CN107412869A

CN107412869A - 定向释放负载生长因子的胶原基双层膜材料及其制造方法

Info

Publication number: CN107412869A
Application number: CN201710228443.XA
Authority: CN
Inventors: 李学敏; 张其清; 杨文裕; 曹汀; 曹一汀
Original assignee: Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Priority date: 2017-04-10
Filing date: 2017-04-10
Publication date: 2017-12-01
Anticipated expiration: 2037-04-10
Also published as: CN107412869B

Abstract

本发明涉及一种定向释放生长因子的胶原基双层膜材料及其制造方法，它以胶原，生长因子，纤维蛋白原和凝血酶为原料制备，分别制备致密层和疏松层胶原膜，并由纤维蛋白粘合致密层胶原膜和疏松层胶原膜构成的双层膜结构。膜表面可负载生长因子，每平方厘米生长因子用量为1‑10000ng；双层膜的负载生长因子的量优选每平方厘米30ng；双层膜的平均厚度优选为1‑5 mm。该材料对其负载的生长因子有定向控制释放作用，定向释放生长因子并作用于靶组织，可用于病缺损组织的修复治疗。本发明制备的双层胶原膜所负载的生长因子具有靶向释放作用，可定向释放生长因子到靶组织并保持生长因子活性，可应用于引导诱导组织的再生修复。

Description

定向释放负载生长因子的胶原基双层膜材料及其制造方法

技术领域

本发明涉及一种定向释放负载生长因子的胶原基双层膜材料及其制造方法，该材料对其负载的生长因子有定向控制释放作用，定向释放的生长因子作用于靶组织，该材料可用于病缺损组织的修复治疗。

背景技术

胶原（Collagen）是细胞外最重要的水不溶性纤维蛋白，是构成细胞外基质的骨架。胶原在细胞外基质中给细胞提供抗张力和弹性,并在细胞的迁移和发育中起作用。它广泛地存在于人体的皮肤、骨骼、肌肉、软骨、关节、头发组织中，起着支撑、修复、保护的三重抗衰老作用。胶原的含量丰富，几乎占了蛋白总重的30％以上。胶原因具有良好的生物相容性、可塑性强、无毒副作用、生物降解性和不引起机体免疫反应等优良的理化特性而被广泛的应用于组织工程的生物材料的研究和利用中。同时，胶原还具有促进细胞的粘附、增殖和分化的作用，有利于组织损伤的修复。但是，单一的胶原材料存在生物活性低下的问题，通过负载生长因子使其获得较高的生物活性是目前组织工程研究的主要方向。

当下，复合生长因子的组织修复材料仍被广泛的研究和应用。引入与细胞增生和分化以及组织损伤修复相关的多种生长因子，是提高组织修复材料生物活性的有效途径。生长因子是一类通过与特异的、高亲和性的细胞膜受体结合，从而调节细胞的生长、增殖和分化等多种功能的多效应的多肽类物质。在引导组织再生修复的过程中加入生长因子的目的在于模仿机体组织损伤后的生理过程来刺激或者促进损伤组织的生理性修复，或者纠正机体的病理性修复向生理性修复。生长因子能引起一系列广泛的分子生物学、生物化学和形态学上的级联反应，最终达到引导诱导组织再生修复的效果。生长因子大都存在半衰期短和易降解的生物学特性，所以在引导组织再生材料中引入生长因子时必须考虑生物学活性的保护与释放量的控制。可生物降解和吸收的生物支架材料既可以成为生长因子的载体，又可以根据生物体的需要量以合适的浓度将生长因子定向控制释放到靶组织以达到引导诱导组织损伤修复的目的。但多数研究使用有机溶剂等较为剧烈的条件，可能造成生长因子活性的降低或者损失；同时生长因子的释放多数存在不可控的现象，导致生长因子释放以及作用的广泛性和没有靶向性，即生长因子既可以释放作用于目标病损组织，又会释放作用于目标病缺损组织周围，从而产生不可预见的生理生化作用。因此，有必要设计新型生长因子定向控制释放体系，进而制备复合生长因子的引导诱导组织再生修复的组织工程材料，用于引导和刺激病损组织的再生修复。有研究通过在不同温度的冷冻下，使胶原材料形成孔径大小不同的膜。同时还有研究在胶原材料中加入组氨酸，并通过改变EDC/NHS对胶原材料的交联时间，从而达到改变材料孔径的效果，并且EDC/NHS的交联具有交联效果好且可控，又具有无毒性的特点。有研究结果表明胶原材料的结构与药物释放率和释放方向有明显的相关性。根据以上研究结果，同时利用胶原材料作为生长因子的载体，制备具有不同致密程度的双层胶原复合材料，可能获得对生长因子有定向控制释放作用的胶原基复合材料。

