包裹的手段组合起来，这种方式存在很大风险是各成分容易脱落。另一些因为不稳定的化学结构很难实现在生物体内的应用。两面神结构的异质纳米颗粒具备两种不同的材料成分和表面，从而可以实现“一体化”的成像和治疗能力，并且可在生物体内保持稳定。依托我们先前的工作基础，磁性碳化铁纳米颗粒已被证实可作为成像手段引导下的光热疗法中的探针。若再将其与具有特殊光学特性的金纳米材料结合起来形成异质纳米材料，则该异质纳米材料会同时具备磁性及光学性能。

因此，如何制备出结合金和碳化铁的异质纳米颗粒，并通过一定修饰手段制成多模态成像引导的光热疗探针成为有待解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种金/碳化铁异质纳米颗粒，具有双面神的异质结构，粒径为10～50nm。

本发明提供的金/碳化铁异质纳米颗粒具有两面神的异质结构，以Au-Fe₂C异质纳米颗粒为典型代表，其一侧的晶格间距与Au的晶面相匹配，另一侧的晶格间距与Fe₂C的晶面相匹配。从本发明拍摄的一些电镜照片可以看出，Au纳米粒子显现出的晶格间距为0.204nm，对应于Au的(200)晶面；Fe₂C部分显现出的晶格间距为0.132nm，对应于Fe₂C的(111)晶面；此外，出现了明显的Au的晶格延伸到了Fe₂C晶格内部，形成了交叉，说明两种材料原子之间发生相互渗透，但并没有破坏各自的晶体结构，这种有序交错为打破晶格不匹配的不同材料间实现结合。

本发明还提供上述金/碳化铁异质纳米颗粒的制备方法，采用粒径7～12nm的金纳米颗粒作为种子，在其周围生长上结晶Fe，并一步碳化为碳化铁，从而形成金/碳化铁异质纳米颗粒。

本发明提供的金/碳化铁异质纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：

1)制备粒径7～12nm的金纳米颗粒；

2)以步骤1)制备的粒径7～12nm的金纳米颗粒作为种子，在还原性气氛中加入Fe(CO)₅，于170～190℃反应一段时间，得到Au-Fe异质纳米颗粒；

3)将步骤2)制备的Au-Fe异质纳米颗粒在还原性气氛中进行碳化，得到双面神异质结构的金/碳化铁纳米颗粒。

其中，步骤1)可以是先制备粒径3～6nm金纳米颗粒，然后以之为晶种生长粒径7～12nm的金纳米颗粒。

步骤3)的碳化温度优选为290～310℃。

本发明还提供了金/碳化铁异质纳米颗粒在制备多模态成像探针中的应用，以金/碳化铁异质纳米颗粒为原料，通过简单的方法即可获得性能稳定的成像探针。

通过本发明制备的多模态成像探针能够实现对肿瘤组织的多种生物成像。

本发明还提供了金/碳化铁异质纳米颗粒在制备多模态成像引导的光热疗探针中的应用，通过将金/碳化铁异质纳米颗粒偶联肿瘤细胞特异性的亲和配体，使得所述探针可以特异性的靶向该肿瘤细胞，在多模态的成像引导下，实现对其的选择性杀伤。

经本发明人研究发现，本发明提供的金/碳化铁异质纳米颗粒具有磁共振成像性能、电子计算机断层扫描成像性能和在可见光波段的光声成像性能，可通过本领域技术人员已知的各种化学修饰使之具有亲水性和生物相容性，从而进入生物体进行生物成像，所述生物成像包括但不限于磁共振成像、多光谱光声断层扫描成像和电子计算机断层扫描成像。

对于本发明提供的金/碳化铁异质纳米颗粒在制备生物成像探针中的应用，在具体实施时，所述探针可以由Au-Fe₂C异质纳米颗粒经DSPE-PEG-NH₂(氨基化的聚乙二醇磷脂，其CAS号为474922-26-4)修饰获得。经DSPE-PEG-NH₂修饰后，所述探针的亲水性和生物相容性增强，有利于进入生物体进行生物成像。

