CN107372126A

CN107372126A - 一种诱导桃儿七体细胞胚发生的方法

Info

Publication number: CN107372126A
Application number: CN201710837774.3A
Authority: CN
Inventors: 郭生虎; 李明; 陈虞超; 刘华; 朱永兴; 关雅静; 石磊; 安钰
Original assignee: Institute For Desertification Control Ningxia Academy Of Agriculture And Forestry Sciences; Ningxia Academy Of Agriculture And Forestry Sciences Agricultural Biotechnology Research Center
Current assignee: Institute For Desertification Control Ningxia Academy Of Agriculture And Forestry Sciences; Ningxia Academy Of Agriculture And Forestry Sciences Agricultural Biotechnology Research Center
Priority date: 2017-09-15
Filing date: 2017-09-15
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2037-09-15
Also published as: CN107372126B

Abstract

本发明提供了一种诱导桃儿七体细胞胚发生的方法，涉及组织培养技术领域。包括以下操作步骤：(1)无菌试管苗的诱导；(2)胚性愈伤组织的分化；(3)体细胞胚的诱导；(4)体细胞胚的同步化调控及增殖培养，获得大量桃儿七体细胞胚丛生芽。本发明提供的方法得到的体细胞胚丛生芽诱导率达75％以上，再生种苗存活率达85％以上。本发明提供的方法操作工艺简单，不受时间、季节限制，可以在室内工厂化生产桃儿七体细胞胚再生种苗以供生产栽培需要。

Description

一种诱导桃儿七体细胞胚发生的方法

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种桃儿七体细胞胚发生的方法。

背景技术

桃儿七Sinopodophyllum emodi(Wall.)Ying为小檗科桃儿七属多年生草本植物，主要分布于东喜马拉雅及临近地区，是我国传统名贵濒危中药材之一，主要用于痛疖肿毒、风湿性骨痛、气管炎等症，近年来研究发现其根和根状茎中含有大量的具有抗癌活性的木脂素类化合物，其中鬼臼毒素抗癌活性最高，是合成GP7，VP16和VM-26等抗癌药物的前体化合物，具有非常广阔的应用前景。桃儿七药材目前主要依赖于野生资源，随需求量的日益增加，过度采挖使桃儿七资源日益减少，目前已被列入《中华珍稀濒危植物名录》，是国家三级濒危中药材。

宁夏农林科学院农业生物技术研究中心从2014年开始对桃儿七种苗繁育进行研究，发现桃儿七种子具有一定的休眠和后熟特性，自然条件下种子发芽率不到10％，，种子幼苗的生长对环境要求比较苛刻，无法满足规模化人工栽培的需求。植物体细胞胚胎发生技术是植物无性繁殖的重要途径，通过组织培养，能够提供繁殖数量大、繁殖速度快，后代遗传稳定的体细胞胚，植物体细胞胚具有和种子相同的形态发生潜力，是最有发展前景的无性繁殖方法之一。

桃儿七体细胞胚的发生技术为解决桃儿七种子、种苗匮乏和种质资源保存的问题提供了一个重要的方法和手段。目前，桃儿七组织培养工作已经开展，甘肃农业大学栗孟飞等以桃儿七成熟合子胚直接进行无菌苗繁育，获得了桃儿七无菌苗，但是一个合子胚只能产生一颗苗，诱导率低，桃儿七种子资源匮乏，不能满足桃儿七种苗的规模化生产。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种诱导率高的桃儿七体细胞胚发生的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种诱导桃儿七体细胞胚发生的方法，包括以下步骤：

1)将消毒后的桃儿七种子接种于种子培养基上进行暗培养5～7d，得到种胚，所述种子培养基为MS固体培养基，pH值为5.8；

2)将步骤1)得到的种胚接种于幼苗诱导培养基上进行幼苗诱导培养25～30d，得桃儿七无菌苗，所述幼苗诱导培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括5.0mg/L的GA3、20g/L的蔗糖和4.55g/L的琼脂，所述幼苗诱导培养基的pH值为5.6～5.8；

3)切取步骤2)得到的所述桃儿七无菌苗的下胚轴作为外植体，接入愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织培养，培养20～25d得到愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括1.0mg/L的2,4-D、1.0mg/L的KT、0.1～0.5mg/L的NAA、4.55g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH为5.6～5.8；

