CN107407791B - 用于光学仪器的连续异步自动聚焦的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的实施例针对光学仪器内的自动聚焦子系统，其连续监测光学仪器的焦点，并且沿光轴调整在光学仪器内的距离，以便将精确和稳定的光学仪器焦点保持在样本上、之内或附近的特定点或表面处。本发明的某些实施例相对于光学仪器的其他组件和子系统的操作异步地操作，该其他组件和子系统嵌入光学仪器中。在一个实施例中，自动聚焦检测器包括：分束器，其布置成将自动聚焦光束分为多个(n个)下游光束；以及光电检测器布置，用于登记下游光束的每一个的强度。

Description

用于光学仪器的连续异步自动聚焦的系统和方法
技术领域
本发明涉及光学仪器，以及具体来说涉及连续异步地操作光学仪器内的自动聚焦子系统，其在物镜与被成像对象上、之内或附近的点或表面之间沿光轴保持恒定距离。
背景技术
虽然光学显微术和其他基于光学器件的方法用于人类活动的许多领域中，但是从科学研究到战争，在几百年内，微处理器、现代计算和分子生物学的出现已引起新光学仪表和光学成像技术的不断加速发展。例如，与现代荧光显微术中结合的计算设施相组合的活细胞内的蛋白质的荧光标记允许活细胞的生物成分的精致细节（fine detail）以比光学显微术的所谓“衍射极限”明显要低的分辨率来成像。
许多新光学仪器、光学仪器的应用和光学成像技术取决于具有浅景深的高功率光学系统在延长时间周期内和/或在在与z光轴正交的x-y平面内的被成像对象的扫描期间的精确聚焦。示例包含通过在较长时间周期内对生物样本中的弱发射荧光团进行成像来实现低于衍射极限的分辨率的各种光学显微术技术以及用于通过在保持恒定z位置的同时相对于显微镜的光路在x-y平面中平移样本来扫描活细胞和其他生物样本以对这些样本内的平面进行成像的光学显微术技术。光学仪器的焦点可能因例如热和机电不稳定性而随时间改变，以及甚至极精确机电显微镜载物台在相对于成像光学器件的距离中可能波动，因为在时间周期内当扫描样本的同时或者当从样本收集数据的同时在x-y平面中平移载物台。精确光学仪表的设计人员、制造商和用户继续寻求随时间并且当高精确光学仪器的各种子组件(包含机电载物台)正操作的同时稳定高精确光学仪器的焦点的系统和方法。
发明内容
本发明的实施例针对光学仪器内的自动聚焦子系统，其连续监测光学仪器的焦点，并且沿光轴调整在光学仪器内的距离，以便将精确且稳定的光学仪器焦点保持在样本上、之内或附近的特定点或表面处。本发明的某些实施例相对于光学仪器的其他组件和子系统的操作异步地操作，该其他组件和子系统嵌入在光学仪器中。
附图说明
图1A-C图示荧光显微镜中的光路。
图2A-B示出在图2A的情况下随时间或者在图2B的情况下在样本的x和/或y平移期间样本内的z位置或物镜的焦点相对于光轴的位置的不合需要变化。
图3图示显微镜的传统自动聚焦子系统。
图4和图5提供图示传统自动聚焦模块的操作的控制流程图。
图6提供图示本发明的某些实施例的一个方面的控制流程图。
图7A-C图示与以上参照图1A-C和图3所讨论的荧光显微镜的机电载物台无关的z轴扫描。
图8图示小孔径（aperture）焦点检测器的操作原理。
图9A-B图示按照本发明的自动聚焦模块的实施例。
图10图示自动聚焦模块的另一个实施例。
图11A和B图示自动聚焦模块的又一个实施例。
图12图示表示本发明的一个实施例的自动聚焦模块，其结合在也表示本发明的一个实施例的荧光显微镜的光路内。
图13A和B图示自动聚焦模块的又一个实施例。
图14图示自动聚焦模块的另一个实施例。
图15图示自动聚焦模块的另一个实施例。
具体实施方式
图1A-C图示荧光显微镜内的光路。光路以及包含光路的荧光显微镜用作描述本发明的一个实施例的上下文。但是，又如以下所述，本发明的方法和系统在许多情况中可通过调整本发明的实施例的各种参数和配置以供在特定应用中使用来结合在各种各样的不同类型的光学仪器内。
荧光显微镜的光路包括：激发光源102，通常是可见光或UV光激光器；多向色（polychroic）反射镜104，其将激发光106反射到一个或多个物镜108(其将激发光聚焦到搁置于盖片112(其位于具有激发光所经过的孔径116的机械载物台平台114上)的远侧（farside）的样本内的点110上)中。激发光刺激来自样本内的荧光团的荧光发射。通常具有比激发光的波长要长的波长、来自荧光团的发射光经过一个或多个物镜108并且经过多向色反射镜104回传到一个或多个镜筒透镜118，其将由荧光团所发射的光聚焦到光电检测器120，常常是电荷耦合装置(“CCD”)检测器。由光电检测器所测量的空间强度由计算子系统以电子方式来处理，以生成被成像对象的图像，其存储在电子存储器和大容量存储装置中，并且被渲染以供电子显示装置上的显示。
