CN107505404B - 一种分离分析左奥硝唑磷酸酯或其药用盐有关物质的hplc方法 - Google Patents

一种分离分析左奥硝唑磷酸酯或其药用盐有关物质的hplc方法 Download PDF

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Abstract

本方法公开了一种分离分析左奥硝唑磷酸酯或其药用盐有关物质的HPLC方法，采用高效液相色谱法，以C18、苯基柱、氰基柱为色谱柱，缓冲液（pH值2～9）与有机溶剂以一定比例组成流动相，该方法可以快速有效准确的分离分析左奥硝唑磷酸酯或其药用盐的有关物质。

Description

一种分离分析左奥硝唑磷酸酯或其药用盐有关物质的HPLC 方法
技术领域
本发明涉及一种高效液相分析方法，具体的说是一种左奥硝唑磷酸酯或其药用盐有关物质分离分析测定。
背景技术
左奥硝唑磷酸酯或其药用盐是左奥硝唑的前体药物，左奥硝唑磷酸酯或其药用盐进入体内可以通过碱性磷酸酶的作用，代谢为左奥硝唑，从而发挥药效作用。左奥硝唑是一种广谱的三唑类抗真菌药,其适应症如下：用于治疗由脆弱拟杆菌、狄氏拟杆菌、卵园拟杆菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、梭状芽胞杆菌、真杆菌、消化球菌和消化链球菌、幽门螺杆菌、黑色素拟杆菌、梭杆菌、C02噬织维菌、牙龈类杆菌等敏感厌氧菌所引起的多种感染性疾病，包括：(1)腹部感染：腹膜炎、腹内脓肿、肝脓肿等；(2)盆腔感染：子宫内膜炎、子宫肌炎、输卵管或卵巢脓肿、盆腔软组织感染、嗜血杆菌阴道炎等；(3)口腔感染：牙周炎、尖周炎、冠周炎、急性溃疡性龈炎等；(4)外科感染：伤口感染、表皮脓肿、褥疮溃疡感染、蜂窝组织炎、气性坏疽等；(5)脑部感染：脑膜炎、脑脓肿；(6)败血症、菌血症等严重厌氧菌感染等。2.用于手术前预防感染和手术后厌氧菌感染的治疗。
我们在开发左奥硝唑磷酸酯或其药用盐的过程中发现该化合物没有现成分离有关物质的方法，而且在公开发表的文献中也没有发现该化合物有关物质的分离方法。这种现状使得该化合物有关物质分析没有统一的标准，极大的阻碍了该化合物的引用和推广。因此，建立一套有效、稳定的有关物质测定分离方法是十分必要的。
左奥硝唑磷酸酯或其药用盐及其中间体及杂质的结构式如下：
Figure GDA0003619911560000011
左奥硝唑磷酸酯或其药用盐(X代表H、Na、K、氨基酸)
Figure GDA0003619911560000021
以上各杂质从结构上考察，部分杂质与左奥硝唑磷酸酯或其药用盐结构非常相似，从极性角度考虑，又有部分杂质与左奥硝唑磷酸酯或其药用盐存在极大的极性差异；所以在同一色谱条件下将上述各杂质完全有效分离是非常困难的，这使得寻找一种既要求相似结构杂质能有效分离又要兼顾弱极性杂质能够有效检出的色谱条件成为必要。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的缺陷，提供一种左奥硝唑磷酸酯或其药用盐及含有左奥硝唑磷酸酯或其药用盐的相关制剂进行有关物质的分离分析方法。
根据需要，我们在开发左奥硝唑磷酸酯或其药用盐的过程中，重点研究了左奥硝唑磷酸酯或其药用盐的高效液相色谱分离方法。
本方法所说的用高效液相色谱法分析分离左奥硝唑磷酸酯或其药用盐有关物质的方法，是以C18、氰基、苯基键合硅胶为色谱柱填充剂，缓冲液(pH值2.0～9.0)与有机溶剂以一定配比组合为流动相；流速为0.5～2.0ml/min；柱温为0～50℃；进样体积为0.1～100μl；检测器为紫外检测器和二极管阵列检测器；检测波长为200～400nm；使用等度或梯度进行洗脱分离。
本发明所述的色谱柱填充剂选自下列键合硅胶：C18硅烷键合硅胶、氰基硅烷键合硅胶、苯基硅烷键合硅胶。
本发明所述的有机溶剂选自下列溶剂：乙腈、甲醇、乙醇、四氢呋喃、正丙醇、异丙醇。
