CN107551326B

CN107551326B - 一种仿生心脏补片修复材料及其制备方法

Info

Publication number: CN107551326B
Application number: CN201710918726.7A
Authority: CN
Inventors: 韦加娜; 陈锦涛; 陈泰瀛
Original assignee: Guangdong Taibao Medical Science Technology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Taibao Medical Science Technology Co Ltd
Priority date: 2017-09-30
Filing date: 2017-09-30
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2037-09-30
Also published as: CN107551326A

Abstract

本发明属于仿生材料技术领域，公开了一种仿生心脏补片修复材料及其制备方法。所述的仿生心脏补片修复材料按重量份数计由功能化透明质酸30‑60份、甲基丙烯酸酯化明胶5‑15份、金纳米棒1‑5份、人脂肪间充质干细胞0.05‑0.1份、光引发剂0.1‑0.5份组成。本发明方法制备所得的心脏补片修复材料具有高度的仿生学性能，优良的生物活性和生物相容性，无免疫原性，且本发明所制得的仿生心脏补片修复材料通过三维打印技术成型，能根据患者的实际情况建模成型，具有个性化治疗和精准治疗的优点。

Description

一种仿生心脏补片修复材料及其制备方法

技术领域

本发明属于仿生材料技术领域，尤其涉及一种仿生心脏补片修复材料及其制备方法。

背景技术

心肌梗死是对人类威胁较大的疾病，当心脏血管发生梗塞后，导致一定范围内的心肌细胞丢失并且形成纤维组织影响心脏功能。由于成人的心肌细胞不可再生导致这种心脏的损伤是不可逆的。而逆转这种损伤的有效手段是补充失去的心肌细胞，通过直接注射心肌细胞到心肌梗死区域，但是该种方法补充的心肌细胞存活率不高，而且注射后容易发生免疫排斥和畸生胎瘤。组织工程心肌补片应用于心肌梗死后的细胞修复是一种有效的治疗手段。组织工程支架可以模仿正常心肌的结构和功能，诱导心肌细胞的生长和促进在体外的心肌功能化，并且可以修复体内梗死部位的心肌。一个理性的心肌补片应具有（1）良好的弹性模量和较强的机械性能，是支架材料植入后在心脏跳动能保持完整；（2）具有良好的心肌细胞黏附能力或者是有利于心肌细胞生长；（3）构建的支架应该对正常心肌产生的电冲动进行传导，使移植的心肌补片能和心脏同步收缩，防止移植后出现不同步运动导致心率失常。但目前大多数的心肌补片只满足第一个条件，这限制了心肌补片的发展。

心脏组织组织利用窦房结发出电信号传导到整个心脏使心脏按照一定节律收缩，电信号能促进心肌细胞同步收缩并且对心肌细胞特异性蛋白的表达具有很重要的作用。因此具用导电性能的支架或者补片在植入到体内后能实现心肌细胞与支架或补片之间的联系，实现与心脏连成一个整体，传导心脏的电信号使心肌补片和心脏同步收缩，实现梗死区域的资料效果。在众多的导电材料中，金纳米棒具有各向异性的光电性能，对生物组织损伤小和表面易功能化的优点。复合了金纳米棒的水凝胶可以对外界刺激产生响应，在组织修复工程中有良好的前景。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种仿生心脏补片修复材料及其制备方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种仿生心脏补片修复材料，由功能化透明质酸、甲基丙烯酰化明胶、金纳米棒、人脂肪间充质干细胞和光引发剂所制得。

进一步的，所述的仿生心脏补片修复材料按重量份数计由功能化透明质酸30-60份、甲基丙烯酸酯化明胶5-15份、金纳米棒1-5份、人脂肪间充质干细胞0.05-0.1份、光引发剂0.1-0.5份组成。