多向色反射镜104反射较短波长的光(包含激发光)，并且还可反射很长波长的光(例如红外光)，但是对包含由荧光标记样本内的荧光团所发射的光的波长的波长范围之内的可见光是透明的。类似地，激发光106的初始通路上的二向色反射镜122对较短波长激发光是透明的，但是反射较长波长的红外光，如以下更详细讨论的。机电载物台(其包括载物台平台114、载物台驱动组件124以及x 126、y 128和z 130平移机构)用来在x、y和z方向上相对于物镜和仪器光路来移动样本。注意的是，光轴或z轴与图1A中从样本点110经过物镜、多向色反射镜和镜筒透镜垂直延伸到检测器120上的对应图像点132的光程是平行的。
在图1B中，激活了x平移机构126，以便将载物台平台114向右移动小距离+Δx140，这导致在x方向上的样本内的焦点的相等幅值但是相反偏移-Δx 142。换言之，前一焦点110和新焦点144在载物台平台在x方向上平移距离+Δx之后分隔幅值
Figure DEST_PATH_IMAGE002
142的距离。图1C按照与图1B类似的方式示出z平移设备130的激活以将机械载物台114在z轴或光轴方向上移动小距离-Δz 146，从而导致样本内的焦点平移相等幅值148但是相反方向的距离+Δz。在本论述中，假定图1A所示的检测器120与镜筒透镜118之间的距离至少在从样本的图像获取期间的时间周期内是固定的，因此固定物镜的焦点。
在许多荧光显微术应用(包含活细胞成像)中，高分辨率图像的获取取决于在足以从弱发射荧光团来收集足够信息以用于重构样本内的荧光标注的图像的时间周期内在相对于物镜的固定位置中对特定样本进行成像。在其他应用中，通过当在z轴或光轴方向上保持物镜与样本之间的恒定焦点或恒定距离的同时相对于物镜在x-y平面中移动机电载物台来扫描样本。在两种情况中，物镜与样本内的点或表面之间的距离在某个时间周期内和/或在在x和y方向上平移机械载物台的同时需要保持在精确固定值。
图2A-B示出在图2A的情况下随时间或者在图2B的情况下在样本的x和/或y平移期间样本内的z位置或物镜的焦点相对于光轴的位置的不合需要变化。在两个图中，物镜与样本之间的预期距离通过虚线202和204所示。物镜与样本之间的实际距离在两个图中均示为实曲线206和208。尽管尽力保持物镜与样本内的点或表面之间的固定距离，但是在z轴或光轴方向上的物镜与样本之间的实际距离随时间并且在x和/或y平移期间改变。这些变化具有许多不同原因。显微镜环境中的热不稳定性能够导致例如在具有z轴分量的方向上的光学仪器的膨胀或收缩。光学仪器常常由温度控制室来包围，但是光学仪器的组件可生成和耗散热，包含光源、马达和其他这类组件，其无法被直接补偿。空气压力和其他环境参数的波动还可导致物镜与样本之间的距离的变化。当机电载物台的x-y平面与光轴甚至略微非正交地定向时，在通过x-y平面中的平移进行扫描期间，样本还在z方向上相对于物镜移动。
图3图示显微镜的传统自动聚焦子系统。开发了自动聚焦子系统，以便随时间并且当在x-y平面中移动样本的同时稳定样本内的相对于光轴的焦点位置。图3使用与图1A-C所使用的相同说明惯例。图3所示的自动聚焦子系统使用与激发光源102不同的自动聚焦光源302。在许多系统中，自动聚焦光源发射红外光304，其一部分由分束器308向下反射306到二向色反射镜122，其在图3中的水平方向106上沿与通过由激发源102所发射的光所采取的光路相同的光路反射红外光，从其由多向色反射镜104将红外光反射经过物镜108而到样本110。红外光在盖片310的远侧与样本介质之间的界面处散射，以及后向散射红外光的一部分经过物镜108和光路元件104、122、和308返回。后向散射红外光的一部分经过分束器308传递到自动聚焦模块320。另外，自动聚焦光源302和自动聚焦检测器模块320的位置能够以等效结果绕分束器308反转，以及照明源和自动聚焦光源的相对位置在各种备选配置中可连同其他光路组件的特性中的变化一起改变。应当注意，词语“盖片”意图包含常常用于显微术中的传统盖片以及大量不同类型的样本室和样本保持装置的任何的表面。相对于样本具有固定位置的各种界面的任何能够用作后向散射自动聚焦光的源，以便检测和校正相对于一个或多个物镜的样本平面的z位置位错。
自动聚焦模块320周期地控制载物台驱动124，以便沿光轴在z轴位置范围322之内平移载物台，并且记录每个z轴位置处的光的强度，从而至少在概念上生成强度与z位置标图324。对应于物镜的焦点与盖片的远侧的重合的z范围内的z位置通过强度曲线的峰328下面的z位置326来指示，因为后向散射光的最高强度在盖片的远侧与物镜的焦点重合时发生。存在各种不同类型的自动聚焦模块，其执行周期z轴扫描，以便确定盖片和样本介质的界面与光学仪器的焦点重合的载物台平台的当前z轴位置。自动聚焦模块则能够将机电载物台驱动到相对于焦点的所确定的z轴位置的预期z轴位置，以便将焦点重新定位在样本内的预期z轴位置处。
