CN107356540A - 一种利用分光光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的方法 - Google Patents

一种利用分光光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用分光光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的方法，基于维生素C对高锰酸钾的褪色效应建立，并将其应用于实际样品测定，结果满意。该方法具有简便快速，准确可靠的优点，可用于蚕制品中抗氧化活性物质的含量测定，为家蚕的保健食品及药物开发提供实验数据。

Description

一种利用分光光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的 方法
技术领域
本发明属于家蚕的药物研究领域，具体涉及一种利用分光光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的方法。
背景技术
家蚕是一种药食两用佳品，早在《神农本草经》、《齐民要术》、《本草纲目》等书中已记载了家蚕的药用价值，其主治为小儿疮积、消瘦、消渴等。现代药理学研究发现家蚕具有抗糖尿病、抗疲劳、降血脂的作用，其中含有蛋白质、糖类、脂质、维生素等营养成分及黄酮类、1-脱氧野民霉素等活性成分，其通过抗氧化、抗炎等机制清除机体内自由基，保护胰岛β细胞，促进胰岛β细胞分泌胰岛素从而降低糖尿病患者的血糖水平，并阻止并发症的发生。目前，对于如何检测家蚕中抗氧化活性物质含量还没有很好的方法，这对家蚕的开发利用造成了一定的限制。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种利用分光光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的方法，简便快速，准确可靠，可用于蚕制品中抗氧化活性物质的含量测定，为家蚕的保健食品及药物开发提供实验数据。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种利用分光光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的方法，包括：
1)称取干燥粉碎的蚕制品0.08～0.12g，加入甲醇或65～75％乙醇并定容至50mL，浸泡1.5～2.5h，超声提取0.5～1.5h，静置，得到蚕制品提取液，备用；
2)取0.80～1.60mL浓度为2.0×10-3～2.5×10-3mol/L的KMnO4溶液和2.00～4.00mL浓度为0.8～1.2mol/L的H2SO4溶液，混合，加水定容至25mL，测其在525nm处吸光度为A0；
3)取0.80～1.60mL浓度为2.0×10-3～2.5×10-3mol/L的KMnO4溶液和2.00～4.00mL浓度为0.8～1.2mol/L的H2SO4溶液，混合，加入0.4～0.6mL步骤1)得到的蚕制品提取液，加水定容至25mL，放置5～7min后，测其在525nm处吸光度为A；
4)按照ΔA＝A0－A计算ΔA，然后将ΔA代入标准曲线方程y＝0.0114x－0.0035中y值，计算得到x值，即为蚕制品中抗氧化活性物质的含量。
一实施例中：所述步骤1)中，称取干燥粉碎的蚕制品0.1g，加入70％乙醇并定容至50mL，浸泡2h，超声提取1h，静置，得到所述蚕制品提取液。
一实施例中：所述步骤2)中，取1.20mL浓度为2.3×10-3mol/L的KMnO4溶液和3.00mL浓度为1mol/L的H2SO4溶液，混合，加水定容至25mL，测其在525nm处吸光度为A0。
一实施例中：所述步骤3)中，取1.20mL浓度为2.3×10-3mol/L的KMnO4溶液和3.00mL浓度为1mol/L的H2SO4溶液，混合，加入0.5mL步骤1)得到的蚕制品提取液，加水定容至25mL，放置5min后，测其在525nm处吸光度为A。
一实施例中：所述蚕制品包括家蚕、僵蚕、蚕沙。
一实施例中：所述家蚕为五龄蚕。
一实施例中：所述僵蚕为生僵蚕和/或制僵蚕。