4)将步骤3)得到的愈伤组织接种于胚性愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织胚性诱导培养40～50d，得到胚性愈伤组织；所述胚性愈伤组织诱导培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括1.0mg/L的6-BA、1.0mg/L的GA3、0.1mg/L的IAA、300mg/L的水解酪蛋白、4.55g/L的琼脂和40g/L的蔗糖，pH值为5.6～6.2；

5)将步骤4)得到的胚性愈伤组织破碎，接种于体细胞胚诱导培养基上进行体细胞诱导培养29～31d，得到体细胞胚材料；所述体细胞胚诱导培养基以MS液体培养基为基本培养基，包括0.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的GA3、0.1mg/L的IAA、300mg/L的水解酪蛋白和40g/L的蔗糖，pH值为5.8；

6)将步骤5)得到的体细胞胚材料接种于成熟化固体培养基上进行成熟培养12～14d，得到成熟化体细胞胚材料；所述成熟化固体培养基为以MS固体培养基为基本培养基，包括1.0mg/L的ABA、300mg/L的水解酪蛋白、4.55g/L的琼脂和40g/L的蔗糖，pH值为5.8；

7)将步骤6)得到的成熟化体细胞胚材料转入发育培养基上进行发育培养3～5d，得到发育的体细胞胚材料；所述发育培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括20g/L的蔗糖和4.55g/L的琼脂；

8)将步骤7)得到的发育的体细胞胚材料转入萌发培养基上进行萌发培养30d，得到发育状态相对一致的体细胞胚；所述萌发培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括0.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的IAA、300mg/L的水解酪蛋白和40g/L的蔗糖，pH值为5.8。

优选的，步骤1)所述暗培养的培养温度为22±1℃，培养湿度为40％；

优选的，所述步骤2)的幼苗诱导培养的光照强度为2000～3000lx，每天光照10～14h。

优选的，步骤3)所述愈伤组织培养的条件为光照强度为2000～3000lx，相对湿度为50～60％，培养温度为23±1℃，每天光照12h。

优选的，步骤4)所述愈伤组织胚性诱导培养的条件为光照强度2000～3000lx，相对湿度50～60％，温度23±1℃，每天光照12h。

优选的，步骤5)所述体细胞诱导培养的条件为光照强度1200lx，培养温度23±1℃。

优选的，步骤6)所述成熟培养的条件为光照强度2000～3000lx，相对湿度50～60％，温度23±1℃，每天光照时间12h。

优选的，步骤8)所述萌发培养的条件为光照强度2000～3000lx，相对湿度50～60％，温度23±1℃，每天光照14h。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述的方法获得完整植株的方法，包括以下步骤：将所述体细胞胚接种于丛生芽诱导培养基上进行诱导培养4～6周，形成丛生芽并进一步发育形成完整植株；所述丛生芽诱导培养基以1/2MS固体培养基为基本培养基，包括0.5mg/L的6-BA、0.01mg/L的IAA、20g/L的蔗糖和4.6g/L的琼脂。

本发明提供了一种诱导桃儿七体细胞胚发生的方法，以无菌试管苗的子叶和下胚轴为外植体，通过外源激素调控获得桃儿七愈伤组织，避免了内生菌的干扰，愈伤组织胚性化较高，有利于进一步分化培养；在体细胞胚培养阶段采用固液交替法进行体细胞胚的诱导和增殖培养，短期内获得大量生长状态一致的体细胞胚材料，一致性达80％以上，以该体细胞胚材料进行丛生芽诱导，诱导率达75％以上；操作工艺简单，不受时间、季节限制，可在室内工厂生产桃儿七体细胞胚及试管苗，以满足规模化人工栽培的需要，实现濒危中药材桃儿七的种质资源的可持续开发利用及野生种质的有效保护。

附图说明

图1为体视显微镜下桃儿七体细胞胚发育过程，图中所示I为非胚性愈伤组织；II为胚性愈伤组织，III为原胚团；IV为球形胚；V为心型胚；VI为子叶胚；

图2为步骤2获得的桃儿七无菌试管苗；

图3为步骤3获得的愈伤组织示意图；

图4为步骤4获得的胚性愈伤组织示意图；

图5为本发明培养的桃儿七体细胞胚示意图；

图6为本发明培养的桃儿七体细胞胚丛生芽示意图；

图7为本发明获得的桃儿七再生植株示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种桃儿七体细胞胚发生的方法，包括以下步骤：