中国专利CN201010179027.3公开了一种负载生长因子的胶原基复合材料及其制造方法。它是以胶原、生长因子、壳聚糖、肝素纳为原料制备，由致密层胶原膜和疏松层胶原膜组成双层结构，双层中间复合包载生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子;制备方法包括致密胶原膜和疏松胶原膜的制备、载生长因子的纳米粒子制备、胶原膜与纳米粒子复合等步骤。但是，该致密层胶原膜和疏松层胶原膜组成双层结构是中间置有包载生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒。该材料存在双层膜结构复合不够紧密、易剥离以及负载生长因子需要量大等缺点，可控性差，从而影响材料的生物活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定向释放负载生长因子的胶原基双层膜材料及其制造方法和应用。该材料对其负载的生长因子有定向控制释放作用，定向释放生长因子作用于靶组织。本发明可以克服现有组织修复的胶原材料生物活性的不足、及目前生长因子的递送无组织或细胞靶向性和释放行为可控性差等问题，提供一种定向释放生长因子的胶原基双层膜材料，可用于病缺损组织的修复治疗。它是用于组织缺损修复的新型复合材料。该材料具有主动诱导缺损处组织再生修复的生物学活性，同时实现生长因子定向控制释放于靶组织缺损处，起到促进或引导组织缺损的生理性修复，同时避免生长因子无序及不可控释放造成的不可预知及不必要的生理或者病理作用。

本发明提供的定向释放负载生长因子的胶原基双层膜材料是以胶原、生长因子、纤维蛋白原和凝血酶为原料制备，由致密层胶原膜和疏松层胶原膜组成双层膜结构组成。纤维蛋白原和凝血酶起到粘合致密层和疏松层胶原的作用，同时对两层胶原膜起到一定的阻隔作用，使负载于两侧膜上的生物活性物质不会相互渗透。

该交联的致密-疏松双层胶原膜生长因子用量为每平方厘米1-10000 ng；双层膜的平均厚度为1-5mm。

具体制备工艺：胶原溶胀液在不锈钢或者聚四氟乙烯托盘中置于-80℃预冻，真空冷冻干燥后，压平，于交联液中交联后再次真空冷冻干燥，得结构致密的胶原膜；而疏松结构的胶原膜则在-40℃将胶原溶胀液冷冻后，真空冻干，压平，再至于交联液中交联后冻干；为了便于将结构疏松胶原膜区分，致密结构胶原膜用台盼蓝溶液染色；在致密胶原膜的一侧涂抹上纤维蛋白原溶液，疏松胶原膜的一侧涂抹凝血酶溶液后将两片胶原膜利用纤维蛋白原和凝血酶的化学法粘合后再结合压膜机的物理粘合法将致密层和疏松层胶原膜粘合紧密并压平；在胶原双层膜的一侧滴加单一生长因子溶液或在胶原膜两侧滴加相同或者不同的生长因子溶液，风干，令其负载于胶原膜上。

所述的胶原膜可以负载生长因子、活性多肽或包含生长因子的微米、纳米微粒，其特征在于双层胶原膜的疏松层一侧或致密层一侧可以只负载一种生长因子、活性多肽或包含生长因子的微米、纳米微粒，或者双层胶原膜的疏松层和致密层双侧可以负载不同的生长因子、活性多肽或包含生长因子的微米、纳米微粒。

本发明提供的负载定向释放生长因子的胶原基双层膜材料的制备方法包括以下步骤：

（1）将胶原溶液用0.3%丙二酸稀释成浓度为0.1-0.6%质量百分比浓度的胶原溶胀液，将胶原溶胀液倒入容器中，-80℃预冻后真空冷冻干燥，再加入交联液进行交联，再次冷冻干燥后压平，即得交联的致密层胶原膜。

（2）将0.1-0.6%的胶原溶胀液加入容器后，-40℃冷冻后真空冷冻干燥，取出压平，置于交联液中交联后再次冻干，即得交联的疏松层胶原膜。

交联液配方：10-60 mmol/L 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺（EDC）+3-30mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）+50mmol/L磷酸二氢钾溶液。