更进一步的，所述探针由Au-Fe₂C异质纳米颗粒经DSPE-PEG-NH₂修饰后，偶联肿瘤细胞特异性的亲和配体获得。所述亲和配体用于使经DSPE-PEG-NH₂修饰后获得的Au-Fe₂C异质纳米颗粒能够靶向到特定的肿瘤细胞，本领域技术人员可以根据所要进行生物成像的肿瘤类型，选择相应的亲和配体与经DSPE-PEG-NH₂修饰后获得的Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒偶联，从而实现对特定肿瘤组织的生物成像。在本发明的一个实施例中，所述肿瘤为人乳腺癌细胞MDA-MB-231，亲和配体Z_HER2:342特异性结合MDA-MB-231细胞表面的肿瘤标记物。

对于本发明提供的金/碳化铁异质纳米颗粒在多模态成像引导的光热疗探针中的应用，在本发明的一个具体实施方案中，所述探针由Au-Fe₂C异质纳米颗粒经DSPE-PEG-NH₂修饰后，偶联特定肿瘤细胞特异性的亲和配体获得。相似地，所述亲和配体用于使经DSPE-PEG-NH₂修饰后获得的Au-Fe₂C-PEG异质纳米颗粒靶向到乳腺癌特细胞MDA-MB-231，本领域技术人员也可以根据所要进行多模态成像引导的光热治疗的肿瘤细胞的类型，选择相应的亲和配体与经DSPE-PEG-NH₂修饰后获得的Au-Fe₂C-PEG异质纳米颗粒偶联，从而实现对特定肿瘤组织的生物成像引导的光热治疗。

本发明实施例中制备的多模态成像探针由Au-Fe₂C-PEG异质纳米颗粒经DSPE-PEG-NH₂修饰获得。进一步的，所述探针由Au-Fe₂C-PEG异质纳米颗粒经DSPE-PEG-NH₂修饰后，偶联乳腺癌特细胞MDA-MB-231特异性的亲和配体获得。进一步的，所述亲和配体为能与卵巢癌细胞MDA-MB-231表面的肿瘤标记物特异性结合的配体Z_HER2：342。

在本文中，将经DSPE-PEG-NH²修饰的Au-Fe₂C纳米颗粒简称为Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒；将偶联亲和配体Z_HER2:342的Au-Fe₂C-PEG简称为Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒。

本发明提供的探针可以分散在任何适于临床应用的生理盐水或缓冲盐溶液中，以注射剂的方式施用至机体。

进一步的，本发明提供的多模态成像引导的光热疗探针中亲和配体的使用量可以根据肿瘤细胞表面特异性标记物的数量调整，通过本领域常规手段确定。进一步的，本发明提供的多模态成像引导的光热疗探针中Au-Fe₂C异质纳米颗粒经DSPE-PEG-NH₂修饰程度的只要能满足使Au-Fe2C-Z_HER2:342通过注射的方式顺畅地进入机体并稳定的在机体中循环，并到达特定的肿瘤部位即可。

在本发明的一个具体实施方式中，在所述多模态成像探针或由其引导的光热疗探针中，Au-Fe₂C与DSPE-PEG-NH₂的摩尔比为1:1～1:5，优选的可以为1:1.3～1:1.7，更优选的为3:5。进一步的，Au-Fe₂C-PEG-NH2与Z_HER2:342的摩尔比可以为1:1～100000:1，优选的可以为9000:1～11000:1，更优选的为10000:1。

在本发明的方案中，施用多模态成像探针的量可根据成像要求确定；施用多模态成像引导的光热疗探针的量可按照所要治疗的肿瘤细胞的量决定，相应Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒的施用量以分散在生理盐水或缓冲盐中的Fe浓度量计。

在本发明的实施方式中，对小鼠施用多模态成像探针的量可以是10～25mg/kg小鼠体重，优选的为15～20mg/kg小鼠体重。在上述范围施用该探针可获得良好的成像效果。

在本发明的另一个实施方式中，对小鼠施用多模态成像引导的光热疗探针的量可以是17～22mg/kg小鼠体重，优选的为18～20mg/kg小鼠体重。在上述范围施用该探针进行光热治疗，能实现对小鼠的肿瘤细胞抑制和杀伤，并基本无明显副作用。

