CN107574216A - 一种蝎毒素的提取和纯化工艺 - Google Patents

Abstract

一种蝎毒素的提取和纯化工艺，包括用乙醇或乙醚麻醉处理全蝎，冷冻后得到样品，向所述样品中加入乙醇，然后研磨成浆液，离心取上清液；向上清液中加无水乙醇，混合均匀后再离心取上层蛋白液；向上层蛋白液加蛋白酶K，处理结束后加入等体积的无水乙醇，和饱和氯化钠溶液，混合均匀后离心取上层溶液；向上层溶液中加入硫酸钠水溶液，混合均匀后再加入无水乙醇，混合均匀后再离心收集上层溶液；对上层溶液进行冷冻干燥，制成冻干粉。本发明的工艺采用分析化学的手段直接从触肢中提取蝎毒，能够避免因现有方法提取不彻底而造成的浪费。

Description

一种蝎毒素的提取和纯化工艺

技术领域

本发明涉及一种活性成分的提取和纯化工艺，特别涉及一种蝎毒素的提取和纯化工艺，属于药物原料深加工技术领域。

背景技术

全蝎是常用中药，具有熄风镇痉、攻毒之效。近代药理研究证明：全蝎具有降压和抗惊厥作用；其所含的多肽具有抗癫痫作用。蝎毒素能致呼吸麻痹，提高小鼠兴奋性，并使其流泪、唾液分泌过多，随后发生痉挛；醇提取物尚有抑制猪囊尾蚴的作用。有关抗真菌作用的研究尚未见报道。在临床上，尝试做全蝎软膏和酊剂治疗皮癣和脚气病，收到了一定的效果，故此，对全蝎乙醇提取物及蝎毒素抗致病性表浅性皮肤真菌的作用进行了较多研究。

蝎子又名全蝎、全虫，是我国名贵的中药材及出口商品，国际国内市场上供不应求，价格趋涨，而蝎毒更是量少昂贵。蝎子的药理作用主要依赖蝎毒。据中国科学院动物研究所测定，蝎毒中含有大量蛋白、透明质酸酶、生物胺等成分，用于治疗恶性肿瘤和艾滋病有较好疗效。目前以蝎毒素配成的中药达60多种，如大活络丹、再造丸、镇痛散、七珍丹等。除药用外，蝎毒还广泛用于保健品。蝎毒在国际市场上价格高达每克1千美元。大约3000只蝎子可以提取1克干毒，经济价值相当可观。因此对蝎毒进行人工提取，已经受到医药和养殖界的极大关注。现有技术中提取蝎毒主要采取以下措施：

人工刺激取毒法：这是一个最简单的取毒方法。取毒时用一个金属镊紧夹住一个触肢，夹的力量由小到大给予刺激，但不要夹破触肢。在这种机械刺激下，便会看到蝎子的尾刺处有毒液排出。这种方法虽然简单，但蝎子的排毒量不多，而且只排出含碱性蛋白的透明毒液，未能彻底排毒，这是由于机械刺激强度不够的缘故。

电刺激取毒方法：用电刺激方法取毒的量较人工刺激方法取得的毒量要大一倍，而且取出的毒液较彻底，电刺激取出的毒液先后有变化，第一滴蝎毒往往清澈透明，然后是乳白色，最后是粘滞态的毒液。这是由于蝎子对电刺激特别敏感或是电刺激强度大的缘故。每只蝎每次取毒的量因个体大小和性别不同而异，一般个体较大的排毒量较多，雌蝎比雄蝎排毒量大，平均每只蝎每次产干毒量为0.34毫克，蝎被取毒后，每隔一周或两周可以连续再次取毒。取毒后的蝎体重有所下降，但不显著。虽活动减少，但其食欲要比未取过毒的蝎子大得多。如取毒的方法适当，可以做到无一死亡。怀孕雌蝎仍能产小蝎，但小蝎存活率远低于未取毒的蝎。在自然气温下，10月份产毒量显著下降，至10月下旬，蝎基本不排毒。

发明内容

本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种获取蝎毒的化学方法，从而避免因季节等因素造成的蝎毒获取量低，或蝎毒提取率低的不足，本发明提供了一种蝎毒素的提取和纯化工艺。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种蝎毒素的提取和纯化工艺，包括下列步骤：