图4和图5提供图示传统自动聚焦模块的操作的控制流程图。图4提供传统自动聚焦操作的高级控制流程图。自动聚焦操作是包括步骤402和404的连续循环。在步骤402中，自动聚焦操作等待直到下一个自动聚焦事件发生，例如自动聚焦定时器的到期或者来自光学仪器操作员(其调取下一个自动聚焦操作)的人工输入。然后在步骤404中，调用例程“自动聚焦”以在z位置范围内执行扫描(如以上参照图3所讨论)，以便确定物镜的焦点与盖片和样本介质的远界面重合的当前z位置。虽然自动聚焦操作在图4中示为连续循环，但是应当注意，通过对例程“自动聚焦”的调用所表示的实际自动聚焦操作以离散时间间隔发生，并且自动聚焦操作是分裂的，通常中断涉及机电载物台的成像和平移的其他操作。
图5提供在图4的步骤404中所调用的例程“自动聚焦”的控制流程图。在步骤502-505的for循环中，自动聚焦模块控制载物台驱动，以扫描经过z位置的范围。对于该范围之内的每个z位置，自动聚焦模块在步骤503中将机械载物台驱动到z位置，并且在步骤504中测量后向散射自动聚焦光的强度。一旦在步骤502-505的for循环中对z位置范围之内的每个位置测量后向散射自动聚焦光强度，例程“自动聚焦”就在步骤506中计算与后向散射光的最大强度对应的z位置，以及然后在步骤508中，将机械载物台驱动到相对于在步骤506中所计算的z位置所计算的z位置。例如，可预期焦点保持在样本内的10微米的恒定z位置处，以及因此自动聚焦在步骤508中计算等于10微米加上光学仪器聚焦在盖片的远侧上的当前z位置的z位置，并且将机电载物台驱动到那个位置。
例如以上参照图3-5所讨论的传统或常规自动聚焦子系统与许多问题和缺陷关联。一个显著问题在于，如上所述的自动聚焦子系统的操作中断由光学仪器正执行的任何其他操作。例如，当光学仪器在固定z位置处进行样本的x-y平面扫描时，每个自动聚焦操作中断该扫描，以便监测扫描期间的z位置的稳定性。用于自动聚焦的z轴扫描可对获取图像所需的时间增加大量时间。与传统自动聚焦子系统关联的第二缺陷在于，由于自动聚焦操作以离散时间间隔执行，所以仪器的z轴位置可在自动聚焦间隔之间漂移。减小自动聚焦操作之间的间隔以便使z轴漂移为最小导致数据收集时间的进一步增加。与自动聚焦操作关联的又一个问题在于，由于自动聚焦操作本身通过将机电载物台移动经过z位置范围来随时间而执行，仪器和环境不稳定性可在自动聚焦操作期间发生变化，从而显著降低能够确定仪器焦点位置并且校正z轴漂移的精度。
本发明的实施例针对连续操作的快速自动聚焦模块，其相对于其他光学仪器组件和子系统的操作(包含机电载物台的平移和图像获取操作)异步地操作。在US8362409、US8558154和US8759732中提出这类异步自动聚焦系统的一些实施例的原理，通过引用将其结合到本文中。图6提供图示按照所述公开的异步自动聚焦系统的原理的控制流程图。连续异步自动聚焦操作通过步骤602-604的连续运行循环来表示。在步骤602中，在一个实施例中，通过计算来自这个界面的后向散射光产生最高强度的z轴位置来连续监测盖片与样本介质之间的界面的z轴位置。当界面相对于物镜的z轴位置发生变化时，或者当相对于物镜的另一个z轴位置发生变化时，机电载物台在步骤604中穿过（drive through）小校正距离Δz，以保持物镜与样本内的特定点或表面之间的恒定距离。因为自动聚焦模块连续操作而没有中断光学仪器的其他组件的操作，所以数据收集时间不受影响，并且光学仪器的焦点能够与通过传统自动聚焦模块相比随时间以更大精度并且更稳定来保持。因为自动聚焦模块连续地并且快速地重新计算盖片与样本介质的远界面的z轴位置，所以物镜相对于盖片的界面的z轴位置能够以比通过传统自动聚焦模块更大的精度连续确定，因为每个自动聚焦操作所需的时间量比在传统自动聚焦模块中要小许多，并且因此在本发明的所述实施例中，在自动聚焦操作期间能够发生的最大漂移量比在传统自动聚焦模块中要小。