本发明提供的多模态成像探针，或由其引导的光热疗探针可以通过静脉、瘤内或皮下注射，对机体进行施用，以通过光热治疗抑制和杀伤肿瘤细胞。

在本发明的另一个具体的实施方案中，Au-Fe₂C-PEG异质纳米颗粒制备方法包括：将摩尔比为10:1-1:10的Au-Fe₂C异质纳米颗粒与DSPE-PEG-NH₂在溶剂中混合得到混合溶液，在保护气氛中搅拌过夜，然后旋蒸去除溶剂，得到所述Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒。进一步的，所述溶剂可以是氯仿。更进一步的，可以将DSPE-PEG-NH₂的氯仿溶液逐滴添加到所述Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒的氯仿溶液中以实现Au-Fe₂C异质纳米颗粒与DSPE-PEG-NH₂在溶剂中的充分混合。更进一步的，过夜搅拌过程温度条件为室温。

在本发明的一个具体实施方式中，Au-Fe₂C-PEG异质纳米颗粒制备方法包括将100mgDSPE-PEG-NH₂溶解到15mL的氯仿中，逐滴加入到含有25mg Au-Fe₂C的30mL氯仿溶液中。该混合溶液在Ar保护下搅拌过夜，旋转蒸发除去氯仿。将产物分散在超纯水中，透析24h除去未反应的DSPE-PEG-NH₂。

在本发明的一个具体实施方式中，Au-Fe₂C-Z_HER2:342异质纳米颗粒的制备方法包括：按照上述方法制备Au-Fe₂C-PEG异质纳米颗粒，然后将制得的Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒与经活化的亲和配体Z_HER2:342在磷酸缓冲盐溶液中(PBS,pH＝7.4)以100000:1-1:1的摩尔比混合，在室温下，搅拌4小时，然后收集Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒。进一步的，所述亲和配体Z_HER2:342利用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC HCl)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS-sulfo)活化。

在本发明的一个具体实施方式中，Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒的制备方法包括：将100μL1mM Z_HER2:342溶液溶解到2mL磷酸缓冲液中(PBS,pH＝7.4)，加入5mg1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC HCl)和5mg-N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS-sulfo)，搅拌活化1h后加入25mg修饰了DSPE-PEG-NH₂的Au-Fe₂C纳米颗粒，继续搅拌4h。20000rpm离心30min收集产物Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒，并透析24h除去未反应的Z_HER2:342和EDC HCl、NHS-sulfo。

本发明方案具有以下的优点：

1)本发明了一种制备双面神结构的金/碳化铁异质纳米颗粒，由于是由两种不同的材料构成的，能同时具备金和碳化铁材料的特性，从而能使获得的探针发挥多功能、一体化诊疗的特性。

2)本发明使用的金/碳化铁异质纳米颗粒相比于传统单指纳米颗粒相比，由于具备不同材料造成的协同作用，因而具有更好的T₂加权磁共振性能，更强的光热疗效果。

4)本发明的多模态成像探针通过简单方法即可获得并具有稳定的性能，进一步通过在探针上偶联特定肿瘤细胞特异性的亲和配体，可实现对生物体特定部位的多模态成像。

5)本发明的多模态成像引导的光热疗探针，通过在探针上偶联乳腺癌细胞MDA-MB-231特异性的亲和配体，可在生物体特定部位实现对该肿瘤的光热治疗。

6)采用本发明提供的多模态成像引导的光热疗探针进行光热治疗，能获得显著的肿瘤细胞的杀伤效果，同时生物体没有出现体重降低、以及心、肝、脾、肺、肾功能损伤等副作用。

附图说明

图1显示了Au-Fe₂C异质纳米颗粒制备过程中物质的结构，其中，A为获得的Au-Fe₂C异质纳米颗粒的XRD图；B为9nm金纳米颗粒的高分辨电镜图；C和D分别为Au-Fe异质纳米颗粒的电镜图和高分辨电镜图；E和F分别为Au-Fe₂C异质纳米颗粒的电镜图和高分辨电镜图。

图2显示了经DSPE-PEG-NH₂修饰后的Au-Fe₂C-PEG异质纳米颗粒的电镜图。

图3显示了Au-Fe₂C异质纳米颗粒的XRD图(Au-Fe₂C表示的线)，以及经DSPE-PEG-NH₂修饰后获得的Au-Fe₂C-PEG异质纳米颗粒的XRD图(Au-Fe₂C-PEG表示的线)。

