CN107412783A - 一种包裹有难溶于水药物的蛋白质颗粒的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种包裹有难溶于水药物的蛋白质颗粒的制备方法，包括以下步骤：i)将难溶于水药物与液态增溶剂溶解于难溶于水药物的良溶剂；ii)从步骤i)的产物中去除部分或全部所述难溶于水药物的良溶剂；iii)将步骤ii)的产物与蛋白质混合；iv)将步骤iii)的产物在难溶于水药物的不良溶剂中分散，获得包裹有难溶于水药物的蛋白质颗粒。本发明方法药物载量高、制备简单、适合工业化生产。

Description

一种包裹有难溶于水药物的蛋白质颗粒的制备方法
技术领域
本发明属于制药领域，具体涉及一种包裹有难溶于水药物的蛋白质颗粒的制备方法。
背景技术
药物的纳米递送系统是指利用材料包载药物形成纳米粒子。研究发现药物经纳米递送系统包载可以改变药物在体内的释放、分布和代谢行为，经过表面修饰改造甚至可以实现药物的靶组织及靶细胞的特异性摄取、特异性结合以及蓄积，增加药物的治疗效果，同时减少因全身性用药而带来的毒副作用，提高病人的顺应性。因此，纳米递送载体为药物更好的发挥疗效提供了新的途径。
白蛋白纳米粒是目前最受关注的纳米递送系统之一，由于白蛋白为内源性物质，具有无毒、无免疫源性、生物可降解和生物相容性高的特点，同时，很多药物都能与体内血浆蛋白结合，因此白蛋白为天然的理想药物载体。
目前已有紫杉醇白蛋白纳米粒上市，国内已有进口。该制剂不仅将原制剂的最高耐受量提高近50％，同时避免使用乙醇和Cremophor-EL等增溶剂，极大的提高了患者的顺应性，减小用药时的痛苦。因此，人血白蛋白纳米制剂具有极大的应用前景。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种包裹有难溶于水药物的蛋白质颗粒的制备方法。
本发明第一方面提供一种包裹有难溶于水药物的蛋白质颗粒的制备方法，包括以下步骤：
i)将难溶于水药物与液态增溶剂溶解于难溶于水药物的良溶剂；
ii)从步骤i)的产物中去除部分或全部所述难溶于水药物的良溶剂；
iii)将步骤ii)的产物与蛋白质混合；
iv)将步骤iii)的产物在难溶于水药物的不良溶剂中分散，获得包裹有难溶于水药物的蛋白质颗粒。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，该方法45℃以下的温度进行，优选在40℃以下的温度进行，优选在35℃以下的温度进行，再优选在30℃以下的温度进行。
在一个实施方案中，步骤i)的产物为液体(例如澄明溶液)。
在一个实施方案中，步骤ii)的产物为液体(例如澄明溶液)。
在一个实施方案中，难溶于水药物在步骤ii)的产物中以溶液状态存在。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述液态增溶剂包括：丙醇(例如异丙醇)、液态聚乙二醇(例如聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600或聚乙二醇800中的一种或多种)、吐温(例如吐温20或吐温80)、司盘和甘油中的一种或多种。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述液态增溶剂包括：液态聚乙二醇(例如聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600或聚乙二醇800中的一种或多种)或吐温(例如吐温20或吐温80)。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述难溶于水药物的良溶剂包括乙醇、甲醇、乙醚、二氯甲烷和氯仿中的一种或多种。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述难溶于水药物的良溶剂包括乙醇。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述难溶于水药物的不良溶剂包括水；