图7A-C图示与以上参照图1A-C和图3所讨论的荧光显微镜的机电载物台无关的z轴扫描。图7A-C图示与图1A-C和图3中所示的那个系统类似的假设系统，其中能够在在z方向上相对于物镜来移动样本的同时相对于镜筒透镜来移动自动聚焦模块内的检测器。图7A中，盖片的内界面上的点保持在离一个或多个物镜706的特定z轴位置z0 704处。来自盖片的内表面的后向散射光聚焦到相对于聚焦透镜714保持在固定z轴位置zd 712处的检测器710上。图7B中，将机械载物台移动到更靠近物镜，以及盖片702的内界面到物镜706之间的距离这时为z0' 720，而不是图7A所示的初始距离z0 704。自动聚焦模块中的检测器710远离聚焦透镜714移动对应距离，使得来自内盖片界面702的后向散射光在检测器706上保持被聚焦。类似地，如图7C所示，当比图7A中更远离物镜（objective）移动载物台(其中内盖片界面与物镜之间的距离为z0'' 724)时，检测器710需要移动到更靠近聚焦透镜714，结果是检测器和聚焦透镜分隔较短距离zd'' 726，以便使来自内盖片界面的后向散射光在检测器706上保持被聚焦。
z轴扫描不仅能够通过相对于物镜在z方向上移动载物台平台来执行，而且还能够通过沿自动聚焦子系统的光轴相对于自动聚焦模块聚焦透镜移动自动聚焦模块检测器来执行。当检测器相对于自动聚焦模块内的聚焦透镜移动经过z位置范围时，该范围之内的一个z位置将对应于聚焦模块内的聚焦透镜的焦点，其又对应于在光学仪器的光轴中的盖片的界面与物镜之间在z方向上的当前距离。自动聚焦模块设法检测和校正的物镜与盖片界面之间的距离中的变化在来自盖片界面的后向散射光聚焦到自动聚焦模块检测器上的聚焦透镜的焦距中的变化中反映。因此，能够在自动聚焦模块内相对于聚焦透镜在z方向上物理地和逻辑地移动并且能够确定来自盖片界面的后向散射光在检测器上聚焦的时间的检测器能够用来确定在自动聚焦模块内的检测器相对于聚焦透镜的位置zd(其对应于物镜与盖片的界面之间的当前距离zo)。这允许物镜与盖片界面zo之间的距离的绝对值通过下列关系来确定：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
比例常数α能够从由自动聚焦模块和光学仪器所共享的光路的几何结构以及光学仪器的自动聚焦模块聚焦透镜和一个或多个物镜的特性来确定。
图8图示小孔径焦点检测器的操作原理。在图8中，不透明材料内的小圆孔径相对于三个不同聚焦光束示为802、804和806。第一光束聚焦在圆孔径812下面的点810处，因此光束的一部分落在不透明材料的背面上，以及只有具有圆截面814的光束的中心锥部分经过圆孔径。如果光束没有被不透明材料部分阻挡，则在离焦点与圆截面814相同的距离的光束的圆截面816将具有更大直径和面积。因此，光在经过孔径之后的强度中的降低与圆截面814的面积对圆截面816的面积的比率成比例。当光束聚焦在与孔径重合的点(如同图8的示例804中一样)时，入射光的全部经过孔径，以及经过孔径的光的强度等于经过孔径之前的光束的强度。当输入光的焦点落在孔径之外(如图8的第三示例806所示)时，焦点之前的输入光的一部分落到不透明材料的背面上；因此，如同情况802中一样，只有聚焦光束的一部分820经过孔径。因此，放置于小圆孔径后面的光电检测器(其测量经过小圆孔径的光束的强度)能够用来指示输入聚焦光束的焦点落入孔径内的时间。例如，由光电检测器所检测的强度与聚焦透镜相对于圆孔径的z位置的标图展示作为与所测量的强度828的峰对应的标图824的水平轴上的点的光由聚焦透镜来聚焦在孔径内的针孔孔径相对于聚焦透镜的z =0 826 z轴位置。
如参照图7A-C所讨论的用于相对于聚焦透镜来移动检测器的机械驱动(其中检测器包括放置在针孔孔径后面的适当距离的光电检测器，如图8所示)能够用于确定与从盖片界面后向散射的光的焦点对应的聚焦透镜与针孔孔径之间的距离zd。但是，机械活动检测器将是昂贵的，并且遭受与由光学仪器在z方向上进行扫描关联的相同时间延迟。不是使用能够在z方向上来扫描的焦点检测器(如同图7A-C中一样)，US8362409、US8558154和US8759732公开固定的光电检测器和具有针孔或者递增地延伸聚焦束以执行重复z轴扫描的备选光学元件的转子的使用。但是，本文所公开的实施例涉及可对磨损是敏感的并且可要求维护等的机械布置。
按照本发明的实施例，提供一种没有移动件的焦点检测器，并且其因而在设计上更为简单并且对磨损不太敏感等。另外在所公开实施例中，检测按照并行模式执行，由此载物台的z位置的确定和自动聚焦校正可以是明显更快的。
按照图9a中示意公开的一个实施例，提供一种焦点检测器900、备选地称作自动聚焦检测器，其包括：分束器902，布置成将自动聚焦光束904分为多个(n个)下游光束906；以及光电检测器布置908，用于登记（registering）下游光束的每一个的强度，并且其中下游光束具有从聚焦透镜到光电检测器布置所测量的不同光路长度。以这种方式，自动聚焦检测器能够在多个不同焦距同时监测自动聚焦光束的强度，以便立即检测焦点位置中的偏差和波动。为了提供适当检测范围和分辨率，下游光束的不同光路长度被选择，使得它们跨越（span over）自动聚焦检测范围，并且下游光束的数量是适当大的。自动聚焦检测范围能够根据系统配置而改变，但是通常可覆盖样本的整个厚度加上附加缓冲厚度，以在装载新样本时计及初始设置。在一个实施例中，下游光束的数量为4或以上，例如10、15、20或更多。在具有宽自动聚焦检测范围的实施例中，下游光束的数量优选地是大的，以及取决于应用，它可以是40、60、100或更多。如下面将更详细讨论，另外有可能通过对由下游光束所表示的固定距离之间的值进行内插来增加检测的分辨率。