图4显示了不同浓度的Au-Fe₂C-PEG异质纳米颗粒在不同波长下的光声信号强度图。

图5显示了Au-Fe₂C-PEG异质纳米颗粒的磁共振横向弛豫率(r₂值)图。

图6显示了不同浓度Au-Fe₂C-PEG异质纳米颗粒的电子计算机断层扫描信号值。

图7显示了不同浓度下Au-Fe₂C-PEG异质纳米颗粒在激光照射下的升温曲线。

图8显示了实施例2中经不同处理方法处理后，MDA-MB-231细胞的CCK8试验结果。

图9显示了实施例2中经不同处理方法处理后，MDA-MB-231细胞的荧光图像；其中，第一列为经Calcein-AM染色后的活细胞；第二列为经PI染色后的死细胞；第三列为前两列的合并图；光照组的激光强度为1W/cm²，波长808nm，激光照射时间为5分钟，照射范围在白色圈以内；标尺长度为100μm。

图10显示了实施例2中负荷了MDA-MB-231肿瘤的BALB/c小鼠尾静脉注射Au-Fe₂C-Z_HER2:342异质纳米颗粒和Au-Fe₂C-PEG异质纳米颗粒前后的T₂加权磁共振成像图(A)，以及光声成像图(B)。

图11显示了实施例2中负荷了MDA-MB-231肿瘤的BALB/c小鼠尾静脉注射Au-Fe₂C-Z_HER2:342异质纳米颗粒前后的电子计算机断层扫描信号成像图；其中，左侧图为注射前，右侧图为注射后，箭头所指为肿瘤部位。

图12显示了实施例2中用温度热像仪测试的不同组小鼠肿瘤部位的温度图，其中第一行显示的是静脉注射Au-Fe₂C-Z_HER2:342异质纳米颗粒组小鼠的温度图，第二行为静脉注射Au-Fe₂C-PEG异质纳米颗粒并照射激光组小鼠的温度图，第三行静脉注射生理盐水并照射激光组小鼠的温度图。

图13显示了实施例2中经不同处理方法处理后小鼠肿瘤的生长曲线。

图14显示了实施例2中经不同处理方法处理27天后小鼠肿瘤组织的照片。

图15显示了实施例2中经不同处理方法处理后小鼠体重的变化，其中，误差线是3只小鼠的体重标准差。

图16显示了实施例2中经不同处理方法处理后，各组小鼠主要脏器的H&E染色结果，标尺长度为50μm。

具体实施方式

下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本领域的技术人员应该理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法和技术，通常按照所属领域的常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。

下述实施例中使用的各种肿瘤细胞、试剂及实验动物：

HER2高表达的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231购自协和医院细胞库。

BALB/c小鼠购自维通利华实验动物公司，雌性，体重20克左右。

十八胺，Fe(CO)₅，乙醇，环己烷，NH₄Br，叔丁基胺-硼烷(TBAB)，DSPE-PEG-NH₂，氯仿，琼脂糖凝胶，磷酸缓冲液(PBS,pH＝7.4)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC HCl)，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS-sulfo)，钙黄绿素(Calcein-AM)，碘化丙啶(PI)，购自Sigma、Alfa Aesar公司。

胰酶，细胞培养基，胎牛血清，DPBS购自Gibco公司。

实施例1 多模态成像的探针

1、多模态成像探针的制备过程：

1)Au-Fe₂C异质纳米颗粒的合成：

A、4nm Au纳米颗粒的制备

在100mL四口瓶中加入98mg HAuCl₄·3H₂O，10mL正己烷，10mL油胺(OAm)，溶解混合均匀。将四口瓶置于5℃水槽内。将四口瓶密封，并通入Ar保护，持续搅拌。称取16mg叔丁基胺-硼烷(TBAB)溶于1mL正己烷和1mL油胺。用注射器将TBAB溶液加入瓶中，保持温度恒定反应2h后终止反应，10000rpm离心10min。将离心出来的Au纳米粒子重新分散于10mL环己烷中保存。