本发明所述的缓冲液的pH值为2.0～9.0，所述的缓冲液的pH值优选为5.0～8.0；最优选为5.5～7.5。
本发明所述的缓冲液为磷酸二氢钾缓冲液体系、离子对试剂：醋酸-醋酸钠缓冲液体系、离子对试剂：磷酸二氢钠-磷酸体系、离子对试剂：磷酸二氢钠-三乙胺体系、离子对试剂：磷酸二氢钾-磷酸体系、离子对试剂：磷酸二氢钾-三乙胺体系、离子对试剂：磷酸氢二钠-磷酸体系、离子对试剂：磷酸氢二钾-磷酸体系、离子对试剂：磷酸氢二铵-磷酸体系、离子对试剂：磷酸二氢铵-磷酸体系。
本发明所述的检测波长为200～400nm；优选300～350nm；最优选310～330nm。
本发明所述的流速为0.5～2.0ml/min；优选0.6～1.5ml/min；最优选0.8～1.2ml/min。
本发明所述的柱温为0～50℃；优选20～40℃；
本发明所述的等度条件为有机相-水相(15％～25％):(85％～75％)(V/V)。
本发明所述的梯度条件为0～10分钟时，混合后流动相中的有机相比例为5％～30％，在10～60分钟时，逐渐增加有机相比例至15％～40％，保持0～50分钟，然后在10分钟内将有机相比例降回5％～30％。
本发明所述的有关物质的分离分析方法，可按照以下方法实现：
(1)取左奥硝唑磷酸酯或其药用盐适量，采用适宜介质溶解稀释配制成供试品溶液。
(2)取上述杂质适量，采用适宜介质溶解稀释配制成杂质溶液。
(3)流动相：A相：取庚烷磺酸钠0.606g、磷酸二氢钾6.80g加入到1000ml水中，搅拌溶解，用三乙胺调节pH至6.5；B相：甲醇。
(4)梯度条件
时间(min) A(％) B(％)
0 85 15
5 85 15
10 75 25
30 75 25
35 85 15
50 85 15
(5)流速为1.0ml/min；检测波长321nm；柱温25℃；C18柱。
(6)取(1)的供试品溶液和(2)的杂质溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，色谱图见附图1和附图2。
附图说明
图1为左奥硝唑磷酸酯HPLC色谱图。
图2为左奥硝唑磷酸酯与其杂质的HPLC色谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但这些实施例不得用于解释本发明保护范围的限制。
实施例1
实验仪器及条件
高效液相色谱仪：Thermo高效液相色谱仪Ultimate 3000；
色谱柱：C18250×4.6mm，5μm；
流动相：甲醇：缓冲液(取庚烷磺酸钠0.606g、磷酸二氢钾6.80g加入到1000ml水中，搅拌溶解，用三乙胺调节pH至6.5)＝15:85；
流速：1.0ml/min；
检测波长：321nm；
柱温：25℃；
进样体积20μl。
取左奥硝唑磷酸酯或其药用盐及上述杂质，用适宜介质溶解稀释制成供试品溶液和杂质溶液，取供试品溶液及杂质溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，结果如下：
样品 保留时间(min) 分离度
杂质A 4.520 18.48
杂质B 8.859 7.35
杂质D 10.538 10.63
主药 13.252 6.38
杂质C 15.468 12.74
杂质E 17.692 25.59
杂质F 28.481 —
该色谱条件，基本能检查所有杂质，最晚出峰的杂质F保留时间为28.481min，基本满足测定要求。
实施例2
实验仪器及条件
高效液相色谱仪：Thermo高效液相色谱仪Ultimate 3000；
色谱柱：C18250×4.6mm，5μm；
流动相：A相：缓冲液(取庚烷磺酸钠0.606g、磷酸二氢钾6.80g加入到1000ml水中，搅拌溶解，用磷酸调节pH至3.00)；B相：甲醇；梯度条件如下：
Figure GDA0003619911560000051
Figure GDA0003619911560000061
流速：1.0ml/min；
检测波长：321nm；