（3）将得到的致密层胶原膜用0.0001%-0.001%的台盼蓝溶液中浸泡后冻干，即得染色后的致密层胶原膜。用于区分疏松层胶原膜。

（4）在交联的致密层胶原膜一侧涂抹1-200 mg/mL纤维蛋白原，在交联的疏松层胶原膜一侧涂抹50-600 IU/mL 凝血酶，利用纤维蛋白原和凝血酶化学反应生成纤维蛋白胶的化学粘合法将两片胶原膜粘合成双层胶原膜，10-37ºC下风干，再利用压膜机的物理粘合法将双层胶原膜进一步压平和粘合，即得具有致密-疏松结构的胶原双层膜材料。

（5）将致密-疏松胶原双层膜材料的疏松层或致密层一侧朝上，并在上面均匀滴加生长因子溶液，4-8℃下风干或冷冻干燥，即得负载单一生长因子的胶原双层膜材料；将胶原双层膜材料的疏松层或致密层一侧朝上，在其上面均匀滴加生长因子溶液，干燥后在其另外的一侧可以滴加相同或不同的生长因子，即得双侧负载生长因子的胶原双层膜材料。

所述的胶原可以为Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原或Ⅹ型胶原。所述的胶原可为牛腱来源，也可以是其他种属动物如鼠尾来源的胶原蛋白。

步骤（2）的胶原膜交联反应用的是EDC和NHS催化胶原纤维形成酰胺键的化学交联法，该方法具有无毒、生物相容性良好的特点。也可以采用光化学法、真空干热交联等物理方法或者戊二醛、京尼平等化学试剂交联。

所述的负载生长因子为碱性成纤维生长因子、骨形态发生蛋白、转化生长因子-β、胰岛素样生长因子、血小板衍生生长因子以及人工合成的上述这些生长因子的活性肽中的一种或一种以上混合使用或者包含生长因子的微米、纳米微粒。

本发明的特点为：所制备复合材料具有致密层和疏松层双层结构，通过纤维蛋白原和凝血酶通过反应将两层膜紧密粘合形成双层膜结构。纤维蛋白原和凝血酶不仅可以通过反应将两层膜紧密粘合，而且可以在双层胶原膜间形成阻隔，使胶原膜一侧负载的生长因子不会渗透扩散到另一侧胶原膜上，从而对生长因子起到定向控制释放的作用。通过胶原膜结构疏密程度可以控制所负载生长因子的释放行为。胶原基复合材料具有定向释放生长因子的作用，即只能由疏松层或致密层释放一种生长因子，或者由疏松层和致密层分别释放不同的生长因子，膜两侧所负载的生长因子的相互渗透被双层胶原膜阻隔所限制。

本发明是针对发明专利CN201010179027.3 的大幅度进行结构改进和优化。本发明通过纤维蛋白原与凝血酶原间的相互作用可以使双层膜结构能够更好地结合，方便实际使用。同时由于生长因子负载于材料表面，直接可以作用于靶组织或靶细胞，大大提高了胶原材料的生物活性，因此可以减少生长因子的需要量，并且实现不同生长因子的负载。

本发明提供的负载生长因子的致密-疏松胶原双层膜材料用于主动引导诱导病损组织的再生修复，该双层胶原膜材料有定向控制释放所负载的生长因子的作用，体外的释放周期为0-24小时。所述的定向控制释放作用表现为：生长因子由疏松层向靶组织定向控制释放而不会由疏松层渗透至致密层并向非靶组织释放；生长因子也可以由致密层向靶组织定向控制释放而不会透过致密层向非靶组织释放；当致密层和疏松层负载不同的生长因子时，所负载生长因子不会交叉渗透，而被释放至各自的靶组织或细胞。

本发明所述的定向控制生长因子释放的胶原双层膜材料分别具有致密层和疏松层两层结构，致密层和疏松层胶原膜均可负载生长因子，具有结构稳定、无毒副作用、生物相容性良好以及可生物降解等特点，对其中负载的生长因子具有良好的活性保护和定向控制释放作用，从而实现生长因子靶向递送，主动引导诱导特定的病损组织再生修复。该胶原双层膜复合材料还具有低免疫原性和可塑性好的特点，而且各种原料丰富易得，制备工艺简单以及制备条件温和，是一种较好的定向控制生长因子、引导诱导病理缺损组织再生修复的生物医学材料。