一实施例中：所述蚕制品为家蚕，家蚕活体清理干净后，置-20℃冷冻保存，然后在不高于-45℃下冷冻干燥3～5天至其完全干燥后，粉碎，然后进行所述步骤1)。
一实施例中：所述蚕制品为僵蚕，僵蚕粉碎，然后进行所述步骤1)。
一实施例中：所述蚕制品为蚕沙，蚕沙干燥后粉碎，然后进行所述步骤1)。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
本发明采用紫外分光光度法，基于维生素C在酸性条件下对高锰酸钾的褪色效应，建立了褪色光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的方法，该方法简便、稳定、快速，测定结果准确可靠，为家蚕等蚕制品的进一步药物和保健食品开发提供了依据。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为实验例1中不同H2SO4溶液用量下的检测结果示意图。
图2为实验例2中不同KMnO4溶液用量下的检测结果示意图。
图3为实验例3中不同反应时间的检测结果示意图。
图4为本发明的标准曲线示意图。
图5为实验例6中不同溶剂提取的家蚕样本S2中抗氧化活性物质的含量测试结果。
图6为实验例7中不同蚕制品中抗氧化活性物质的含量测试结果。
图7为实验例8中不同部位入药血清中抗氧化活性物质的含量测试结果。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
一种利用分光光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的方法，包括：
1)称取干燥粉碎的蚕制品0.1g，放入50mL容量瓶中，加入70％乙醇定容至刻度，浸泡2h，80KHz进行超声提取1h，静置，备用；
2)取1.20mL浓度为2.3×10-3mol/L的KMnO4溶液和3.00mL浓度为1mol/L的H2SO4溶液加入25mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度，测其在525nm处吸光度为A0；
3)取1.20mL浓度为2.3×10-3mol/L的KMnO4溶液和3.00mL浓度为1mol/L的H2SO4溶液加入25mL容量瓶中，加入0.5mL步骤1)得到的蚕制品提取液，加超纯水定容至刻度，放置5min后，测其在525nm处吸光度为A；
4)按照ΔA＝A0－A计算ΔA，然后将ΔA代入标准曲线方程y＝0.0114x－0.0035中y值，计算得到x值，即为蚕制品中抗氧化活性物质的含量。
下面通过实验例进一步说明本发明。
下述实验例采用的蚕制品、前处理方法及相关试剂等如下。其余涉及到的试剂、设备、仪器、方法等除有特别说明外，均按照本领域常规技术进行。
1.供试品来源及前处理：
家蚕为5龄3天家蚕活体，僵蚕、蚕沙、桑叶为药店购买或自行采摘，其品名、编号、产地来源及采时间见表1。
表1蚕制品的编号、产地及采集时间
家蚕药材前处理：
(1)将采集的家蚕活体清理干净后，于-20℃低温冰箱中冷冻保存；或将家蚕活体直接烘干；
(2)低温处理后的家蚕放入冷冻真空干燥机，进行超低温(-45℃以下)冷冻干燥，至完全干燥(根据家蚕数量的多少通常需要3～5天不等)；
(3)经干燥后的家蚕放入中药粉碎机中粉碎3次，避光常温保存。
僵蚕药材前处理：
(1)僵蚕清理干净后，自然干燥或烘干，放入中药粉碎机中粉碎3次，避光常温保存。
蚕沙药材的前处理：
(1)将采集的蚕沙清理干净后，于50℃加热器中烘干保存；
(2)经干燥后的蚕沙放入中药粉碎机中粉碎3次，避光常温保存。
桑叶的前处理：
(1)将采集的桑叶清理干净后，于50℃加热器中烘干保存，或自然干燥后保存；
(2)经干燥后的桑叶放入中药粉碎机中粉碎3次，避光常温保存。
2.试剂
维生素C标准溶液(1000μg/mL)：准确称取0.5g维生素C加水定容至500mL棕色容量瓶中，临用前配制。
维生素C标准溶液(100μg/mL)：从1000μg/mL的维生素C标准溶液中移取10mL定容至100mL容量瓶中，摇匀待用。
H2SO4标准溶液(1mol/L)：量取28mL H2SO4缓慢倒入盛有少量超纯水的烧杯中，搅拌，稀释，定容至500mL容量瓶中。以下实施例中除有特别说明外，H2SO4溶液浓度均为1mol/L。