为了说明的目的，图9a中的分束器902示意地公开为功能单元，其能够将自动聚焦光束904分为n个下游光束906，其中内部光路长度对每个下游光束906是相等的。虽然有可能设计这种类型的分束器，但是设想其设计将要是复杂的，并且如下面将公开，通过设计分束器以提供不同通路长度的下游光束906，可存在有益效果。在图9中，下游光束906的不同通路长度通过光电检测器布置908中的相应光电检测器910的相对位移∆z来实现。在图9a中，光电检测器布置908图示为由n个个别光电检测器910来组成，其中每个检测器与相应下游光束906关联，并且其中每个检测器相对于下游光束906的方向位移距离∆z，以便提供
Figure DEST_PATH_IMAGE006
的检测范围。在具有专用光电检测器910的实施例中，每个检测器可以是如上所述的小孔径焦点类型检测器。但是，如下面将更详细讨论的，在其他实施例中，光电检测器布置908可以是任何适当类型的集成检测器阵列，例如CCD或CMOS图像检测器等。
在图9a中，自动聚焦光束904示意公开为会聚束，其例如由图7的镜筒透镜714来聚焦在如先前所定义的焦平面Zd处，以及分束器902布置成保存对下游光束906的共焦性（confocality）。焦平面Zd通过图9a中的虚线所示。
在图9B提供的标图(其中由
Figure DEST_PATH_IMAGE008
所表示的不同束通路长度在相对于水平轴960的检测器指数（index）i=1至n的范围内来标绘)中，填充（filled-in）圆、例如填充圆962表示相对于左边垂直z位置轴964所标绘的每个束通路长度的z位置，以及开圆、例如开圆966表示相对于右边垂直强度轴968所标绘、由对应光电传感器所检测的强度。如由图9B中的填充圆962所图示的，z距离通过增加检测器指数I来增加，而通过开圆966所示的、由对应光电检测器所检测的强度在与检测器指数i＝6对应的974处达到顶点，并且因此对应距离zd在z轴上被指示。如先前所述，在本发明中，US8362409、US8558154和US8759732的z轴位置的扫描通过各表示不同z轴位置的n个下游束的固定布置来取代。因此，本发明提供通过在自动聚焦模块(其表示本发明的一个实施例)内确定对应z轴位置以确定测量强度为最大的聚焦透镜与针孔孔径之间的距离zd来对离焦状态的基本上立即检测。如上讨论，那个距离与光学仪器中的盖片的界面和物镜之间的距离相关。
按照一个实施例，光电检测器布置是布置在预定义光电检测器平面的光电检测器阵列，以及分束器由一个或多个光学元件(其布置成生成在相对于预定义光电检测器平面的不同通路长度的多个下游光束)来组成。分束器的光学元件和检测器布置可通过到基本结构等的附连而相对于彼此布置在固定位置处，或者它们可结合到整体结构，其中一些或全部组件彼此附连。分束器可布置成提供部分或基本上完全在自由空间(例如空气)中实现的束通路，或者它可被布置，使得束通路部分或基本上完全包含在光学透明材料(例如玻璃、石英等)中。光学元件可通过任何常规制造过程(例如机器加工、模塑或材料沉积等)来制造。
按照一些实施例，光电检测器布置是光电检测器阵列，其中光电检测器阵列是具有多于2n个光电检测器的线性(一维)或二维阵列。通过与下游束通路的数量(n)相比而为光电检测器阵列提供大量光电检测器，例如通过将作为阵列中的一个或多个最适当光电检测器的一个或多个光电检测器选择为对应于相应下游光束或者通过装箱（bin）来自两个或更多光电检测器的登记的强度可促进或完全省略光电检测器与相应束通路的对齐的通常困难的步骤。又备选地，在光电检测器的数量明显大于下游光束的数量、例如光电检测器阵列是图像传感器、例如CCD或CMOS检测器单元的情况下，相应下游光束的强度可使用所检测图像的图像分析来确定。在这种状况中，相应下游光束的所得到的图像可彼此重叠，并且图像分析例如可涉及峰拟合规程等。
按照一些实施例，分束器的光学元件的一个或多个包括一个或多个部分反射界面。包括部分反射界面的分束器在光学器件领域中广泛用来分离或组合光束。可用来提供按照本发明的分束器的部分反射界面的示例包含但不限于例如金属等的薄反射涂层、提供在预定义厚度并且具有适当折射率的材料，使得在界面等处实现受抑全内反射。通过调整特定材料性质，厚度、光束的那个入射角、被反射和透射的光量可控制到预期水平。