进一步的，所述的仿生心脏补片修复材料其结构通过CT或者MRI扫描建模，然后通过3D打印机打印成型。

所述的一种仿生心脏补片修复材料的制备方法，具体包括如下步骤；

（1）功能化透明质酸的制备

称取一定量的甲基丙烯酰化透明质酸溶解于蒸馏水中，配制成质量浓度为5%的甲基丙烯酰化透明质酸溶液，称取一定量的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）依次溶解于蒸馏水中配制成EDC/NHS溶液，其中该溶液中1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）的浓度为6mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的浓度为1mg/mL；将甲基丙烯酰化透明质酸溶液和EDC/NHS溶液等体积混合，常温搅拌30-45min，然后加入等体积的浓度为0.3 mg/mL 的2-（2-吡啶基二硫代）乙胺盐酸盐的溶液，常温下搅拌1-2h，最后加入按质量比m甲基丙烯酰化透明质酸:mREDV短肽=1:0.025加入REDV短肽4℃下磁力搅拌4-6h，然后将所得反应液置于透析袋中用蒸馏水透析2-3天，然后置于-80℃冷冻干燥机中冷冻干燥，即得功能化透明质酸，置于-20℃无菌冰箱中备用；

（2）仿生打印前驱溶液的制备

将步骤（1）制备所的功能化透明质酸、甲基丙烯酰化明胶按配方依次溶解于人脂肪间充质干细胞培养基中，然后按配方比加入金纳米棒，磁力搅拌4-6h并且超声处理1-2h，配制成A液，备用；

将正常培养了4-8代的人脂肪间充质干细胞，用胰蛋白酶消化处理，然后加入人脂肪间充质干细胞培养调节细胞浓度，配制成B液；

然后将A液和B液等体积混合，然后按配方比加入光引发剂，即得仿生打印前驱溶液，置于无菌超净台中备用；

（3）心脏补片的仿生制备

将步骤（2）中制备所得的仿生打印前驱溶液，加入到3D打印机的输出泵中，用电脑辅助软件导入成型模型文件，设置打印参数，开始打印，打印结束后将所得的心脏补片修复材料移出打印平台，有生理盐水浸泡5-10min，然后移入装有人脂肪间充质干细胞培养基的培养皿中，放置于37℃二氧化碳浓度为5%的细胞培养箱中培养2-4天，即得一种仿生心脏补片修复材料。

优选的，所述的REDV短肽，其氨基酸序列为Arg-Glu-Asp-Val，购于上海科肽有限公司；

优选的，所述的所述的金纳米棒，其长径比为1.5-7.5，尺寸（长×宽）为30×4nm～90×13nm；

优选的，所述的人脂肪间充质干细胞和人脂肪间充质干细胞培养基，均购于武汉博普生物有限公司，所述的细胞浓度为1×10⁶Cell/mL，所述的光引发剂为VA086光引发剂，购于美国Sigma试剂公司；

更优选的，所述的电脑辅助软为AutoCAD或Solidwork的其中一种，所述的3D打印机为为采用立体光固化成型法（SLA）工作原理的3D打印机，购自3D systems公司，型号为3Dsystems ProX 。

本发明的有益效果为：

（1）本发明以功能化的透明质酸为基质，通过3D打印技术制备的仿生心脏补片修复材料，因为功能化的透明质酸是通过在甲基丙烯酰化透明质酸上接上REDV短肽实现的，REDV短肽可以有利于血管内皮细胞和血小板的黏附，适当本发明所制得的仿生心脏补片修复材料有利于血管内皮细胞和血小板的集聚，加快重建部位的血管化，有利于心肌梗死部位的修复。

（2）本发明以具有良好导电性能的金纳米棒为导电基材使得本发明所公开的一种仿生心肌补片修复材料具有良好的导电性能，使其可以对正常心肌产生的电冲动进行传导，能和心脏同步收缩，防止移植后出现不同步运动导致心率失常。

（3）本发明以人脂肪间充质干细胞为活性成分使得发明所公开的一种仿生心肌补片修复材料具有良好的生物活性，使其在植入后，人脂肪间充质干细胞可以分化成为心肌细胞，有利材料植入后的宿主同化。

附图说明

图1为实施例1～3和对比例进行细胞毒性评价实验的结果对比图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明按如下步骤制备得到一种仿生心脏补片修复材料：