2)将步骤1)得到的种胚接种于幼苗诱导培养基上进行幼苗诱导培养32～37d，得桃儿七无菌苗，所述幼苗诱导培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括5.0mg/L的GA3、20g/L的蔗糖和4.55g/L的琼脂，所述幼苗诱导培养基的pH值为5.6～5.8；

3)切取步骤2)得到的所述桃儿七无菌苗的下胚轴作为外植体，接入愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织培养，培养19～21d得到愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括1.0mg/L的2,4-D、1.0mg/L的KT、0.1～0.5mg/L的NAA、4.55g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH为5.6～5.8；

5)将步骤4)得到的胚性愈伤组织破碎，接种于体细胞胚诱导培养基上进行体细胞诱导培养29～31d，得到体细胞胚材料；所述体细胞胚诱导培养基以MS液体培养基为基本培养基，包括0.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的GA3、

0.1mg/L的IAA、300mg/L的水解酪蛋白和40g/L的蔗糖，pH值为5.8；

本发明将消毒后的桃儿七种子接种于种子培养基上进行暗培养5～7d，得到种胚，所述种子培养基为MS固体培养基，pH值为5.8。在本发明中，所述种子为当年生成熟饱满的种子。在本发明中，所述消毒优选在超净工作台内进行，包括以下步骤：用质量分数为1％的次氯酸钠水溶液进行表面消毒3～6min，无菌水冲洗3～4次，无菌水冲洗次数优选为4次；用质量分数70％的乙醇消毒30s，用无菌水冲洗3～4次，无菌水冲洗次数优选为4次；用质量分数0.1％的升汞消毒5min，用无菌水冲洗4～5次，无菌水冲洗次数优选为5次。在本发明中，所述暗培养的培养温度为22±1℃，培养湿度为40％。在本发明中，所述种胚的获得方法为：当种子完全吸胀且目测无种子污染时，在超净工作台内，用手术刀片沿种脐线剖开种子，取出完整种胚。

得到种胚后，本发明将上述得到的种胚接种于幼苗诱导培养基上进行幼苗诱导培养32～37d，得桃儿七无菌苗，所述幼苗诱导培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括5.0mg/L的GA3、20g/L的蔗糖和4.55g/L的琼脂，所述幼苗诱导培养基的pH值为5.6～5.8。在本发明中，所述诱导培养包括5～7天的暗培养和25～30天的光照培养；在本发明中，将光照培养箱内的光照时间设置为0h，进入暗培养，所述暗培养的温度优选为为22±1℃、暗培养的环境湿度优选为40％，所述暗培养的时间优选为6d。在所述暗培养的过程中，第2～3d时种胚开始膨大，逐渐形成棒状，第5～7d时，子叶开始伸长，此时转入光暗交替培养。在本发明中，所述光照培养的光照强度为2000～3000lx，光照培养时间优选为28d，每天光照10～14h，光照时间优选为每天12h。在所述光照培养的过程中，子叶长大变绿、下胚轴伸长，长出胚根，获得2～3cm长的桃儿七无菌苗，在本发明中，GA3可打破种子休眠，促进无菌苗的形成，最终种子胚的出苗率达85％以上。在本发明的实施例中，所述诱导培养具体在光照培养箱内进行。

得到桃儿七无菌苗后，本发明切取上述得到的所述桃儿七无菌苗的下胚轴作为外植体，接入愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织培养，培养19～21d得到愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括1.0mg/L的2,4-D、1.0mg/L的KT、0.1～0.5mg/L的NAA、4.55g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH为5.6～5.8。在本发明中，所述切取下胚轴在超净工作台内进行。在本发明中，所述下胚轴优选切成0.5cm长的段。在本发明中，所述愈伤组织培养的条件为光照强度为2000～3000lx，相对湿度为50～60％，培养温度为23±1℃，每天光照12h。在本发明诱导培养5～7d后，下胚轴逐渐膨大发白，切口表面开始愈伤化，继续培养2周后，下胚轴切口处逐渐形成愈伤组织，随着愈伤组织块的不断增殖，愈伤组织表面呈黄绿色颗粒状，表面剔透，中间比较紧实。在本发明中，所述愈伤组织诱导培养基内的2,4-D具有诱导愈伤组织分化，促进形成胚性愈伤组织的作用，，KT是细胞分裂素，促进细胞分裂增殖，与生长素配合使用，可以促进外植体分化，形成愈伤组织。NAA具有促进细胞生长和器官分化的作用。将所述2,4-D、KT和NAA组合后，能够使外植体下胚轴在20～25d形成愈伤组织，生长素2,4-D和NAA的配合使用既提高了愈伤组织诱导率，又防止了外植体因2,4-D浓度过高而褐变。本发明优选在所述愈伤组织诱导培养基上进行所述愈伤组织培养，愈伤组织诱导率达67.3％。