B、晶种生长法制备9nm Au纳米颗粒

称取100mg HAuCl₄·3H₂O加入四口瓶，并加入1mL OAm，15mL十八烯，分散均匀。将四口瓶置于加热套中，并保持Ar流通和磁力搅拌。将温度升至65℃，用注射器注入2mL第一步中合成的4nm的Au纳米粒子胶体(约5mg/mL)，保持65℃反应6h。冷却至室温后，置于高速离心机中离心分离，最终产物保存于环己烷中。图1中B显示了9nm的Au纳米颗粒的形貌。

C、Au-Fe异质纳米材料的制备

在100mL四口瓶中加入8mg NH₄Br、15mL十八烯，100μL油胺，2mL新鲜合成的9nm Au纳米粒子。将四口瓶置于加热套中，惰性气氛保护，并磁力搅拌。将温度升至100℃，用持续抽真空1h，并再次通入标准气，保证反应在还原性气氛下进行。随后升温至180℃，并迅速注入0.7mL Fe(CO)₅，保持180℃反应30分钟后自然冷却至室温。用高速离心机1000rpm离心10min收集产物。离心下来的纳米粒子加入10mL环己烷超声重新分散。图1中C和D显示了Au-Fe异质纳米颗粒的形貌。

D、Au-Fe₂C异质纳米材料的制备

100mL四口瓶中加入10mL ODE，5mL OAm和上一步骤中合成的Au-Fe纳米粒子。将四口瓶置于上述反应体系中密封，首先升温至120℃并用打开真空泵抽气1h，之后通入标准气，保持气体流通鼓泡，以5℃/min的速率升温至300℃，并保温反应1h后自然降温。整个反应过程保持快速磁力搅拌和还原性气氛。加入正己烷和乙醇离心收集产物，用高速离心机1000rpm离心10min收集产物，样品最终保存于环己烷中。图1中E和F显示了Au-Fe₂C异质纳米颗粒的形貌，为双面神的异质结构。

Au-Fe异质纳米颗粒和Au-Fe₂C异质纳米颗粒的X射线衍射图(XRD图)见图1中A，可以看出通过对比标准卡片，确定所合成的材料的成分为Au-Fe异质纳米材料和Au-Fe₂C异质纳米材料。

2)多模态成像探针(即Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒)的制备：将100mg氨基化的聚乙二醇磷脂(DSPE-PEG-NH₂，其CAS号为474922-26-4)溶解到15mL的氯仿中，逐滴加入到含有25mgAu-Fe₂C的30mL氯仿溶液中。该混合溶液在Ar保护下搅拌过夜，旋转蒸发除去氯仿。将产物分散在去超纯水中，透析24h除去未反应的DSPE-PEG-NH₂，即可获得所述用于多模态成像的探针。

2、多模态成像探针的相关性能

1)Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒的表征图。

图2显示了DSPE-PEG-NH₂修饰Fe₅C₂纳米颗粒后的电镜图，图3显示的是修饰前后的XRD图。修饰后获得的Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒谱图能与修饰前的Au-Fe₂C纳米颗粒的XRD谱图的特征峰相对应，进一步验证其结晶相为Au-Fe₂C纳米颗粒，且证明了材料的稳定性。

2)Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒的光声成像性能

Au-Fe₂C-PEG在近红外区(NIR)的光声成像主要是利用纳米颗粒在近红外光照射下能够产生热能，这个热能进一步绝热膨胀可以产生超声波来实现。图4显示了不同浓度下Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒在不同波长处的光声信号强度。将装有不同浓度Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒溶液的离心管淹没在水中，并保持其高度一致，扫描接收信号。从图4可以看出，用不同波长的光进行扫面均显示出：随着Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒浓度的升高，纳米颗粒的光声信号逐渐增强，说明Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒可用作较好的光声成像造影剂。

3)Au-FeC₂-PEG纳米颗粒的磁共振成像性能

图5显示了采用3T临床核磁共振成像仪测试Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒的磁共振成像效果：将不同浓度的Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒分散在含有1％琼脂糖凝胶的水中，并装在1.5mLEpendoff管中。T₂权重图像的序列参数为：TR＝500ms,TE＝36.8ms,矩阵尺寸(matrixsize)＝300×300,可见范围(FOV)＝180×180mm²,层厚(slice thickness)＝3mm，层数(slice)＝3。进一步可以通过磁共振横向弛豫率来对Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒的磁共振成像性能进行评价。T₂加权磁共振造影剂的效率可以通过其横向弛豫率r₂来评估，r₂反映了造影剂影响T₂的能力。图5显示了Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒其横向弛豫率为r₂＝210mM^-1s^-1，其灵敏度高于现有技术中商用四氧化三铁造影剂Resovist(r₂＝173.95mM^-1s^-1)。