（1）功能化透明质酸的制备

（2）仿生打印前驱溶液的制备

（3）心脏补片的仿生制备

实施例1

按本发明按上述方法制备一种仿生心脏补片修复材料，其中：制备过程中所用的REDV短肽，其氨基酸序列为Arg-Glu-Asp-Val，所用的金纳米棒，其长径比为2.5，尺寸（长×宽）为30×10nm；所用的电脑辅助软为AutoCAD，所用的3D打印机3D systems公司，型号为3Dsystems ProX 的光固化打印机；按重量份数计由功能化透明质酸30份、甲基丙烯酸酯化明胶5份、金纳米棒1份、人脂肪间充质干细胞0.05份、光引发剂0.1份组成。

实施例2

按本发明按上述方法制备一种仿生心脏补片修复材料，其中：制备过程中所用的REDV短肽，其氨基酸序列为Arg-Glu-Asp-Val，所用的金纳米棒，其长径比为2.5，尺寸（长×宽）为30×10nm；所用的电脑辅助软为AutoCAD，所用的3D打印机3D systems公司，型号为3Dsystems ProX 的光固化打印机；按重量份数计由功能化透明质酸45份、甲基丙烯酸酯化明胶10份、金纳米棒2.5份、人脂肪间充质干细胞0.075份、光引发剂0.25份组成。

实施例3

按本发明按上述方法制备一种仿生心脏补片修复材料，其中：制备过程中所用的REDV短肽，其氨基酸序列为Arg-Glu-Asp-Val，所用的金纳米棒，其长径比为2.5，尺寸（长×宽）为30×10nm；所用的电脑辅助软为AutoCAD，所用的3D打印机3D systems公司，型号为3Dsystems ProX 的光固化打印机；按重量份数计由功能化透明质酸60份、甲基丙烯酸酯化明胶15份、金纳米棒5份、人脂肪间充质干细胞0.1份、光引发剂0.5份组成。

实施例4

对比例：一种心肌补片及其制备方法（参考申请号为CN 201610255235.4 实施例1制备得到）。

实验组1～3：为实施例1～3所得的一种仿生心脏补片修复材料。

（1）力学性能的检测：：将上述实施例1～3所制备的一种仿生心肌补片与对比例进行力学评价实验，采用Instron 5575力学试验机测试对比例和实验组的弹性模量，压缩速率设置为0.1mm/min，用于测试的样品的直径为6 mm，高为4.5 mm，并且以新鲜猪心脏组织作为对照组，测试前仪器按说明书调零，而且之后每次测试采用自动复位功能测试，每组样品设置5个平行样，实验结果如表-1示。

表-1 弹性模量测试结果

可以看到通过本发明所公开的方法所制得的一种仿生心肌补片修复材料实施例1～3的弹性模量均明显较对比例高，且与对照组相当，说明本发明所制得的一种仿生心肌补片修复材料具有与正常心肌组织相当的力学性能，满足植入要求。

（2）细胞毒性评价实验：将上述实施例1～3所制备的一种仿生心脏补片修复材料与对比例进行细胞毒性评价实验（按国标GB/T 16886.5-2003进行实验），对比实施例1～3和对比例对的实验结果如图1所示。

细胞毒性检测结果显示实施例1～3在与心肌细胞共培养1天和7天后其对应的细胞相对增殖率均在90%以上，细胞毒性评级为0级，证明其具有良好的细胞形容性，而对比例与心肌细胞共培养1天和7天后其对应细胞相对增殖率分别为80.5%、79.04%细胞毒性评级为1级，具有轻微的细胞毒性。此外，共培养时间的延长实施例1～3的相对相比增殖率均有明显提高，证明本发明所制备的仿生心肌补片修复材料可以促进心肌细胞的生长，有利于心肌梗死区域的修复。