KMnO4标准溶液(2.3×10-3mol/L)：准确称取0.1817g KMnO4定容至500mL棕色容量瓶，需临用前配制。以下实施例中除有特别说明外，KMnO4溶液浓度均为2.3×10-3mol/L。
实验例1
取1.20mL KMnO4标准溶液至25mL容量瓶中，分别加入1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL的H2SO4标准溶液，加超纯水定容至刻度，测其在525nm处吸光度为A0；
分别取1.20mL KMnO4标准溶液和1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL的H2SO4标准溶液定容至25mL容量瓶中，分别加入0.5mL的1000μg/mL维生素C标准溶液，加超纯水定容至刻度，测其在525nm处吸光度为A；
按照ΔA＝A0－A计算ΔA。以ΔA对H2SO4溶液的体积作图，如图1所示。可以看出，本发明取2～4mL 1mol/L H2SO4为宜，H2SO4溶液的用量优选3.00mL。
实验例2
取3.00mL的H2SO4标准溶液加入25mL容量瓶中，分别加入0.40mL、0.80mL、1.20mL、1.60mL、2.00mL、2.40mL的KMnO4标准溶液，加超纯水定容至刻度，测其在525nm处吸光度为A0；
分别取3.00mL的H2SO4标准溶液和0.40mL、0.80mL、1.20mL、1.60mL、2.00mL、2.40mL的KMnO4标准溶液加入25mL容量瓶中，分别加入0.5mL的1000μg/mL维生素C标准溶液，加超纯水定容至刻度，测其在525nm处吸光度为A；
按照ΔA＝A0－A计算ΔA。以ΔA对KMnO4标准溶液的体积作图，如图2所示。可以看出，本发明取0.80～1.60mL 2.3×10-3mol/L H2SO4为宜，KMnO4标准溶液的用量优选1.20mL。
实验例3
取25mL的容量瓶加入1.20mL的KMnO4标准溶液和3.00mL的H2SO4标准溶液，加超纯水定容至刻度，测其在525nm处吸光度为A0；
取25mL的容量瓶，加入1.20mL的KMnO4标准溶液，3.00mL的H2SO4标准溶液和0.5mL的1000μg/mL维生素C标准溶液，加超纯水定容至刻度，在室温下放置反应，分别测其在1min、2min、3min、4min、5min、6min时在525nm处吸光度A；
按照ΔA＝A0－A计算ΔA。以ΔA对反应时间作图，如图3所示。可以看出，放置5min后反应完全，因此本发明选择放置反应5min后检测是合适的。
实验例4
取1.20mL的KMnO4标准溶液和3.00mL的H2SO4标准溶液放入25mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度，测其在525nm处吸光度为A0；
取1.20mL的KMnO4标准溶液和3.00mL的H2SO4标准溶液放入25mL容量瓶中，分别加入0.25mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL的100μg/mL维生素C标准溶液，加超纯水定容至刻度，在室温下放置反应5min后，测其在525nm处吸光度A；
按照ΔA＝A0－A计算ΔA。以ΔA对维生素C标准溶液的浓度作图，如图4所示。可以看出，ΔA与维生素C标准溶液的体积在0.25～4.00mL之间时，即对应换算得到维生素C的浓度在0～16μg/mL之间时，符合线性关系，所得线性回归方程为y＝0.0114x－0.0035，相关系数R2＝0.9998。
实验例5
称取0.1g的家蚕样本S2放入50mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，浸泡2h，超声提取1h，静置，备用；