柱温：25℃；
进样体积20μl。
取左奥硝唑磷酸酯或其药用盐及上述杂质，用适宜介质溶解稀释制成供试品溶液和杂质溶液，取供试品溶液及杂质溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，结果如下：
样品 保留时间(min) 分离度
杂质A 4.441 18.33
杂质B 7.828 6.09
杂质D 9.343 9.78
主药 11.837 4.20
杂质C 12.793 11.34
杂质E 15.594 19.79
杂质F 23.161 —
该色谱条件最长的杂质保留时间为23.161min，该方法可有效检出各杂质。
实施例3
实验仪器及条件
高效液相色谱仪：Thermo高效液相色谱仪Ultimate 3000；
色谱柱：C18柱250×4.6mm，5μm；
流动相：甲醇:缓冲液(磷酸二氢钾6.80g加入到1000ml水中，搅拌溶解，用磷酸调节pH至6.5)＝75:25。
流速：1.0ml/min；
检测波长：321nm；
柱温：25℃；
进样体积：20μl。
取左奥硝唑磷酸酯或其药用盐及上述杂质，用适宜介质溶解稀释制成供试品溶液和杂质溶液，取供试品溶液及杂质溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，结果如下：
样品 保留时间(min) 分离度
杂质A 4.502 8.57
杂质B 5.583 3.38
杂质D 7.253 6.62
主药 10.652 8.29
杂质C 11.337 2.30
杂质E 12.795 15.36
杂质F 20.108 —
该色谱条件最长的杂质保留时间为20.108min，该方法可有效检出各杂质。
实施例4
实验仪器及条件
高效液相色谱仪：Thermo高效液相色谱仪Ultimate 3000；
色谱柱：C18250×4.6mm，5μm；
流动相：A相：缓冲液(取辛烷磺酸钠0.606g、磷酸二氢钾6.80g加入到1000ml水中，搅拌溶解，用磷酸调节pH至6.5)；B相：甲醇；梯度条件如下：
时间(min) A(％) B(％)
0 80 20
10 80 20
15 65 35
45 65 35
50 80 20
60 80 20
流速：1.0ml/min；
检测波长：321nm；
柱温：25℃；
进样体积：20μl。
取左奥硝唑磷酸酯或其药用盐及上述杂质，用适宜介质溶解稀释制成供试品溶液和杂质溶液，取供试品溶液及杂质溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，结果如下：
样品 保留时间(min) 分离度
杂质A 5.649 14.03
杂质B 9.282 6.68
杂质D 12.726 6.43
主药 15.580 5.20
杂质C 17.874 3.90
杂质E 19.623 54.37
杂质F 35.366 —
该色谱条件最长的杂质保留时间为25.366min，该方法可有效检出各杂质。

Claims (1)

1.一种分离分析左奥硝唑磷酸酯或其药用盐有关物质的HPLC方法，其特征在于以C18为色谱柱填充剂，流动相为缓冲液与甲醇，流速为0.5～1.0ml/min，柱温为0～25℃，检测波长：321～400nm，进样体积为0.1～20μl，使用梯度进行洗脱分离；
其中，所述缓冲液的配制方法为：取庚烷磺酸钠0.606克、磷酸二氢钾6.80克加入到1000ml水中，搅拌溶解，用磷酸调节pH为3.0；
所述梯度条件为0～5分钟时，混合后流动相中的有机相比例为15％，在5～10分钟时，调高有机相比例至25％，保持20分钟，在30～35分钟时，调低有机相比例至15％，保持15分钟；
所述有关物质包括：
Figure FDA0003619911550000011
Figure FDA0003619911550000012
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