优选地，所述难溶于水药物的不良溶剂包括生理可接受的水溶液；
优选地，所述难溶于水药物的不良溶剂包括缓冲溶液；
优选地，所述难溶于水药物的不良溶剂包括盐和/或糖的水溶液。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，步骤ii)包括：采用选自旋转蒸发、加热、抽真空中的一项或多项从步骤i)的产物中去除全部或部分难溶于水药物的良溶剂；
优选地，难溶于水药物的良溶剂在步骤ii)的产物中含量为1wt％以下。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，步骤iii)中，所述蛋白质是粉末状。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述蛋白质为白蛋白；
优选地，所述白蛋白包括选自重组白蛋白、天然白蛋白和修饰白蛋白中的一种或多种。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，步骤iv)包括：采用选自搅拌、剪切、超声、均质、研磨中的一项或多项操作，将步骤iii)的产物在第二溶剂中分散。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，还包括以下步骤：从步骤iv)的产物中去除液态增溶剂；
优选地，采用选自透析、凝胶过滤、微柱洗脱中的一项或多项，从步骤iv)的产物中去除液态增溶剂。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，还包括以下步骤：从步骤iv)的产物中分离白蛋白颗粒；
优选地，采用离心、过滤和干燥(例如冷冻干燥)中的一项或多项，从步骤iv)的产物中分离白蛋白颗粒。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，所述难溶于水药物包括紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、雷帕霉素、多柔比星、伊曲康唑、尼莫地平中的一种或多种。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，其特征在于该蛋白纳米颗粒的平均粒径为100～1000nm，例如200～2000nm，再例如150～250nm。
本发明第二方面提供一种包裹有难溶于水药物的蛋白质颗粒，其由本发明任一项的方法制得。
1g(ml)难溶于水药物能够在少于30ml难溶于水药物的良溶剂中溶解。
1g(ml)难溶于水药物在少于30ml难溶于水药物的不良溶剂中不能完全溶解。
在一个实施方案中，液态增溶剂是指能够增加难溶于水药物的溶解度的液体物质。
在一个实施方案中，液态增溶剂是水溶性的。
在一个实施方案中，难溶于水药物的良溶剂是指能够有效溶解难溶于水药物的溶剂。
在一个实施方案中，难溶于水药物的不良溶剂是指水性介质。
在一个实施方案中，所述难溶于水药物具有羟基、其他活性基团或疏水基团，使白蛋白与药物具有共价或非共价相互作用并附着于药物颗粒表面。
在一个实施方案中，所述白蛋白为人源性白蛋白。
在一个实施方案中，所述白蛋白为经改造或修饰后不会引起机体免疫的其他来源的白蛋白。
在一个实施方案中，难溶于水药物的不良溶剂为有助于提高给药系统机体耐受性、稳定性等的溶液系统。
在一个实施方案中，难溶于水药物的不良溶剂可以包括水、缓冲液、盐溶液、糖溶液以及生理可接受的溶液，
在一个实施方案中，缓冲溶液可以为磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸盐缓冲液等。
在一个实施方案中，盐溶液可以为氯化钠溶液。
在一个实施方案中，糖溶液可以为葡萄糖溶液、乳糖溶液、甘露醇溶液等。
在一个实施方案中，生理上可接受的溶液是指口服、注射、吸入以及外用给药时机体可耐受的溶液。