（3）导电性能测试：

将上述实施例1～3所制备的一种仿生心脏补片修复材料与对比例采用四探针法进行导电性能评价，取溶胀平衡状态下的测试样品（直径：15mm，高：5mm），采用KDY-1 型四探针电阻率测定仪测试样品的电阻率ρ，电导率k的计算公式为：k=1/ρ，实验结果如表2示。

表-2 导电性能测试结果

可以看到通过本发明所公开的方法所制得的一种仿生心肌补片修复材料实施例1～3的电导率均明显较对比例高，且随样品中金纳米棒的含量增大而明显增多，有利于心肌补片在植入人体后，电信号通路的构建，有助于梗死部位的细胞生长。

（4）心肌细胞诱导能力评价：

将上述实施例1～3所制备的一种仿生心脏补片修复材料与骨髓间充质细胞（BMSCs）分别共培养1周和4周后，将各组的样品移除，将BMSCs用胰蛋白酶消化、离心、然后按每个孔10⁴个细胞密度接种于预先放置了无菌细胞爬片的24孔板中，每孔内加4%多聚甲醛0.5ml，室温下对细胞进行固定40min，然后用PBS溶液洗2次，每次5 min；每孔内加0.1%Triton X-100 0.5 ml，室温下对细胞孵育30 min，然后用PBS溶液洗2次，每次5 min；然后每孔内加10%的山羊血清，对细胞爬片室温下封闭30min，边缘吸出血清，放入湿盒内，置于4℃冰箱过夜；将爬片从冰箱内取出，室温下放置30 min，PBS洗 2 次后，避光操作，各爬片加终浓度为1μg/mL的DAPI 培养基标记细胞核，染色15min，PBS洗2次；避光操作，分别滴加20μL适当比例稀释（1:200）的二抗（FITC-羊抗兔二抗、PE-羊抗兔二抗），室温下避光孵育30min，PBS洗2次；最后将细胞爬片从24孔板中取出，用荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下阅片，随机选取5个高倍数下的视野（×200），根据荧光染色情况，分别计数每个视野下的荧光染色细胞数（n1）和DAPI染色细胞总数（n），取平均值，以荧光阳性细胞占所有细胞的百分比数表示BMSCs分化为心肌样细胞的转化率。实验结果如表-3示。

表-3 BMSCs细胞转化率

从表-3结果可将实施例1～3在第一周后BMSCs的转化率均在35%左右，无明显差别，但可以看出实施例1～3在与BMSCs共培养1周后可以使部分的BMSCs分化成为心肌细胞，而对比例的转化率为1.5%基本没有诱导BMSCs向心肌细胞分化的能力,随时间推移，在共培养4周后实施例1～3的转化率分别为78.45%、79.64%、85.44%，证明了实施例1～3所制得的仿生心脏瓣膜具有良好的诱导BMSCs分化为心肌细胞的能力，有利于梗死部位的修复。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定；对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举；凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种仿生心脏补片修复材料，其特征在于，所述的仿生心脏补片修复材料由功能化透明质酸、甲基丙烯酰化明胶、金纳米棒、人脂肪间充质干细胞和光引发剂所制得；

所述的一种仿生心脏补片修复材料的制备方法，包括以下步骤：

（1）功能化透明质酸的制备：

称取一定量的甲基丙烯酰化透明质酸溶解于蒸馏水中，配制成质量浓度为5%的甲基丙烯酰化透明质酸溶液，称取一定量的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）依次溶解于蒸馏水中配制成EDC/NHS溶液，其中该溶液中1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）的浓度为6mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的浓度为1 mg/mL；将甲基丙烯酰化透明质酸溶液和EDC/NHS溶液等体积混合，常温搅拌30-45min，然后加入等体积的浓度为0.3 mg/mL 的2-（2-吡啶基二硫代）乙胺盐酸盐的溶液，常温下搅拌1-2h，最后加入按质量比m甲基丙烯酰化透明质酸:mREDV短肽=1:0.025加入REDV短肽4℃下磁力搅拌4-6h，然后将所得反应液置于透析袋中用蒸馏水透析2-3天，然后置于-80℃冷冻干燥机中冷冻干燥，即得功能化透明质酸，置于-20℃无菌冰箱中备用；