4)Au-Fe₂C-PEG的电子计算机断层扫描成像性能

图6显示了不同浓度的Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒在电子计算机断层扫描下的信号强度。该曲线的测试条件为：将不同浓度的Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒分散在水中，医用GE电子计算机断层扫描仪器扫描样品，测试参数为：电压＝100kV,电流＝200mA，层厚(slicethickness)＝0.625mm，并用Hounsfield单位(HUs)衡量电子计算机断层扫描成像性能。如图6所示，HU为24.52，与之前文献报道的性能基本相同。

5)Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒的光热性能

图7显示了Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒在激光(808nm激光,密度为1W/cm²)照射下的升温曲线。该曲线的测试条件为：将不同浓度的Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒分散在水中，在用激光照射样品过程中，用红外热成像相机每隔20s探测溶液的温度。如图7所示，Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒的水分散液能在5min内迅速升温，且温度越高升温越快。

实施例2 光声成像引导的光热疗探针

1、探针的制备过程：

光声成像引导的光热疗探针(即Au-Fe₂C-Z_HER2:342)的制备：将100μL 1mM Z_HER2:342溶液溶解到2mL磷酸缓冲液中(PBS,pH＝7.4)，加入5mg1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC HCl)和5mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS-sulfo)，搅拌活化1h后加入25mg修饰了DSPE-PEG-NH₂获得的Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒，继续搅拌4h。20000rpm离心20min收集产物，透析24h除去未反应的Z_HER2:342和EDC HCl、NHS-sulfo，即可获得所述光声成像引导光热疗探针Au-Fe₂C-Z_HER2:342，所述多模态成像为磁共振成像和光声成像。

2、Au-Fe₂C-Z_HER2:342探针的相关性能

1)体外实验结果

1.1 细胞水平验证光热疗效果

将MDA-MB-231细胞种到96孔板上，细胞密度为1×10⁴个/孔。将细胞在37℃，CO₂浓度为5％的培养箱中培养过夜使细胞贴壁。将细胞分为4组：组1加Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒并照激光；组2加Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒并照激光；组3只加Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒；组4只照激光。其中，加纳米颗粒组均在加入纳米颗粒4h后，将未与细胞作用的颗粒用PBS洗三遍清洗干净，照激光组的激光密度为1W/cm²，波长为808nm，光照时间为5分钟。以下用CCK8试验验证细胞的抑制情况。

如图8所示，连接了靶向基团Z_HER2:342的Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒在激光照射下能较好的抑制细胞的生长。而没有连靶向蛋白的Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒只有在高浓度(400g/mL)下，在激光照射后才能有一定的抑制作用。此外，只施加Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒或只进行激光照射细胞的存活没有明显的抑制作用。说明Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒作为光热疗探针能很好的抑制MDA-MB-231细胞的存活。

进一步使用通过将细胞用Calcein-AM/PI复染，用荧光显微镜也可以显示光热治疗对于MDA-MB-231细胞的抑制作用。钙黄绿素(Calcein-AM)可以将活细胞染色成绿色，而死细胞不能染上色；碘化丙啶(PI)可以将死细胞染成红色，而活细胞不能染上色。

将MDA-MB-231细胞种到24孔板中。在37℃，CO₂浓度为5％的培养箱中培养至细胞的丰度为80％(以长满培养瓶底部时作为100％)时开始实验。然后将细胞分为5组：组1加Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒并照激光；组2加Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒并照激光；组3只加Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒；组4只照激光；组5对照组，只施加生理盐水。施加纳米颗粒组均在加入纳米颗粒2h后，将未与细胞作用的颗粒用PBS洗三遍清洗干净。如图9所示，白色圈内为光照区域，激光强度为1W/cm²，波长为808nm，激光照射时间为5min。然后继续培养4h后，加入复染染料Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒与MDA-MB-231细胞作用并激光照射后，细胞大片死亡；Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒与细胞作用并激光照射后，只有零星的细胞死亡；只用激光照射组的细胞和只用Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒培养组的细胞均没有明显细胞死亡。此结果与CCK8试验结果一致。