在一个实施方案中，难溶于水药物的不良溶剂可以包含渗透压调节剂、pH调节剂、冻干保护剂、助悬剂、稳定剂等。
在一个实施方案中，步骤i)、ii)或iii)的产物中不包括难溶于水药物的不良溶剂，例如不包括水。
在一个实施方案中，本发明任一项的方法，包括修饰包裹有难溶于水药物的蛋白质颗粒的步骤。
在一个实施方案中，包裹有难溶于水药物的蛋白质颗粒可以经高分子聚乙二醇(例如聚乙二醇2000或聚乙二醇4000)、靶向修饰高分子聚乙二醇等材料修饰，以获得长循环或者长循环靶向递送功能。
在一个实施方案中，包裹有难溶于水药物的蛋白质颗粒的尺寸为100～1000nm，例如150～250nm，再例如170～210nm，再例如140～160nm，再例如186nm、173nm、192nm、204nm或193nm。
在一个实施方案中，本发明任一项的制备方法是首先将难溶性药物与液态增溶剂在良溶剂(例如乙醇)存在条件下溶解，然后除去良溶剂，形成难溶性药物与液态增溶剂的液态复合物，该复合物中难溶性药物是以溶液状态存在的；然后该液态复合物与蛋白粉末混合后，加入不良溶剂中分散，难溶性药物析出并被蛋白包裹，形成纳米粒。该方法制备过程中可以不使用高温，有利于增加药物的稳定性。
本发明的有益效果
一个或多个实施例具有以下一项或多项有益效果：
i)制备工艺相对简单；
ii)关键工艺易于控制；
iii)无需固化白蛋白即可获得稳定的蛋白质颗粒；
iv)包裹有难溶于水药物的蛋白质颗粒的制备方法的载药量和/或包封率较高；
v)包裹有难溶于水药物的蛋白质颗粒粒径易于控制；
vi)溶解活性物质的方法是将活性物质与增溶剂共溶于有机溶剂中后，再去除有机溶剂，形成活性物质与增溶剂的复合物，该复合物可显著提高活性物质的溶解度，甚至明显优于有机溶剂的增溶效果；
vii)在制备包裹有难溶于水药物的蛋白质颗粒过程中，通过搅拌、剪切、超声、均质、研磨等处理一步获得蛋白颗粒，无需产生水包油或油包水的乳剂，去除有机溶剂简单完全。
viii)制备过程中不会使用高温，有利于增加药物的稳定性。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的限定。在附图中：
图1为PBS稀释50倍后紫杉醇蛋白质颗粒的透射光变化曲线；
图2为PBS稀释50倍后紫杉醇蛋白质颗粒的背散射光变化曲线；
图3为PBS稀释100倍后紫杉醇蛋白质颗粒的透射光变化曲线；
图4为PBS稀释100倍后紫杉醇蛋白质颗粒的背散射光变化曲线；
图5为完全培养基稀释50倍后紫杉醇蛋白质颗粒的透射光变化曲线；
图6为完全培养基稀释50倍后紫杉醇蛋白质颗粒的背散射光变化曲线；
图7为完全培养基稀释100倍后紫杉醇蛋白质颗粒的透射光变化曲线；
图8为完全培养基稀释100倍后紫杉醇蛋白质颗粒的背散射光变化曲线。
具体实施方式
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
以下实施例中使用的仪器如下表所示：
实施例1
称取紫杉醇约50mg，加入PEG600 400μL，加入无水乙醇10mL，超声至澄明(水温30～45℃)，减压旋蒸除去乙醇，形成紫杉醇-聚乙二醇复合物(乙醇残留量为0.5wt％以下)；
称取人血清白蛋白粉末100mg，加至紫杉醇-聚乙二醇复合物中，混匀，得混粉；
将上述混粉到加入2mL pH7.4的PBS溶液中，于超声破碎仪中以45％功率的条件超声200s(超2s，停2s)。
取上述混悬液，置于透析袋中，以pH7.4的PBS为透析液，反复透析，除去PEG600及游离白蛋白。取上述混悬液，3000rpm条件下离心10min，去除未包封的药物沉淀，然后冷冻干燥，获得包裹有紫杉醇的蛋白质颗粒。
实施例2
称取10-羟基喜树碱约100mg，加入PEG400 1mL，加入无水乙醇适量，超声分散，至澄明，减压旋蒸除去乙醇，形成10-羟基喜树碱-聚乙二醇复合物；
称取人血清白蛋白粉末300mg，加至复合物中，混匀，得混粉；