得到愈伤组织后，本发明将上述得到的愈伤组织接种于胚性愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织胚性诱导培养40～50d，得到胚性愈伤组织；所述胚性愈伤组织诱导培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括1.0mg/L的6-BA、1.0mg/L的GA3、0.1mg/L的IAA、300mg/L的水解酪蛋白、4.55g/L的琼脂和40g/L的蔗糖，pH值为5.6～6.2。在本发明中，所述愈伤组织优选为生长旺盛的愈伤组织块，切取表面颗粒状愈伤组织转移到所述胚性愈伤组织诱导培养基上，进行胚性诱导。在本发明中，所述愈伤组织胚性诱导培养的条件为光照强度2000～3000lx，相对湿度50～60％，温度23±1℃，每天光照12h；本发明所述胚性诱导为每20～25d继代一次，继代2次，得到淡黄色，质地松软的非胚性愈伤组织和排列紧密成颗粒状凸起的黄绿色透明状的胚性愈伤组织，挑取黄绿色透明状胚性愈伤组织。

所述胚性诱导得到胚性愈伤组织后，本发明优选将所述胚性愈伤组织进行增殖培养，获得质地较紧密的淡绿色颗粒状胚性愈伤组织。在本发明中，所述增殖培养过程的条件优选为：光照强度2000～3000lx，相对湿度50～60％，温度23±1℃，每天光照12h，每20d继代一次，经2～3次继代培养后获得质地较紧密的淡绿色颗粒状胚性愈伤组织，经过2～3次继代后，增值率达5.37倍。在本发明中，所述胚性愈伤组织诱导培养基中的6-BA与GA3可加速细胞伸长，促进细胞分裂，有利于胚性细胞的形成，同时增加蔗糖浓度，增加了培养基渗透压，有利于胚性细胞的形成。

得到胚性愈伤组织后，本发明将上述得到的胚性愈伤组织破碎，接种于体细胞胚诱导培养基上进行体细胞诱导培养29～31d，得到体细胞胚材料；所述体细胞胚诱导培养基以MS液体培养基为基本培养基，包括0.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的GA3、0.1mg/L的IAA、300mg/L的水解酪蛋白和40g/L的蔗糖，pH值为5.8。在本发明中，所述胚性愈伤组织，呈淡绿色、颗粒状的，将所述胚性愈伤组织先用镊子破碎，然后过30目不锈钢筛网，滤去不利于细胞悬浮培养的大颗粒后接种到体细胞胚诱导培养基上，在本发明实施例中，所述培养装置优选为培养瓶，所述培养瓶优选为为150ml的三角瓶，装培养液50mL(振荡培养时充分吸收氧)，在本发明中，所述胚性愈伤组织接种量0.8～1.0g/瓶，置120rpm摇床上，光照强度1200lx,培养温度23±1℃，培养8～10d，明显观察到瓶壁有细胞颗粒时，用30目筛网滤去大颗粒(因大颗粒细胞团中细胞发育不同步，采用30目不锈钢筛网进行初步筛选效果较好)，将滤液静置0.5h后去掉1/3的上清液，用无菌吸管吸取中间悬浮液，按体积比1:9添加体细胞胚诱导培养基，继续进行悬浮培养，每7天继代1次，继代3次后，用50～100目滤网过滤，收集体细胞胚材料，获得发育状态相对一致的体细胞胚培养材料，称重、统计。继代3次后体细胞胚增殖倍数最高达39.13。在本发明中，所述体细胞胚诱导培养基中的较低浓度的6-BA与低浓度生长素IAA配合使用能够促进胚性愈伤组织的增殖和体细胞胚的发育、低浓度的GA3可以抑制体细胞胚的分化，使悬浮培养的体胚材料处于相同的发育时期，水解酪蛋白主要增加培养基的氮素营养，促进胚性细胞的不断增殖，高浓度蔗糖既可以补充培养基的碳素养分又可以增加培养基的渗透压，调控桃儿七体细胞胚的发育。得到体细胞胚材料后，本发明将上述得到的体细胞胚材料接种于成熟化固体培养基上进行成熟培养12～14d，得到成熟化体细胞胚材料；所述成熟化固体培养基为以MS固体培养基为基本培养基，包括1.0mg/L的ABA、300mg/L的水解酪蛋白、4.55g/L的琼脂和40g/L的蔗糖，pH值为5.8。所述ABA可延缓或抑制细胞有丝分裂，促进细胞成熟。所述成熟培养的条件为光照强度2000～3000lx，相对湿度50～60％，温度23±1℃，每天光照时间12h；所述成熟培养基中的ABA能够抑制细胞有丝分裂，让体细胞胚快速成熟，避免畸形体细胞胚的发生，水解酪蛋白提供氮素营养，促进体细胞胚成长，高浓度蔗糖增加培养基渗透压，促进体细胞胚成熟。组合后可促进体细胞胚的发育，使体细胞胚进入球形胚阶段。