图10公开自动聚焦检测器1000的一个实施例，其中分束器1002是由预定义厚度的光学透明材料所制成的、具有第一面1006和第二相反面1008的平坦窗口1004，并且其中第一面1006提供有部分反射界面1010，并且第二面1008提供有全反射1012、例如反射镜涂层。为了引起多个内反射，窗口1004相对于自动聚焦光束1014以角度α来布置。由于在第一面1006的部分反射界面以及第二面1008的全反射1012界面，在窗口1004中生成多个部分内反射，以及由于第一面1006的部分反射界面1010，生成多个下游光束1016。下游光束1016由预定义光电检测器平面1020处的光电检测器布置1018(其在图10中示意公开为个别光电检测器元件1022)来检测，但是如下面所讨论的，光电检测器布置1018可以是任何适当检测器布置(例如CCD或CMOS检测器等)。在图10中，仅示出光束的中心通路，以及如图示，每个后续下游光束具有通过所执行的内反射所实现的附加光路长度。由分束器1002所生成的下游光束1016的数量以及对应位移∆z可通过选择部分反射界面1012的相关性质、窗口1004的光学材料性质和角度α来确定。通过进行适当选择，输出到相应下游光束的光束强度的部分可控制为基本上相等，或者另外校准因数可用来补偿输出比率中的任何差。
图11a示意示出与图10的实施例类似的自动聚焦检测器1000的实施例，其中全反射界面1012采用部分反射界面1012a来取代，由此自动聚焦光束1014可经过窗口1004的第二面1008进入。图11b示出图11a的自动聚焦检测器1000的示意射线追踪模型。
图12图示表示本发明的一个实施例的自动聚焦模块，其结合在也表示本发明的一个实施例的荧光显微镜的光路内。图12使用与图1A-C、图3和图9A-11所使用的相同说明惯例。自动聚焦模块包含聚焦透镜1202、图10所公开实施例的自动聚焦检测器1000以及自动聚焦处理组件1210。自动聚焦处理组件1210连续计算Δz校正，并且向载物台驱动124发出Δz平移指示，以便连续重新定位机械载物台，使得物镜108与盖片界面310之间的距离保持为恒定。如上所讨论的，虽然表示本发明的一个实施例的自动聚焦模块采用从盖片界面后向散射的光或者从相对于样本具有固定位置的另一个界面后向散射的光来计算物镜与盖片界面之间在z方向上的距离，但是表示本发明的一个实施例的自动聚焦模块能够用来将相对于光学仪器的镜筒透镜和检测器的物镜的焦点稳定保持在样本内的任意所选位置处。词语“盖片界面”和“盖片”再次意图广义地涵盖能够用作由自动聚焦系统的后向散射自动聚焦光的源的各种类型的界面的任何。应当注意，表示本发明的实施例的自动聚焦模块可按照各种方式结合到光学仪器中。在许多情况下，自动聚焦模块可手动或自动激活，以在所指定或计算时间周期内执行自动聚焦。在其他情况下，自动聚焦子系统可在某些类型的图像获取模式期间以编程方式来激活。在所有情况下，自动聚焦子系统可在光学仪器的正常z平移期间并且在其他时间手动或自动分离。
图13A和图13B示意公开自动聚焦检测器1300，其布置成提供下游光束的二维模式。二维模式通过具有与图11a和图11b的分束器1002相同的类型的第一分束器1304(其布置成将自动聚焦束1306分为三个主下游束Z1至Z3)和相同类型但具有更大宽度并且相对于第一分束器1304以横向角度来布置的第二分束器1308的二步（two-step）分束器布置来提供。三个主下游束Z1至Z3传递给第二分束器1308，其中主下游束Z1至Z3的每个分为六个辅助下游束z1至z6，从而给出总共18个下游束，其投射到二维光电检测器布置1310(例如光电二极管阵列、CMOS照相装置、CCD检测器等)上。在所公开实施例中，下游束的数量为了说明的目的而限制到18，但是它可明显更大，特别是在具有高分辨率的光电检测器布置1310的实施例中。如同以上与相关实施例联合所提及的，本实施例示意公开为单独光学元件，但是它可按照任何适当方式、例如通过将若干光学透明元件接合在一起来设计，并且其中反射或者半反射层等可提供在相关界面处。
图14示意示出与图11a的实施例类似的自动聚焦检测器1000的实施例，其中部分反射界面1012a布置成允许充分光的透射以便由第二光电检测器布置1018b来检测，由此下游光束1016的数量基本上加倍，并且分辨率得到改进。如所公开，第二光电检测器布置1018b相对于分束器1002作为第一光电检测器布置1018a但是处于其相反侧上而布置在对应的位置中。