第一步：在4～8℃条件下，将全蝎成虫用乙醇或乙醚进行麻醉处理，然后剪取各触肢，投入一离心管中，置于-16～-30℃条件下冰冻1～5小时，得到冰冻处理后的样品；

第二步：向所述冰冻处理后的样品中加入1～3.5倍质量的体积分数为75～90％的乙醇，然后研磨成浆液，3000～5000r/min离心5～10min，取上清液；

第三步：向所述上清液中加1～2倍体积的无水乙醇，混合均匀后再12000～14000r/min离心15～25min，取上层蛋白液；

第四步：向所述上层蛋白液加蛋白酶K，56～58℃条件下处理15～45分钟，处理结束后加入等体积的无水乙醇，和0.05～0.2倍体积的饱和氯化钠溶液，混合均匀，12000～14000r/min离心15～25min，取上层溶液；

第五步：向第四步得到的上层溶液中加入0.1～0.5倍体积的质量分数为10～30％的硫酸钠水溶液，混合均匀后再加入1～2倍体积的无水乙醇，混合均匀后再12000～14000r/min离心15～25min，收集上层溶液；

第六步：对第五步得到的上层溶液进行冷冻干燥，制成冻干粉。

优选的技术方案为：包括下列步骤：

第一步：在4℃条件下，将全蝎成虫用乙醇或乙醚进行麻醉处理，然后剪取各触肢，投入一离心管中，置于-25℃条件下冰冻4小时，得到冰冻处理后的样品；

第二步：向所述冰冻处理后的样品中加入2.5倍质量的体积分数为80％的乙醇，然后研磨成浆液，4000r/min离心8min，取上清液；

第三步：向所述上清液中加1.5倍体积的无水乙醇，混合均匀后再13000r/min离心20min，取上层蛋白液；

第四步：向所述上层蛋白液加蛋白酶K，58℃条件下处理30分钟，处理结束后加入等体积的无水乙醇，和0.1倍体积的饱和氯化钠溶液，混合均匀，13000r/min离心20min，取上层溶液；

第五步：向第四步得到的上层溶液中加入0.3倍体积的质量分数为25％的硫酸钠水溶液，混合均匀后再加入1.5倍体积的无水乙醇，混合均匀后再13000r/min离心25min，收集上层溶液；

第六步：对第五步得到的上层溶液进行冷冻干燥，制成冻干粉。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

1、本发明的工艺提取、纯化获得的蝎毒纯度高。

2、本发明的工艺采用分析化学的手段直接从触肢中提取蝎毒，能够避免因现有方法提取不彻底而造成的浪费。

3、本发明的工艺能够避免季节因素带来的不利于生产的因素。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本实施例所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

实施例1：一种蝎毒素的提取和纯化工艺

一种蝎毒素的提取和纯化工艺，所述工艺包括以下步骤：

(1)收集每年3月份养殖至成虫的全蝎，在4℃条件下，用乙醇对全蝎成虫进行麻醉处理，然后剪取各触肢，投入离心管中，置于-16℃条件下冰冻1小时；麻醉处理是指将全蝎成虫浸没于乙醇或乙醚中，或者对全蝎成虫进行乙醇或乙醚喷雾。

(2)取步骤(1)冰冻处理后的样品，向样品中加入1倍质量的体积分数为75％的乙醇，研磨成浆液，3000r/min离心5min，取上清液。

(3)向步骤(2)获得的上清液中加入1倍体积的无水乙醇，上下混匀后再12000r/min离心15min，取上层蛋白液。

(4)向上层蛋白液中加入蛋白酶K，56℃水浴条件下处理15分钟，处理结束后加入等体积的无水乙醇，和0.05倍体积的饱和氯化钠溶液，混合均匀，12000r/min离心15min，取上层溶液；饱和氯化钠溶液是指室温条件下的饱和氯化钠溶液。蛋白酶K水溶液的浓度为50～100微克/毫升，在本实施例中为50微克/毫升。添加量为5毫升。

(5)向步骤(4)收集的上层溶液中加入0.1倍体积的质量分数为10％的硫酸钠水溶液，混合均匀后再加入1倍体积的无水乙醇，混合均匀后12000r/min离心15min，收集上层溶液；