得到成熟化体细胞胚材料后，本发明将上述得到的成熟化体细胞胚材料转入发育培养基上进行发育培养3～5d，得到发育的体细胞胚材料；所述发育培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括20g/L的蔗糖和4.55g/L的琼脂。在本发明中，所述成熟化体细胞胚材料优选挑选无褐变且生长旺盛的体细胞胚材料。

得到成熟化体细胞胚材料后，本发明将上述得到的发育的体细胞胚材料转入萌发培养基上进行萌发培养30d，得到发育状态相对一致的体细胞胚；所述萌发培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括0.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的IAA、300mg/L的水解酪蛋白和40g/L的蔗糖，pH值为5.8。在本发明中，所述体细胞胚已进入鱼雷胚和子叶胚阶段，其中鱼雷胚占70％以上；所述萌发培养的条件为光照强度2000～3000lx，相对湿度50～60％，温度23±1℃，每天光照14h。在本发明中，所述萌发培养基中的6-BA与低浓度IAA配合使用能促进体细胞胚发育，40g/L蔗糖增加了培养基渗透压，促进了桃儿七体细胞胚成熟，水解酪蛋白为体细胞胚发育提供了养分，外源激素、营养物质、渗透压调节共同促进了桃儿七体细胞胚的发育。本发明还提供了一种利用桃儿七体细胞胚发生的方法获得完整植物的方法，将所述体细胞胚接种于丛生芽诱导培养基上进行诱导培养4～6周，形成丛生芽并进一步发育形成完整植株。在本发明中，所述丛生芽诱导优选为：将得到的所述体细胞胚接种于丛生芽诱导培养基上进行丛生芽诱导培养4～6周，形成丛生芽并进一步发育形成完整植株；所述丛生芽诱导培养基以1/2MS固体培养基为基本培养基，包括0.5mg/L的6-BA、0.01mg/L的IAA、20g/L的蔗糖和4.6g/L的琼脂；所述丛生芽诱导培养的条件为温度23±1℃，湿度40～50％，光照强度2000lx，每天光照12h；在本发明中，所述丛生芽诱导培养基中的0.5mg/L 6-BA与低浓度生长素IAA协同作用，促进器官的分化，低浓度的蔗糖可降低渗透压，有利于不定芽的分化，有助于体细胞胚发育成完整植株。所述丛生芽诱导培养后，淡黄色体细胞胚逐渐转变成绿色，表面开始凸起，形成丛生芽并进一步发育成完整小植株；所述体细胞胚丛生芽诱导率达75.4％。