附图说明

图1为胶原双层膜的致密层和疏松层的扫描电镜图。

图2为FGF2接上Cy5.5-NHS酯的荧光图像。

图3为FGF2-Cy5.5滴加于胶原膜上的荧光图像（图中左侧为未滴加FGF2-Cy5.5面，右侧为滴加FGF2-Cy5.5面）。

图4为体外释放池的结构图(正视图与测视图)。

图5为体外释放实验后的胶原双层膜。

图6为负载BSA的胶原双层膜在释放池中的体外累积释放百分率曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细、完整的说明。

下述实施例中所涉及的具体实验方法和设备如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施；所涉及的试剂均为市售。

实施例1：致密层和疏松层胶原膜的制备

1. 牛腱Ⅰ型胶原溶胀液的制备

将市购新鲜的牛肌腱充分清洗，去除肌腱周围组织及腱鞘和筋膜等结缔组织，洗涤后置冷柜中冷冻。取出冷冻牛肌腱横向切成厚约1 mm切片，加入无花果蛋白酶溶液（浓度0.05-0.25%）处理，搅拌后置恒温箱内酶解24 h，再加过量H₂O₂终止反应，蒸馏水冲洗3-4次，滗干后加0.3%丙二酸溶液溶胀24 h。溶胀后的腱片充分搅拌6 h，用0.3%的丙二酸溶液调节粘度，80-120目不锈钢网正压过滤，除去杂质和未溶胀物，封装即得。

2. 致密层胶原膜的制备

取上述制备的胶原溶胀液，加0.3%丙二酸溶液稀释至0.6%质量百分比浓度，充分搅拌，放置于4℃冰箱充分溶胀5天。取250 g胶原溶胀液加入面积14 cm x 12 cm x 1.5 cm容器中，-80℃预冻24h，真空冷冻干燥，取出冻干胶原膜置于两块聚四氟乙烯平板之间压平整24h，即得致密层胶原膜。

3．疏松层胶原膜的制备

将上述的0.6%的胶原溶胀液取250 g加入14 cm x 12 cm x 1.5 cm容器中，-40℃预冻24h，真空冷冻干燥，取出冻干胶原膜置于两块聚四氟乙烯平板之间压平整24h，即得疏松层胶原膜。

4．致密层胶原膜和疏松层胶原膜的交联

4.1．交联液配方：33 mmol/L 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺（EDC）+6 mmol/LN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）+ 50 mmol/L 磷酸二氢钾溶液。

4.2．致密层胶原膜的交联

将致密层胶原膜置于交联液中室温下反应4 h，取出，在0.1 mol/L Na₂HPO4溶液浸泡清洗2遍，然后用去离子水中浸泡清洗4遍，-80℃冻干，再平整1天即得交联的致密层胶原膜。

制得的致密层胶原膜在扫描电镜下观察胶原纤维排列整齐且结构致密，孔径较小或者看不到孔洞，见图1左图。

4.3．疏松层胶原膜的交联

将疏松层胶原膜置于交联液中室温下反应4 h，取出，在0.1 mol/L Na₂HPO4溶液浸泡清洗2遍，然后用去离子水中浸泡清洗4遍，-40℃冻干，再平整1天即得交联的疏松层胶原膜。

制得的疏松层胶原膜在扫描电镜下观察胶原纤维不整齐，结构疏松，孔径较大，见图1右图。

实施例2：制备致密-疏松胶原双层膜

将上述实施例中的交联的致密层胶原膜一侧滴加80mg/mL纤维蛋白原溶液，铺满整个表面；再将交联的疏松层胶原膜一侧滴加400IU/mL凝血酶溶液，同样铺满整个表面；然后将两种胶原膜重叠平铺粘合在一起，利用凝血酶和纤维蛋白原结合快速反应形成纤维蛋白胶的化学反应粘合胶原双层膜，风干；再利用压膜机压平，即得具有致密-疏松胶原双层膜材料。双层膜的平均厚度为1 mm。