(6)将步骤(5)收集的上层溶液冷冻干燥，制成冻干粉，并在-20℃保存。

实施例2：一种蝎毒素的提取和纯化工艺

一种蝎毒素的提取和纯化工艺，所述工艺包括以下步骤：

(1)收集每年6月份养殖至成虫的全蝎，在4℃条件下，用乙醚对全蝎成虫进行麻醉处理，然后剪取各触肢，投入离心管中，置于-25℃条件下冰冻4小时；麻醉处理是指将全蝎成虫浸没于乙醇或乙醚中，或者对全蝎成虫进行乙醇或乙醚喷雾。

(2)取步骤(1)冰冻处理后的样品，向样品中加入2.5倍质量的体积分数为80％的乙醇，研磨成浆液，4000r/min离心8min，取上清液。

(3)向步骤(2)获得的上清液中加入1.5倍体积的无水乙醇，上下混匀后再13000r/min离心20min，取上层蛋白液。

(4)向上层蛋白液中加入蛋白酶K，58℃水浴条件下处理30分钟，处理结束后加入等体积的无水乙醇，和0.1倍体积的饱和氯化钠溶液，混合均匀，13000r/min离心20min，取上层溶液；饱和氯化钠溶液是指室温条件下的饱和氯化钠溶液。蛋白酶K水溶液的浓度为50～100微克/毫升，在本实施例中为50微克/毫升。添加量为10毫升。

(5)向步骤(4)收集的上层溶液中加入0.3倍体积的质量分数为25％的硫酸钠水溶液，混合均匀后再加入1.5倍体积的无水乙醇，混合均匀后13000r/min离心25min，收集上层溶液；

(6)将步骤(5)收集的上层溶液冷冻干燥，制成冻干粉，并在-15℃保存。

实施例3：一种蝎毒素的提取和纯化工艺

一种蝎毒素的提取和纯化工艺，所述工艺包括以下步骤：

(1)收集每年8月份养殖至成虫的全蝎，在6℃条件下，用乙醇对全蝎成虫进行麻醉处理，然后剪取各触肢，投入离心管中，置于-20℃条件下冰冻3小时；麻醉处理是指将全蝎成虫浸没于乙醇或乙醚中，或者对全蝎成虫进行乙醇或乙醚喷雾。

(2)取步骤(1)冰冻处理后的样品，向样品中加入2.5倍质量的体积分数为75％的乙醇，研磨成浆液，3500r/min离心8min，取上清液。

(3)向步骤(2)获得的上清液中加入1.5倍体积的无水乙醇，上下混匀后再13500r/min离心15min，取上层蛋白液。

(4)向上层蛋白液中加入蛋白酶K，56℃水浴条件下处理40分钟，处理结束后加入等体积的无水乙醇，和0.1倍体积的饱和氯化钠溶液，混合均匀，13000r/min离心25min，取上层溶液；饱和氯化钠溶液是指室温条件下的饱和氯化钠溶液。蛋白酶K水溶液的浓度为50～100微克/毫升，在本实施例中为50微克/毫升。添加量为15毫升。

(5)向步骤(4)收集的上层溶液中加入0.4倍体积的质量分数为20％的硫酸钠水溶液，混合均匀后再加入1倍体积的无水乙醇，混合均匀后12500r/min离心25min，收集上层溶液；

(6)将步骤(5)收集的上层溶液冷冻干燥，制成冻干粉，并在-20℃保存。

实施例4：一种蝎毒素的提取和纯化工艺

一种蝎毒素的提取和纯化工艺，所述工艺包括以下步骤：

(1)收集每年9月份养殖至成虫的全蝎，在8℃条件下，用乙醇对全蝎成虫进行麻醉处理，然后剪取各触肢，投入离心管中，置于-30℃条件下冰冻5小时；麻醉处理是指将全蝎成虫浸没于乙醇或乙醚中，或者对全蝎成虫进行乙醇或乙醚喷雾。

(2)取步骤(1)冰冻处理后的样品，向样品中加入3.5倍质量的体积分数为90％的乙醇，研磨成浆液，5000r/min离心10min，取上清液。

(3)向步骤(2)获得的上清液中加入2倍体积的无水乙醇，上下混匀后再14000r/min离心25min，取上层蛋白液。

(4)向上层蛋白液中加入蛋白酶K，58℃水浴条件下处理45分钟，处理结束后加入等体积的无水乙醇，和0.2倍体积的饱和氯化钠溶液，混合均匀，14000r/min离心25min，取上层溶液；饱和氯化钠溶液是指室温条件下的饱和氯化钠溶液。