下面结合实施例对本发明提供的一种桃儿七体细胞胚发生的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

取当年成熟饱满的桃儿七种子，在超净工作台内先用质量分数为1％的次氯酸钠水溶液进行表面消毒5min，无菌水冲洗3次，再用质量分数70％的乙醇消毒30s，用无菌水冲洗4次，然后用质量分数0.1％的升汞消毒5min，用无菌水冲洗5次，将种子接种到预培养的培养基上，预培养基为Ms固体培养基，蔗糖浓度为30g/L，培养温度22±1℃，暗培养条件下预培养5d，待种子完全吸胀且目测未发现有种子污染时，在超净工作台内取出预培养的种子，用手术刀片沿种脐线剖开种子，挤出完整种胚，将种胚接种于无菌苗诱导培养基，培养基为Ms+GA35.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉4.55g/L，pH值为5.6，培养温度22±1℃、湿度40％，先进行暗培养，3d后种胚开始膨大，逐渐形成棒状，7d后子叶开始伸长时转到光照强度2000lx的光照培养箱，每天光照12小时，培养25d，子叶长大、变绿，下胚轴伸长，长出胚根，获得3cm长的桃儿七无菌苗；在超净工作台内切取其下胚轴，切成0.5cm段，接入到诱导培养基Ms+2,4-D 1.0mg/L+KT 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉4.55g/L，pH值5.8，培养温度温度23±1℃，光强3000lx，每天光照12小时，培养25d生成愈伤组织；愈伤组织接种于培养基Ms+6-BA 1.0mg/L+IAA0.1mg/L+GA31.0mg/L+水解酪蛋白300mg/L+蔗糖40g/L+琼脂粉4.55g/L，pH值为6.0，光照强度2500lx，相对湿度60％，温度23±1℃每天光照12小时，每20d继代一次，继代2次后获得排列紧密呈颗粒状凸起的绿白色透明状的胚性愈伤组织；先用镊子破碎，然后过30目不锈钢筛网，滤去大颗粒后接种到液体培养基Ms+6-BA 0.5mg/L+IAA 0.1mg/L+GA30.1mg/L+蔗糖40g/L+水解酪蛋白300mg/L，调整pH值为5.8，培养瓶为150ml三角瓶，装液体培养基50mL，接种过筛网胚性愈伤组织0.8g/瓶，摇床转速120rpm,光照强度1200lx，培养温度23±1℃，悬浮培养10d后，将培养液在无菌条件下过30目筛网，滤液静止0.5h，去掉1/3的上清液，用无菌吸管吸取中间的悬浮液，按体积比1:9添加新鲜液体培养基，继续进行悬浮培养，每7d继代1次，连续继代培养3次后收集培养液，无菌条件下过50目筛网，得到生长状态相对一致的体细胞胚材料；无菌滤纸上吸去多余的水分，将分散状的体细胞胚接种到培养基Ms+ABA 1.0mg/L+水解酪蛋白300mg/L+琼脂粉4.55g/L+蔗糖40g/L中，培养条件：光照强度2000lx，相对湿度50％，温度23±1℃，每天光照12小时，培养12d后，将体细胞胚材转入Ms+蔗糖20g/L+琼脂粉4.55g/L，不添加激素，培养3d，再将体细胞胚转入成熟化培养基Ms+6-BA 0.5mg/L+IAA 0.1mg/L+水解酪蛋白300mg/L+蔗糖40g/L+琼脂粉4.55g/L，pH值为5.8，光照强度2000lx，相对湿度50％，温度23±1℃，每天光照14小时，培养25天，大量体细胞胚已进入鱼雷胚和子叶胚阶段，其中鱼雷胚占70％以上；接种于丛生芽诱导培养基1/2Ms+6-BA 0.05mg/L+IAA 0.01mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉4.6g/L，调整pH值为5.8，培养温度23±1℃，湿度40％，光照强度2000lx，每天光照12小时的环境中培养4周，淡黄色体细胞胚逐渐转变成绿色，表面开始突起，形成丛生芽并进一步发育形成完整小植株。体细胞胚丛生芽诱导率为78％，再生种苗移栽存活率达85.6％。