将上述混粉加入到10mL pH5.0的柠檬酸缓冲溶液中，用高压均质机均质过膜，得混悬液。
取上述混悬液，置于透析袋中，反复透析，除去PEG400及游离白蛋白。
取上述混悬液，3000rpm条件下离心10min，去除未包封的药物沉淀，然后冷冻干燥，获得包裹有10-羟基喜树碱的蛋白质颗粒。
实施例3
称取多烯紫杉醇约100mg，加入PEG400 500μL，加入无水甲醇适量，超声分散，至澄明，减压旋蒸除去甲醇，形成多烯紫杉醇-聚乙二醇复合物；
称取人血清白蛋白粉末300mg，加至复合物中，混匀，得混粉；
将上述混粉加入到10mL pH5.0的柠檬酸缓冲溶液中，用高压均质机均质过膜，得混悬液。
取上述混悬液，置于透析袋中，反复透析，除去PEG400及游离白蛋白。取上述混悬液，3000rpm条件下离心10min，去除未包封的药物沉淀，然后冷冻干燥，获得包裹有多烯紫杉醇的蛋白质颗粒。
实施例4
称取雷帕霉素约100mg，加入PEG400 1mL，加入无水乙醇适量，超声分散，至澄明，减压旋蒸除去乙醇，形成雷帕霉素-聚乙二醇复合物；
称取人血清白蛋白粉末300mg，加至复合物中，混匀，得混粉；
将上述混粉加入到10mL pH5.0的柠檬酸缓冲溶液中，用高压均质机均质过膜，得混悬液。取上述混悬液，置于透析袋中，反复透析，除去PEG400及游离白蛋白。
取上述混悬液，3000rpm条件下离心10min，去除未包封的药物沉淀，然后冷冻干燥，获得包裹有雷帕霉素的蛋白质颗粒。
实施例5
称取伊曲康唑约100mg，加入PEG400 1mL，加入无水乙醇适量，超声分散，至澄明，减压旋蒸除去乙醇，形成伊曲康唑-聚乙二醇复合物；
称取人血清白蛋白粉末300mg，加至复合物中，混匀，得混粉；
将上述混粉加入到10mL pH5.0的柠檬酸缓冲溶液中，用高压均质机均质过膜，得混悬液。
取上述混悬液，置于透析袋中，反复透析，除去PEG400及游离白蛋白。取上述混悬液，3000rpm条件下离心10min，去除未包封的药物沉淀，然后冷冻干燥，获得包裹有伊曲康唑的蛋白质颗粒。
实施例6
称取羟基喜树碱约100mg，加入吐温80 1mL，加入无水乙醇适量，超声分散，至澄明，减压旋蒸除去乙醇，形成羟基喜树碱-吐温80复合物；
称取人血清白蛋白粉末300mg，加至复合物中，混匀，得混粉；
将上述混粉加入到10mL pH5.0的柠檬酸缓冲溶液中，用高压均质机均质过膜，得混悬液。
取上述混悬液，置于透析袋中，反复透析，除去吐温80及游离白蛋白。取上述混悬液，3000rpm条件下离心10min，去除未包封的药物沉淀，然后冷冻干燥，获得包裹有羟基喜树碱的蛋白质颗粒。
实施例1～6的制备方法产率接近100％。
分析检测1包封率和载药量的测定
(1)取白蛋白颗粒约10mg，加入乙醇适量，使其完全溶解，然后用流动相定容，HPLC法测定药物浓度，并计算颗粒中的总药物量A。
(2)另取白蛋白颗粒约10mg，加水适量，混匀，3000rpm离心10min。离心后，若有沉淀，收集沉淀，用乙醇适量溶解，流动相定容，HPLC法测定药物浓度，并计算沉淀中的药物量B；
还取离心后的上层悬液，置于16，000rpm超高速条件下离心20min，收集上清液，流动相定容，HPLC法测定上层悬液中的药物浓度，并计算上层悬液中的药物量C。
低速离心后沉淀中的药物以及超高速离心后上清液中的药物即为未包封药物，计算包封率及载药量。
包封率＝(A-B-C)/A×100％
载药量＝EE×W药/(W药+W白蛋白)
其中，EE为包封率，W药为颗粒制备过程中投入的总药物量，W白蛋白为颗粒制备过程中投入的总白蛋白量。
表1白蛋白颗粒中药物的载药量及包封率
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6
包封率(％) 99.2％ 98.6％ 94.5％ 96.8％ 94.4％ 92.3％
载药量(％) 33.1％ 24.6％ 23.6％ 24.2％ 23.6％ 21.4％
分析检测2白蛋白颗粒粒径的测定