图15示意示出具有分束器1402的自动聚焦检测器1400的实施例，分束器1402包括多个部分反射界面1406，其相对于自动聚焦光束1414a或1414b以某个角度并且串行地布置，每个部分反射界面1406提供下游光束1416，其定向到光电检测器布置1408。在所公开实施例中，多个部分反射界面1406示意公开为与光学透明材料的分束器主体1404构成整体，由此形成整体光学元件1404，并且其中分束器1402附连到检测器布置1408。在备选实施例中，部分反射界面1406可作为个别部分反射镜元件(未示出)来提供。在所公开实施例中，分束器1402和光电检测器布置1408公开为集成单元，其使自动聚焦检测器1400极为简单和可靠。光电检测器布置1408可具有如上所讨论的任何适当类型。此外，将有可能的是，通过将初始部分反射界面1406的一些布置成反射与光电检测器布置1408的表面平行的光束的一部分(此后将它作为输入光束提供给后续多个部分反射界面1406，以便将自动聚焦光束1414分为预期多个下游光束1416，其碰撞于光电检测器布置1408上)，基于这个概念来制作集成三维分束器。
按照一个实施例，自动聚焦处理组件布置成从每个下游光束的所记录的强度来计算与最大强度对应的Zd位置。更详细来说，自动聚焦处理组件根据沿光学仪器的光轴的从光学仪器的物镜到后向反射自动聚焦光的光路上的点的所计算的对应距离以及沿光学仪器的光轴从光学仪器的物镜到后向反射自动聚焦光的光路上的点的预期距离来计算光轴校正Δz，并且将光轴校正Δz传送给光学仪器的机电组件，以保持沿光学仪器的光轴从光学仪器的物镜到在预期距离后向反射自动聚焦光的光路上的点的距离。
US8362409、US8558154和US8759732公开如何由表示本发明的一个实施例的自动聚焦模块的自动聚焦处理子组件有效地计算显微镜的物镜与盖片界面之间的当前距离的实施例。这种方式可易于通过将检测器指数而不是转子指数用来确定载物台的当前z位置来应用于本发明的实施例，而无需在本文中更详细公开。
虽然如以上参照图3的图表324所讨论的通过分析后向反射自动聚焦光的强度来确定从物镜到盖片界面的距离提供用于通过自动聚焦处理组件(图12的1212)分析由自动聚焦光电检测器所收集的数据的基础，但是其他方式是可能的。在表示本发明的备用实施例的一个备选方式中，不是确定后向散射光的强度为最高的z位置，自动聚焦系统在由光学系统的用户或者由光学系统的自动化程序控制所选的z位置处进行校准操作，其中z位置扫描略高于和略低于所选z位置地执行。扫描的目的是在来自盖片界面的后向散射光的类高斯强度曲线中识别那些z位置以及与类高斯曲线的陡沿对应的对应自动聚焦束位置。正是在高斯曲线的这个位置中，后向散射自动聚焦光强度的所测量的变化最敏感的取决于相对于盖片界面的物镜的z位置的变化。然后，在校准之后的数据收集阶段期间，连续监测从所识别的自动聚焦束位置所测量的强度的变化，以及z位置控制成将校准步（calibration-step）强度保持在那些所识别的自动聚焦转子位置处。因此，在分析自动聚焦光电检测器获取数据的这种备选方式中，光学仪器的z位置不是作为对后向散射自动聚焦光为最密集的z位置的相对偏移来控制，而是控制成保持在那些自动聚焦束位置(其对z位置变化最为敏感)处所测量的后向散射光的校准步确定的强度。在本发明的另外附加的实施例中，更复杂曲线拟合算法可用来将所测量的后向散射自动聚焦光强度准确拟合到经验确定或理论后向散射自动聚焦光与z位置曲线，以便将光学仪器z位置保持在预期值。
在本发明的另一个实施例中，将附加光学组件引入到红外自动聚焦源302与分束器308之间的自动聚焦系统中，或者调谐或修改已经在光路内的光学组件，以便产生略微会聚或略微发散的自动聚焦光束而不是平行光射线。通过将略微会聚或发散束输入光学系统中，自动聚焦光没有结束聚焦到样本内的点。当自动聚焦光准确聚焦在样本内时，自动聚焦光的高强度可有害地影响样本和光学数据收集。例如，当使用红外自动聚焦光时，高聚焦自动聚焦光可引起样本内的高温以及对活细胞的损坏或者样本的化学组成的温度引起变化。
在本发明的另一个实施例中，环形孔径放置在红外自动聚焦源302与分束器308之间，以便经过环形孔径仅传送将由物镜以陡角聚焦到盖片界面的那些射线。后向反射光的百分比对这类陡峭成角的射线为最大，并且因而有可能减少样本上的总入射光量，同时通过将环形孔径用来滤出不太陡峭成角的射线(其不太有助于后向反射的强度)仍然保持所必需的后向反射自动聚焦光强度。
虽然根据具体实施例来描述了本发明，但是并不意图本发明局限于这些实施例。修改对于本领域的技术人员将是显然的。多种不同类型的自动聚焦处理子组件能够从逻辑电路系统或软件控制微处理器来实现，以便通过改变许多设计和实现参数的任何(包含编程语言、模块化组织、控制结构、数据结构和其他参数)根据从自动聚焦系统的光电检测器所收集的强度数据连续计算z位置。