实施例2

取当年成熟饱满的桃儿七种子，在超净工作台内先用质量分数为1％的次氯酸钠水溶液进行表面消毒5min，无菌水冲洗4次，再用质量分数70％的乙醇消毒30s，用无菌水冲洗3次，然后用质量分数0.1％的升汞消毒5min，用无菌水冲洗4次，将种子接种到预培养的培养基上，预培养基为Ms固体培养基，蔗糖浓度为30g/L，培养温度22±1℃，暗培养条件下预培养7d，待种子完全吸胀且目测未发现有种子污染时，在超净工作台内取出预培养的种子，用手术刀片沿种脐线剖开种子，挤出完整种胚，将种胚接种于无菌苗诱导培养基，培养基为Ms+GA35.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉4.55g/L，pH值为5.6，培养温度22±1℃、湿度40％，先进行暗培养，2d后种胚开始膨大，逐渐形成棒状，7d后子叶开始伸长时转到光照强度2500lx的光照培养箱，每天光照12小时，培养30d，子叶长大、变绿，下胚轴伸长，长出胚根，获得2cm长的桃儿七无菌苗；在超净工作台内切取其下胚轴，切成0.5cm段，接入到诱导培养基Ms+2,4-D 1.0mg/L+KT 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉4.55g/L，pH值5.6，培养温度温度23±1℃，光强2000lx，每天光照12小时，培养20d生成愈伤组织；愈伤组织接种于培养基Ms+6-BA 1.0mg/L+IAA0.1mg/L+GA31.0mg/L+水解酪蛋白300mg/L+蔗糖40g/L+琼脂粉4.55g/L，pH值为5.8，光照强度2000lx，相对湿度50％，温度23±1℃每天光照12小时，每25d继代一次，继代2次后获得排列紧密呈颗粒状凸起的绿白色透明状的胚性愈伤组织；先用镊子破碎，然后过30目不锈钢筛网，滤去大颗粒后接种到液体培养基Ms+6-BA 0.5mg/L+IAA 0.1mg/L+GA30.1mg/L+蔗糖40g/L+水解酪蛋白300mg/L，调整pH值为5.8，培养瓶为150ml三角瓶，装液体培养基50mL，接种过筛网胚性愈伤组织1.0g/瓶，摇床转速120rpm,光照强度1200lx，培养温度23±1℃，悬浮培养8d后，将培养液在无菌条件下过30目筛网，滤液静止0.5h，去掉1/3的上清液，用无菌吸管吸取中间的悬浮液，按体积比1:9添加新鲜液体培养基，继续进行悬浮培养，每7d继代1次，连续继代培养3次后收集培养液，无菌条件下过80目筛网，得到生长状态相对一致的体细胞胚材料；无菌滤纸上吸去多余的水分，将分散状的体细胞胚接种到培养基Ms+ABA 1.0mg/L+水解酪蛋白300mg/L+琼脂粉4.55g/L+蔗糖40g/L中，培养条件：光照强度3000lx，相对湿度60％，温度23±1℃，每天光照12小时，培养14d后，将体细胞胚材转入Ms+蔗糖20g/L+琼脂粉4.55g/L，不添加激素，培养5d，再将体细胞胚转入成熟化培养基Ms+6-BA 0.5mg/L+IAA0.1mg/L+水解酪蛋白300mg/L+蔗糖40g/L+琼脂粉4.55g/L，pH值为5.8，光照强度3000lx，相对湿度60％，温度23±1℃，每天光照14小时，培养30天，大量体细胞胚已进入鱼雷胚和子叶胚阶段，其中鱼雷胚占70％以上；接种于丛生芽诱导培养基1/2Ms+6-BA 0.05mg/L+IAA 0.01mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉4.6g/L，调整pH值为5.8，培养温度23±1℃，湿度50％，光照强度2000lx，每天光照12小时的环境中培养6周，淡黄色体细胞胚逐渐转变成绿色，表面开始突起，形成丛生芽并进一步发育形成完整小植株。体细胞胚丛生芽诱导率为78％，再生种苗移栽存活率达85.6％。