（2）仿生打印前驱溶液的制备：

将步骤（1）制备的功能化透明质酸、甲基丙烯酰化明胶按配方依次溶解于人脂肪间充质干细胞培养基中，然后按配方比加入金纳米棒，磁力搅拌4-6h并且超声处理1-2h，配制成A液，备用；

（3）心脏补片的仿生制备：

将步骤（2）中制备所得的仿生打印前驱溶液，加入到3D打印机的输出泵中，用电脑辅助软件导入成型模型文件，设置打印参数，开始打印，打印结束后将所得的心脏补片修复材料移出打印平台，用生理盐水浸泡5-10min，然后移入装有人脂肪间充质干细胞培养基的培养皿中，放置于37℃二氧化碳浓度为5%的细胞培养箱中培养2-4天，即得一种仿生心脏补片修复材料。

2.根据权利要求1所述的一种仿生心脏补片修复材料，其特征在于，所述的仿生心脏补片修复材料按重量份数计由功能化透明质酸30-60份、甲基丙烯酸酯化明胶5-15份、金纳米棒1-5份、人脂肪间充质干细胞0.05-0.1份、光引发剂0.1-0.5份组成。

3.根据权利要求1所述的一种仿生心脏补片修复材料，其特征在于，所述的仿生心脏补片修复材料其结构通过CT或者MRI扫描建模，然后通过3D打印机打印成型。

4.根据权利要求1所述的一种仿生心脏补片修复材料，其特征在于，所述步骤（1）中的甲基丙烯酰化透明质酸，为透明质酸钠通过与甲基丙烯酸酐或者甲基丙烯酸缩水甘油酯反应所得，具体的改性步骤如下：称取一定量的透明质酸钠溶解于蒸馏水中，配制成质量浓度为3%的透明质酸钠溶液，然后加入5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至8-9，然后按摩尔比n透明质酸钠：n甲基丙烯酸酐或甲基丙烯酸缩水甘油酯 = 1:20 加入甲基丙烯酸酐或甲基丙烯酸缩水甘油酯， 10℃下反应24h，加入到截留分子量=14000的透析袋中流水透析3 天，然后置于-80℃冷冻干燥机中冷冻干燥，即得甲基丙烯酰化透明质酸。

5.根据权利要求1所述的一种仿生心脏补片修复材料，其特征在于，所述步骤（1）中的REDV短肽其氨基酸序列为Arg-Glu-Asp-Val，购于上海科肽有限公司。

6.根据权利要求1所述的一种仿生心脏补片修复材料，其特征在于，所述步骤（2）中的甲基丙烯酰化明胶，由明胶和甲基丙烯酸缩水甘油酯反应所制得，具体的改性步骤如下：称取一定量的明胶加入到50℃的PBS磷酸缓冲盐中配制成质量浓度为10%的溶液，然后按体积比V明胶PBS磷酸缓冲盐溶液：V甲基丙烯酸缩水甘油酯=10:0.75加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，50℃下搅拌反应4小时，反应结束，将反应液置于截留分子量为10000的透析袋中透析7天，然后将透析液置于-80℃冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，即得甲基丙烯酰化明胶。

7.根据权利要求1所述的一种仿生心脏补片修复材料，其特征在于，所述步骤（2）中的金纳米棒，其长径比为1.5-7.5。

8.根据权利要求1所述的一种仿生心脏补片修复材料，其特征在于，所述步骤（2）中的人脂肪间充质干细胞和人脂肪间充质干细胞培养基，均购于武汉博普生物有限公司，所述的细胞浓度为1×10⁶Cell/mL，所述的光引发剂为VA086光引发剂，购于美国Sigma试剂公司。

9.根据权利要求1所述的一种仿生心脏补片修复材料，其特征在于，所述步骤（3）中的电脑辅助软件为AutoCAD或Solidwork的其中一种，所述的3D打印机为采用立体光固化成型法SLA工作原理的3D打印机，购自3D systems公司，型号为3D systems ProX 。