为了说明的目的，以上描述采用具体术语来提供对本发明的透彻理解。但是，为了实施本发明，具体细节不被要求，这对于本领域的技术人员将是显然的。为了说明和描述的目的，提出本发明的具体实施例的以上描述。它们不是意图为详尽色或者将本发明限制于所公开的准确形式。根据上述教导，许多修改及变化是可能的。示出和描述实施例，以便最好地说明本发明的原理及其实际应用，由此使本领域的其他技术人员能够以如适合所考虑的具体使用的各种修改来最好地利用本发明和各个实施例。意图本发明的范围通过以下权利要求书及其等效体来限定。

Claims (20)

1.一种自动聚焦子系统，包括：
自动聚焦光源；
光学组件，其把来自所述自动聚焦光源的光束定向到光学仪器的光路中；
聚焦透镜，其聚焦从所述光学仪器的所述光路返回到所述自动聚焦系统的自动聚焦光束；
自动聚焦检测器，其布置成沿光轴检测所述自动聚焦光束的焦点的位置Zd；以及
自动聚焦处理组件，其布置成响应于Zd而调整所述光学仪器的所述焦点，
其中所述自动聚焦检测器包括：分束器，其布置成将所述自动聚焦光束分为n个下游光束；以及光电检测器布置，用于登记所述下游光束的每一个的强度，并且其中所述下游光束具有从所述聚焦透镜到所述光电检测器布置所测量的不同光路长度。
2.如权利要求1所述的自动聚焦子系统，其中，所述不同光路长度跨越自动聚焦检测范围。
3.如权利要求1所述的自动聚焦子系统，其中，所述光电检测器布置包括多个光电检测器元件，其各布置在相对于所述分束器的不同距离处。
4.如权利要求1所述的自动聚焦子系统，其中，所述光电检测器布置是布置在预定义光电检测器平面处的光电检测器阵列。
5.如权利要求4所述的自动聚焦子系统，其中，所述光电检测器阵列是具有多于2n个光电检测器的线性阵列。
6.如权利要求4所述的自动聚焦子系统，其中，所述光电检测器阵列是具有多于2n个光电检测器的二维阵列。
7.如权利要求4所述的自动聚焦子系统，其中，所述光电检测器阵列是二维图像传感器。
8.如权利要求4所述的自动聚焦子系统，其中，所述分束器由一个或多个光学元件组成，所述一个或多个光学元件布置成生成在相对于所述预定义光电检测器平面的不同通路长度的所述n个下游光束。
9.如权利要求8所述的自动聚焦子系统，其中，所述光学元件的一个或多个包括一个或多个部分反射界面。
10.如权利要求9所述的自动聚焦子系统，其中，所述分束器是由预定义厚度的光学透明材料所制成的、具有第一和第二相反面的平坦窗口，并且其中两个面是部分反射的，所述窗口相对于所述自动聚焦光束以某个角度来布置，以便生成离开所述第一和第二面的多个部分内反射和多个下游光束。
11.如权利要求9所述的自动聚焦子系统，其中，所述分束器是由预定义厚度的光学透明材料所制成的、具有第一和第二相反面的平坦窗口，并且其中所述第一面是部分反射的，而所述第二面是全反射的，所述窗口相对于所述自动聚焦光束以某个角度来布置，布置成生成离开所述第一面、碰撞在所述预定义光电检测器平面上的多个部分内反射和多个下游光束。
12.如权利要求8所述的自动聚焦子系统，其中，所述分束器包括多个部分反射界面，其相对于所述自动聚焦光束以某个角度并且串行布置，各部分反射界面提供下游光束。
13.如权利要求8所述的自动聚焦子系统，其中，所述分束器作为整体光学元件来提供，并且其中所述分束器附连到所述检测器布置。
14.如权利要求1所述的自动聚焦子系统，其中，所述自动聚焦处理组件布置成从各下游光束的所记录的强度来计算与最大强度对应的Zd位置。
15.如权利要求1所述的自动聚焦子系统，其中，所述自动聚焦处理组件从沿所述光学仪器的所述光轴从所述光学仪器的物镜到后向反射自动聚焦光的所述光路上的所述点的所计算的对应距离以及沿所述光学仪器的所述光轴从所述光学仪器的物镜到后向反射自动聚焦光的所述光路上的所述点的预期距离来计算光轴校正Δz，并且将所述光轴校正Δz传送给所述光学仪器的机电组件，以保持沿所述光学仪器的所述光轴从所述光学仪器的物镜到在所述预期距离后向反射自动聚焦光的所述光路上的所述点的所述距离。
16.如权利要求1所述的自动聚焦子系统，其中，所述光源是激光器。
17.如权利要求1所述的自动聚焦子系统，其中，所述自动聚焦系统包含附加聚焦元件，其把来自所述光源的光聚焦成略微会聚自动聚焦束，以防止来自所述光源的光被所述光学仪器的所述光学组件聚焦到样本内的锐点。
18.如权利要求1所述的自动聚焦子系统，其中，所述自动聚焦系统包含附加聚焦元件，其把来自所述光源的光聚焦成略微发散自动聚焦束，以防止来自所述光源的光被所述光学仪器的所述光学组件聚焦到样本内的锐点。
19.如权利要求1所述的自动聚焦子系统，其中，由所述光源所发射的光经过环形孔径。
20.一种包括如权利要求1所述的自动聚焦子系统的显微镜系统。
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