实施例3：Cy5.5-NHS酯标记FGF2

1．称取Cy5.5-NHS酯0.46mg，溶于100uL 二甲基亚砜溶液中。

2．将FGF2配制成100ug/mL 的溶液，pH值为8.0以上。

3．取20uL FGF2溶液，加入1uL Cy-5.5-NHS酯溶液，混匀，避光，室温下反应至少4小时。

4．将FGF2与Cy5.5-NHS酯的反应液在超滤管中超滤，10000转，20分钟，超滤8遍，超滤管中的反应液由蓝色变为无色，收集超滤管中反应液。

5．活体成像仪中检测反应液Cy-5.5标记的FGF2，见图2。

6．将标记Cy5.5的FGF2溶液滴加到实施例2的致密-疏松胶原双层膜中疏松层一侧，活体成像仪中观察发现FGF2溶液不会渗透过疏松层胶原膜而进入致密层胶原膜，见图3。

7．将负载Cy5.5-FGF2的胶原双层膜在特制的释放池中，磷酸盐缓冲液中振荡浸泡1小时，活体成像仪中观察发现FGF2仍不会随释放液透过疏松层胶原膜而进入致密层胶原膜。

实施例4：致密-疏松胶原双层膜材料的体外释放动力学实验

上述复合材料可以负载碱性成纤维生长因子（FGF2）、骨形成蛋白（BMP）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）等多种生物活性因子或者单一或多种生长因子制备的微球或者纳米粒子，上述制备的致密-疏松双层胶原膜生长因子优选用量为每平方厘米30ng，以适用于多领域或不同修复阶段的组织修复。以牛血清白蛋白（BSA）为模型因子，进行负载BSA胶原复合材料体外释放动力学研究。

配置pH值为8.3的10xPBS缓冲液，称取2mg BSA，加入38uL 实施例3中的Cy5.5-NHS酯溶液，再加入362uL 10xPBS缓冲液，混匀，室温避光反应过夜(14小时)。超滤后得到400uL标记Cy5.5的BSA溶液。

所用超滤液为1xPBS缓冲液，Ph值为7.4。

将Cy5.5-BSA溶液通过荧光分光光度仪进行定量，确定Cy5.5-BSA溶液的荧光单位质量强度，激发光波长为673nm，发射光波长为707nm。

实施例2中的致密-疏松胶原双层膜裁剪成1cm²大小的正方形，在疏松层一侧的正中间6mm直径范围内滴加18.313ng Cy5.5-BSA溶液，风干，将负载BSA的胶原双层膜放置在特制释放池中，固定好，释放池的两端均加入释放液，37℃恒温震荡箱释放。

应用分隔释放池法进行检测：特制的分隔释放池为聚四氟乙烯，外壁直径42mm，内径直径为6mm，连通两端的释放池上均有两个小孔道，一个用于加液或者取液，一个用于排气，这样的设计可以很好的让胶原膜和释放液接触，负载BSA的致密-疏松胶原双层膜固定于内径之中，见图4。并在两端加入释放液，在确定释放池密封性能良好，释放液不会漏出耗损之后，将释放池放在37℃恒温振荡箱中进行体外释放实验。释放液为PBS缓冲液，两端各加入2mL的量。分别取两端的释放液进行荧光强度检测，并计算BSA的累积释放量（以小时为单位）以及检测另外一侧释放池有无BSA释放。

37℃下，在PBS的水溶液溶胀作用以及冲刷作用下，疏松层胶原膜负载的BSA在8小时后致密疏松胶原双层膜仍能很好的维持其结构完整性（见图5）且在疏松膜一侧的累积释放量约为80%（见图6），而在致密层胶原膜一侧的释放液中未能检测出Cy5.5的荧光强度，说明该胶原双层膜具有定向控制释放所负载的生长因子的作用。

Claims

1.一种定向释放负载生长因子的胶原基双层膜材料，由致密层胶原膜和疏松层胶原膜组成的双层膜结构，其特征在于它是以胶原、生长因子、纤维蛋白原、凝血酶为原料制备，致密层胶原膜和疏松层胶原膜组成的双层膜结构的中间用纤维蛋白原和凝血酶通过生化反应将两层膜紧密粘合并起到隔绝作用；胶原膜上负载多种生长因子，并且定向控制释放所负载的生长因子；

具体制备工艺：胶原溶胀液在-80℃急速冷冻，冻干，于交联液中交联，冻干，压平，即得结构致密胶原膜；胶原溶胀液在-40℃预冻后冻干，于交联液中交联，冻干，压平，即得结构疏松胶原膜；配制纤维蛋白原和凝血酶原溶液，分别涂抹于胶原膜一侧，将两片结构不同的胶原膜粘合，晾干，压平，得到致密疏松双层胶原膜；在胶原膜的疏松层一侧或致密层一侧或疏松层和致密层双侧负载生长因子、活性多肽或包含生长因子的微米、纳米微粒，风干或冻干即可。