2)小鼠体内实验结果

2.1 小鼠体内磁共振成像结果：

小鼠模型：在4-6周的BALB/c小鼠在背右侧接种MDA-MB-231细胞，接种量为10⁷个细胞/只，每只接种0.2mL细胞悬液。待小鼠肿瘤长到约100-150mm³后进行实验。

取2只肿瘤小鼠，腹腔麻醉后，分别在3T磁共振仪上进行预扫描。扫描参数为TR＝1200ms,TE＝30.2ms,slice thickness＝2.5mm。预扫描后，两只鼠分别尾静脉注射Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒和Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒。注射量为10mg/kg(0.2mL，分散在PBS中)。注射后在不同时间点分别进行磁共振成像。如图10中A所示，注射了Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒比注射Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒的图像更暗，说明更多的Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒能够通过Z_HER2:342的作用靶向到肿瘤部位，并且这种靶向可以通过T₂加权磁共振成像检测，即Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒可用于MDA-MB-231肿瘤模型的T₂加权磁共振成像检测。同时，注射后24h，小鼠肿瘤部位的信号最低，说明24h时，最多的纳米颗粒可达到肿瘤部位。故在后续治疗实验中，可选用24h进行光热治疗。

2.2 小鼠体内光声成像结果

小鼠模型：在4-6周的BALB/c小鼠在背右侧接种MDA-MB-231细胞，接种量为10⁷个细胞/只，每只接种0.2mL细胞悬液。待小鼠肿瘤长到约100-150mm³后进行实验。

取2只肿瘤小鼠，用气体麻醉系统麻醉，并对肿瘤部位在使用纳米颗粒前进行光声成像。然后对2只鼠分别尾静脉注射Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒和Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒。注射量为20mg/kg(0.2mL，分散在PBS中)，注射后再次进行光声成像，结果如图10中B所示。注射Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒的小鼠，其肿瘤部位光声信号明显高于注射Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒组，进一步说明Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒可以通过Z_HER2:342与肿瘤的特异性结合靶向至肿瘤部位，并且这种特异性可通过光声成像检测，即Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒可用于MDA-MB-231肿瘤模型的光声成像检测。

2.3 小鼠体内电子计算机断层扫描成像结果

小鼠模型：在4-6周的BALB/c小鼠在背右侧接种MDA-MB-231细胞，接种量为10⁷个细胞/只，每只接种0.2mL细胞悬液。待小鼠肿瘤长到约100-150mm³后进行实验。

取1只肿瘤小鼠，腹腔麻醉后，并对肿瘤部位在使用纳米颗粒前进行成像。然后对它瘤内注射Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒。注射量为10mg/mL(10μL，分散在PBS中)，注射后再次进行成像，结果如图11所示。注射Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒的小鼠，其肿瘤部位信号明显出现，说明Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒可以用于MDA-MB-231肿瘤模型的电子计算机断层扫描成像检测。

2.4 小鼠体内验证光热疗效果

小鼠模型：在4-6周的BALB/c小鼠在背右侧接种MDA-MB-231细胞，接种量为10⁷个细胞/只，每只接种0.2mL细胞悬液。待小鼠肿瘤长到约100-150mm³后进行实验。

取3只肿瘤小鼠，腹腔麻醉后，分别用温度热像仪测试肿瘤部位的温度。对3只鼠分别尾静脉注射Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒并照射激光；注射Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒并照射激光；注射生理盐水并照射激光。各纳米颗粒的注射量为20mg/kg(0.2mL的PBS溶液)。注射24h后分别用波长为808nm的激光(1W/cm²)照射8分钟后，再次用温度热像仪测试肿瘤部位的温度。注射Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒并照射激光组相比于注射Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒并照射激光和注射生理盐水并照射激光，没有照射激光组的肿瘤部位的温度能够大幅度升高(图12)。说明Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒能够靶向至肿瘤部位，在近红外光的照射下升温，可用于光热疗。

2.5 光热法使肿瘤部位温度上升，可以用于肿瘤热消融。

小鼠模型：在4-6周的BALB/c小鼠在背右侧接种MDA-MB-231细胞，接种量为10⁷个细胞/只，每只接种0.2mL细胞悬液。待小鼠肿瘤长到约100-150mm³后进行实验。