(5)向步骤(4)收集的上层溶液中加入0.5倍体积的质量分数为30％的硫酸钠水溶液，混合均匀后再加入2倍体积的无水乙醇，混合均匀后14000r/min离心25min，收集上层溶液；

(6)将步骤(5)收集的上层溶液冷冻干燥，制成冻干粉，并在0℃保存。

对实施例1～4所述工艺提取的蝎毒素进行抑菌试验测定，结果如下：

实施例5：一种蝎毒素的提取和纯化工艺

一种蝎毒素的提取和纯化工艺，包括下列步骤：

第一步：在7℃条件下，将全蝎成虫用乙醇或乙醚进行麻醉处理，然后剪取各触肢，投入一离心管中，置于-19℃条件下冰冻2.5小时，得到冰冻处理后的样品；

第二步：向所述冰冻处理后的样品中加入1.75倍质量的体积分数为82％的乙醇，然后研磨成浆液，3500r/min离心9.5min，取上清液；

第三步：向所述上清液中加1.2倍体积的无水乙醇，混合均匀后再13000r/min离心23min，取上层蛋白液；

第四步：向所述上层蛋白液加蛋白酶K，57℃条件下处理40分钟，处理结束后加入等体积的无水乙醇，和0.17倍体积的饱和氯化钠溶液，混合均匀，14000r/min离心15min，取上层溶液；

第五步：向第四步得到的上层溶液中加入0.45倍体积的质量分数为20％的硫酸钠水溶液，混合均匀后再加入1倍体积的无水乙醇，混合均匀后再14000r/min离心25min，收集上层溶液；

第六步：对第五步得到的上层溶液进行冷冻干燥，制成冻干粉。

以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

Claims (2)

1.一种蝎毒素的提取和纯化工艺，其特征在于：包括下列步骤：

第一步：在4～8℃条件下，将全蝎成虫用乙醇或乙醚进行麻醉处理，然后剪取各触肢，投入一离心管中，置于-16～-30℃条件下冰冻1～5小时，得到冰冻处理后的样品；

第二步：向所述冰冻处理后的样品中加入1~3.5倍质量的体积分数为75～90%的乙醇，然后研磨成浆液，3000～5000r/min离心5～10min，取上清液；

第三步：向所述上清液中加1～2倍体积的无水乙醇，混合均匀后再12000～14000r/min离心15～25min，取上层蛋白液；

第四步：向所述上层蛋白液加蛋白酶K，56～58℃条件下处理15～45分钟，处理结束后加入等体积的无水乙醇，和0.05～0.2倍体积的饱和氯化钠溶液，混合均匀，12000～14000r/min离心15～25min，取上层溶液；

第五步：向第四步得到的上层溶液中加入0.1～0.5倍体积的质量分数为10～30%的硫酸钠水溶液，混合均匀后再加入1～2倍体积的无水乙醇，混合均匀后再12000～14000r/min离心15～25min，收集上层溶液；

第六步：对第五步得到的上层溶液进行冷冻干燥，制成冻干粉。

2.根据权利要求1所述的蝎毒素的提取和纯化工艺，其特征在于：包括下列步骤：

第一步：在4℃条件下，将全蝎成虫用乙醇或乙醚进行麻醉处理，然后剪取各触肢，投入一离心管中，置于-25℃条件下冰冻4小时，得到冰冻处理后的样品；

第二步：向所述冰冻处理后的样品中加入2.5倍质量的体积分数为80%的乙醇，然后研磨成浆液，4000r/min离心8min，取上清液；

第三步：向所述上清液中加1.5倍体积的无水乙醇，混合均匀后再13000r/min离心20min，取上层蛋白液；

第四步：向所述上层蛋白液加蛋白酶K，58℃条件下处理30分钟，处理结束后加入等体积的无水乙醇，和0.1倍体积的饱和氯化钠溶液，混合均匀，13000r/min离心20min，取上层溶液；

第五步：向第四步得到的上层溶液中加入0.3倍体积的质量分数为25%的硫酸钠水溶液，混合均匀后再加入1.5倍体积的无水乙醇，混合均匀后再13000r/min离心25min，收集上层溶液；

第六步：对第五步得到的上层溶液进行冷冻干燥，制成冻干粉。