2.根据权利要求1所述的负载定向释放生长因子的胶原基双层膜材料，其特征在于所述的胶原膜负载生长因子为碱性成纤维生长因子、骨形态发生蛋白、转化生长因子-β、胰岛素样生长因子、血小板衍生生长因子，以及人工合成的上述这些生长因子的活性肽中的一种或一种以上混合使用，或者包含生长因子的微米、纳米微粒。

3.根据权利要求1所述的负载定向释放生长因子的胶原基双层膜材料，其特征在于双层胶原膜的疏松层一侧或致密层一侧只负载一种生长因子、活性多肽或包含生长因子的微米、纳米微粒；或者双层胶原膜的疏松层和致密层双侧负载不同的生长因子、活性多肽或包含生长因子的微米、纳米微粒。

4.根据权利要求1所述的负载定向释放生长因子的胶原基双层膜材料，其特征在于所述的致密疏松胶原双层膜负载的生长因子量为1-10000ng/cm²；所述的致密疏松胶原双层膜的平均厚度为1-5mm；优选每平方厘米30ng，双层膜的平均厚度为1 mm。

5.根据权利要求1所述的负载定向释放生长因子的胶原基双层膜材料，其特征在于所述的起到粘合胶原双层膜及隔绝作用的纤维蛋白原与凝血酶原的浓度分别为1-200 mg/mL及50-600 IU/mL。

6.权利要求1所述的负载定向释放生长因子的胶原基双层膜材料的制备方法，其特征在于包括的步骤：

（1）将胶原溶液用0.3%丙二酸稀释成浓度为0.1-0.6%质量百分比浓度的胶原溶胀液，将胶原溶胀液倒入容器中，-80℃预冻后真空冷冻干燥，再加入交联液进行交联，再次冷冻干燥后压平，即得交联的致密层胶原膜；

（2）将0.1-0.6%的胶原溶胀液加入容器后，-40℃冷冻后真空冷冻干燥，取出压平，置于交联液中交联后再次冻干，即得交联的疏松层胶原膜；

交联液配方：10-60 mmol/L 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺（EDC）+ 3-30mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）+ 50 mmol/L 磷酸二氢钾溶液；

（3）将得到的致密层胶原膜用0.0001%-0.001%的台盼蓝溶液中浸泡后冻干，即得染色后的致密层胶原膜，用于区分疏松层胶原膜；

（4）在交联的致密层胶原膜一侧涂抹1-200 mg/mL纤维蛋白原，在交联的疏松层胶原膜一侧涂抹50-600 IU/mL 凝血酶，利用纤维蛋白原和凝血酶化学反应生成纤维蛋白胶将两片胶原膜粘合成双层胶原膜，10-37℃下风干或冻干，再利用压膜机的物理粘合法将双层胶原膜进一步压平和粘合，即得具有致密-疏松结构的胶原双层膜材料；

（5）将胶原双层膜材料的疏松层或致密层一侧朝上，并在上面均匀滴加生长因子溶液，4-8℃下风干或冷冻干燥，即得负载单一生长因子的胶原双层膜材料；将胶原双层膜材料的疏松层或致密层一侧朝上，在其上面均匀滴加生长因子溶液，干燥后在其另外的一侧滴加相同或不同的生长因子，即得双侧负载生长因子的胶原双层膜材料。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的胶原为Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原或Ⅹ型胶原；所述的胶原为牛腱来源，或是其他种属动物如鼠尾胶原蛋白。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的负载生长因子为碱性成纤维生长因子、骨形态发生蛋白、转化生长因子-β、胰岛素样生长因子、血小板衍生生长因子，以及人工合成的上述这些生长因子的活性肽中的一种或一种以上混合使用，或者包含生长因子的微米、纳米微粒。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤（2）所述的胶原膜交联反应用的是EDC和NHS催化胶原纤维形成酰胺键的化学交联法；或者戊二醛、京尼平化学试剂交联；胶原膜的交联或采用光化学法、真空干热交联物理方法。

10.权利要求1所述的负载定向释放生长因子的胶原基双层膜材料用于病损组织的再生修复。