取15只荷瘤小鼠，随机分为5组，每组3只。用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径。肿瘤大小用如下公式计算：V＝ab²/2，其中，a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。5组分别为：组1尾静脉注射Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒并激光照射，组2尾静脉注射Au-Fe₂C-PEG纳米颗粒并激光照射，组3仅尾静脉注射Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒，组4仅进行激光照射，组5仅进行尾静脉注射生理盐水，其中，组1,2,3纳米颗粒的注射量为20mg/kg(0.2mL，分散在PBS中)。24h后，1,2,4组分别用波长为808nm的激光照射5min，激光强度为1W/cm²。此后，每隔3天测试肿瘤的大小。

不同处理方法处理后小鼠肿瘤的生长曲线如图13所示，注射Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒并激光照射组小鼠肿瘤在3天内明显减小，12天后完全消融，并且27天内没有复发。而其他三组小鼠的肿瘤并没有被彻底抑制，说明靶向到肿瘤的Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒在激光的照射下能够较好得治疗MDA-MB-231肿瘤。

图13的结果进一步可以通过图14经不同处理方法处理27天后小鼠的瘤体照片证实。

2.6 Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒的毒副作用验证

每隔3天测量肿瘤大小时测试小鼠的体重。如图15所示，5组经不同处理方式处理后小鼠体重变化的区别不大。说明这种治疗方法对小鼠的毒副作用不大。

此外，还对5组小鼠经不同处理方式处理27天后，每组各取一只小鼠处死。取心、肝、脾、肺、肾做苏木精-依红(H&E)染色。如图16所示，上述处理方式中这些脏器的染色结果没有明显差异，说明Au-Fe₂C-Z_HER2:342纳米颗粒作为光热疗探针对肿瘤进行的光热治疗对这些主要器官的几乎没有副作用。

Claims (13)

1.一种金/碳化铁异质纳米颗粒，具有双面神的异质结构，粒径为10～50nm。

2.如权利要求1所述的金/碳化铁异质纳米颗粒，其特征在于，其一侧的晶格间距与Au的晶面相匹配，另一侧的晶格间距与Fe₂C的晶面相匹配。

3.一种金/碳化铁异质纳米颗粒的制备方法，以粒径7～12nm的金纳米颗粒作为种子，在其周围生长上结晶Fe，并一步碳化为碳化铁，形成金/碳化铁异质纳米颗粒。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备粒径7～12nm的金纳米颗粒；

2)以步骤1)制备的粒径7～12nm的金纳米颗粒作为种子，在还原性气氛中加入Fe(CO)₅，于170～190℃反应一段时间，得到Au-Fe异质纳米颗粒；

3)将步骤2)制备的Au-Fe异质纳米颗粒在还原性气氛中进行碳化，得到双面神异质结构的金/碳化铁纳米颗粒。

5.一种多模态成像探针，是权利要求1所述的金/碳化铁异质纳米颗粒经化学修饰得到的具有亲水性和生物相容性的纳米材料。

6.如权利要求5所述的多模态成像探针，其特征在于，所述多模态成像探针是所述金/碳化铁异质纳米颗粒经DSPE-PEG-NH₂修饰获得的纳米材料。

7.如权利要求5所述的多模态成像探针，其特征在于，所述多模态探针上偶联有特定细胞特异性的亲和配体，特异性靶向所述特定细胞。

8.如权利要求7所述的多模态成像探针，其特征在于，所述特定细胞为肿瘤细胞。

9.如权利要求5所述的多模态成像探针，其特征在于，所述多模态成像为磁共振成像、多光谱光声断层扫描成像和/或电子计算机断层扫描成像。

10.一种生物成像引导的光热疗探针，是权利要求1所述的金/碳化铁异质纳米颗粒经化学修饰具有亲水性和生物相容性，并与特定细胞特异性的亲和配体偶联获得的纳米材料，特异性靶向所述特定细胞。

11.如权利要求10所述的光热疗探针，其特征在于，所述特定细胞为人乳腺癌细胞，所述亲和配体为Z_HER2:342。

12.权利要求1所述金/碳化铁异质纳米颗粒作为多模态成像中的造影剂的用途。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述多模态成像是磁共振成像、多光谱光声断层扫描成像和/或电子计算机断层扫描成像。