取实施例1～6的白蛋白颗粒，加水混悬，置于激光颗粒径测定仪中检测其粒径大小，具体结果如下：
表2白蛋白颗粒的粒径
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6
粒径(nm) 186 173 192 204 193 153
由表2可知，采用实施例1～6的方法可以获得包裹有难溶于水药物的蛋白质纳米颗粒，例如粒径为153nm至粒径为204nm的包裹有难溶于水药物的蛋白质纳米颗粒。
分析检测3紫杉醇白蛋白颗粒的稳定性测定
取实施例1中的紫杉醇白蛋白颗粒，分别用磷酸盐缓冲液(PBS)及含胎牛血清的MEM培养基稀释50倍及100倍，于稳定性仪上测定原液以及各稀释液的稳定性。结果如图1～8。由结果可知，该紫杉醇白蛋白颗粒经不同介质稀释后在37℃条件下透射光和散射光的变化值均不超过3％，说明其稳定性良好。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (11)

1.一种包裹有难溶于水药物的蛋白质颗粒的制备方法，包括以下步骤：
i)将难溶于水药物与液态增溶剂溶解于难溶于水药物的良溶剂；
ii)从步骤i)的产物中去除部分或全部所述难溶于水药物的良溶剂；
iii)将步骤ii)的产物与蛋白质混合；
iv)将步骤iii)的产物在难溶于水药物的不良溶剂中分散，获得包裹有难溶于水药物的蛋白质颗粒。
2.权利要求1的制备方法，所述液态增溶剂包括：丙醇(例如异丙醇)、液态聚乙二醇(例如聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600或聚乙二醇800中的一种或多种)、吐温(例如吐温20或吐温80)、司盘和甘油中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，所述难溶于水药物的良溶剂包括乙醇、甲醇、乙醚、二氯甲烷和氯仿中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，所述难溶于水药物的不良溶剂包括水；
优选地，所述难溶于水药物的不良溶剂包括生理可接受的水溶液；
优选地，所述难溶于水药物的不良溶剂包括缓冲溶液；
优选地，所述难溶于水药物的不良溶剂包括盐和/或糖的水溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，步骤ii)包括：采用选自旋转蒸发、加热、抽真空中的一项或多项从步骤i)的产物中去除全部或部分难溶于水药物的良溶剂。
6.根据权利要求1所述的方法，步骤iii)中，所述蛋白质是粉末状。
7.根据权利要求1所述的方法，所述蛋白质为白蛋白；
优选地，所述白蛋白包括选自重组白蛋白、天然白蛋白和修饰白蛋白中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的方法，步骤iv)包括：采用选自搅拌、剪切、超声、均质、研磨中的一项或多项操作，将步骤iii)的产物在第二溶剂中分散。
9.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：从步骤iv)的产物中去除液态增溶剂；
优选地，采用选自透析、凝胶过滤、微柱洗脱中的一项或多项，从步骤iv)的产物中去除液态增溶剂。
10.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：从步骤iv)的产物中分离白蛋白颗粒；
优选地，采用离心、过滤和干燥(例如冷冻干燥)中的一项或多项，从步骤iv)的产物中分离白蛋白颗粒。
11.根据权利要求1所述的方法，所述难溶于水药物包括紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、雷帕霉素、多柔比星、伊曲康唑、尼莫地平中的一种或多种。
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