实施例3

取当年成熟饱满的桃儿七种子，在超净工作台内先用质量分数为1％的次氯酸钠水溶液进行表面消毒5min，无菌水冲洗4次，再用质量分数70％的乙醇消毒30s，用无菌水冲洗3次，然后用质量分数0.1％的升汞消毒5min，用无菌水冲洗4次，将种子接种到预培养的培养基上，预培养基为Ms固体培养基，蔗糖浓度为30g/L，培养温度22±1℃，暗培养条件下预培养7d，待种子完全吸胀且目测未发现有种子污染时，在超净工作台内取出预培养的种子，用手术刀片沿种脐线剖开种子，挤出完整种胚，将种胚接种于无菌苗诱导培养基，培养基为Ms+GA35.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉4.55g/L，pH值为5.7，培养温度22±1℃、湿度40％，先进行暗培养，2d后种胚开始膨大，逐渐形成棒状，7d后子叶开始伸长时转到光照强度2500lx的光照培养箱，每天光照12小时，培养28d，子叶长大、变绿，下胚轴伸长，长出胚根，获得2cm长的桃儿七无菌苗；在超净工作台内切取其下胚轴，切成0.5cm段，接入到诱导培养基Ms+2,4-D 1.0mg/L+KT 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉4.55g/L，pH值5.7，培养温度温度23±1℃，光强2500lx，每天光照12小时，培养23d生成愈伤组织；愈伤组织接种于培养基Ms+6-BA 1.0mg/L+IAA0.1mg/L+GA31.0mg/L+水解酪蛋白300mg/L+蔗糖40g/L+琼脂粉4.55g/L，pH值为6.0，光照强度2500lx，相对湿度55％，温度23±1℃每天光照12小时，每22d继代一次，继代2次后获得排列紧密呈颗粒状凸起的绿白色透明状的胚性愈伤组织；先用镊子破碎，然后过30目不锈钢筛网，滤去大颗粒后接种到液体培养基Ms+6-BA 0.5mg/L+IAA 0.1mg/L+GA30.1mg/L+蔗糖40g/L+水解酪蛋白300mg/L，调整pH值为5.8，培养瓶为150ml三角瓶，装液体培养基50mL，接种过筛网胚性愈伤组织0.9g/瓶，摇床转速120rpm,光照强度1200lx，培养温度23±1℃，悬浮培养9d后，将培养液在无菌条件下过30目筛网，滤液静止0.5h，去掉1/3的上清液，用无菌吸管吸取中间的悬浮液，按体积比1:9添加新鲜液体培养基，继续进行悬浮培养，每7d继代1次，连续继代培养3次后收集培养液，无菌条件下过100目筛网，得到生长状态相对一致的体细胞胚材料；无菌滤纸上吸去多余的水分，将分散状的体细胞胚接种到培养基Ms+ABA 1.0mg/L+水解酪蛋白300mg/L+琼脂粉4.55g/L+蔗糖40g/L中，培养条件：光照强度2500lx，相对湿度55％，温度23±1℃，每天光照12小时，培养13d后，将体细胞胚材转入Ms+蔗糖20g/L+琼脂粉4.55g/L，不添加激素，培养4d，再将体细胞胚转入成熟化培养基Ms+6-BA 0.5mg/L+IAA0.1mg/L+水解酪蛋白300mg/L+蔗糖40g/L+琼脂粉4.55g/L，pH值为5.8，光照强度2500lx，相对湿度55％，温度23±1℃，每天光照14小时，培养28天，大量体细胞胚已进入鱼雷胚和子叶胚阶段，其中鱼雷胚占70％以上；接种于丛生芽诱导培养基1/2Ms+6-BA 0.05mg/L+IAA 0.01mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉4.6g/L，调整pH值为5.8，培养温度23±1℃，湿度46％，光照强度2000lx，每天光照12小时的环境中培养5周，淡黄色体细胞胚逐渐转变成绿色，表面开始突起，形成丛生芽并进一步发育形成完整小植株。体细胞胚丛生芽诱导率为78％，再生种苗移栽存活率达85.6％。

由以上实施例可知，本发明提供的诱导桃儿七体细胞胚发生的方法，，桃儿七下胚轴愈伤组织诱导率为67.3％，胚性愈伤组织转化率达75％以上，建立的胚性愈伤悬浮体系第一周增殖3.73倍，继代3次可增殖39.13倍，获得的体细胞胚材料中，鱼雷胚占达70％以上，体细胞胚丛生芽诱导率达78％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种诱导桃儿七体细胞胚发生的方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述暗培养的培养温度为22±1℃，培养湿度为40％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)的幼苗诱导培养的光照强度为2000～3000lx，每天光照10～14h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述愈伤组织培养的条件为光照强度为2000～3000lx，相对湿度为50～60％，培养温度为23±1℃，每天光照12h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述愈伤组织胚性诱导培养的条件为光照强度2000～3000lx，相对湿度50～60％，温度23±1℃，每天光照12h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述体细胞诱导培养的条件为光照强度1200lx，培养温度23±1℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)所述成熟培养的条件为光照强度2000～3000lx，相对湿度50～60％，温度23±1℃，每天光照时间12h。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤8)所述萌发培养的条件为光照强度2000～3000lx，相对湿度50～60％，温度23±1℃，每天光照14h。

9.一种基于权利要求1～8任一项所述的方法获得完整植株的方法，包括以下步骤：将所述体细胞胚接种于丛生芽诱导培养基上进行诱导培养4～6周，形成丛生芽并进一步发育形成完整植株；所述丛生芽诱导培养基以1/2MS固体培养基为基本培养基，包括0.5mg/L的6-BA、0.01mg/L的IAA、20g/L的蔗糖和4.6g/L的琼脂。