取1.20mL KMnO4标准溶液和3.00mL H2SO4标准溶液加入25mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度，测其在525nm处吸光度为A0；取1.20mL KMnO4标准溶液和3.00mL H2SO4标准溶液加入25mL容量瓶中，加入0.5mL步骤1)得到的S2提取液，加超纯水定容至刻度，放置5min后，测其在525nm处吸光度为A；按照ΔA＝A0－A计算ΔA，所得ΔA为0.055，然后将ΔA代入标准曲线方程y＝0.0114x－0.0035中y值，计算得到x值，即为S2中抗氧化活性物质的浓度，为5.13μg/mL。
取1.20mL KMnO4标准溶液和3.00mL H2SO4标准溶液加入25mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度，测其在525nm处吸光度为A0；取1.20mL KMnO4标准溶液和3.00mL H2SO4标准溶液加入25mL容量瓶中，加入0.5mL步骤1)得到的S2提取液，再分别加入不同浓度的维生素C标准溶液，使其浓度为样品浓度的80％、100％、120％，加超纯水定容至刻度，放置5min后，测其在525nm处吸光度为A；按照ΔA＝A0－A计算ΔA，将ΔA代入标准曲线方程y＝0.0114x－0.0035中y值，计算得到x值。平行测定9次。其结果如表2所示，回收率在100.33％～108.33％，RSD在1.06％～1.15％。
表2样品加样回收率试验结果(n＝9)
实验例6
分别称取0.1g的家蚕样本S2放入50mL容量瓶中，分别加入甲醇、正丁醇、乙酸乙酯、70％乙醇定容至刻度，浸泡2h，超声提取1h，静置，备用；具体如表3所示：
表3不同溶剂提取家蚕样本S2的编号
取1.20mL KMnO4标准溶液和3.00mL H2SO4标准溶液加入25mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度，测其在525nm处吸光度为A0；取1.20mL KMnO4标准溶液和3.00mL H2SO4标准溶液加入25mL容量瓶中，分别加入0.5mL的样品溶液，加超纯水定容至刻度，放置5min后，测其在525nm处吸光度为A；按照ΔA＝A0－A计算ΔA，然后将ΔA代入标准曲线方程y＝0.0114x－0.0035中y值，计算得到x值，即为不同溶剂提取的S2中抗氧化活性物质的浓度。
结果如图5所示，可知甲醇与70％乙醇的提取效果均较好，因此本发明选用甲醇和70％乙醇作为提取溶剂是合理的，进一步地，考虑到70％乙醇无毒性，因而优选70％乙醇为提取溶剂。
实验例7
分别称取待测样品各0.1g，分别放入50mL容量瓶中，分别加入70％乙醇定容至刻度，浸泡2h，超声提取1h，静置，备用。
取1.20mL KMnO4标准溶液和3.00mL H2SO4标准溶液加入25mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度，测其在525nm处吸光度为A0；取1.20mL KMnO4标准溶液和3.00mL H2SO4标准溶液加入25mL容量瓶中，分别加入0.5mL的待测样品，加超纯水定容至刻度，放置5min后，测其在525nm处吸光度为A；按照ΔA＝A0－A计算ΔA，然后将ΔA代入标准曲线方程y＝0.0114x－0.0035中y值，计算得到x值，即为不同蚕制品中抗氧化活性物质的浓度。
结果如图6所示，家蚕中S1中抗氧化活性物质含量较高，家蚕、僵蚕、桑叶、蚕沙中僵蚕的抗氧化活性物质含量较高。
实验例8
实验动物：成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠9只，SPF级，体重400～500g，批号20160001228，购买于上海斯莱克动物有限公司。
分组及方法：
(1)将大鼠按标准饲料、自来水喂养，饲养温度(25±2)℃，相对湿度(50±5)％，给药前禁食不禁水12h。
(2)随机选取大鼠分为空白组1只、正丁醇部位组4只、70％乙醇部位组4只，根据大鼠的体重予相应的家蚕粉(正丁醇部位)或(70％乙醇部位)提取物单次灌胃，空白组灌胃相同体积水。正丁醇部位提取物和70％乙醇部位提取物的制备方法参考实验例6。
(3)根据灌胃的时间0.5h、1h、2h、4h后，将大鼠用乙醚迷晕，在其心脏的左心室取血，置于10mL的0.1％肝素钠的离心管中。4℃下3500r/min离心20min，取其上清液。
(4)将所取上清液放入另一个10mL离心管中，再放入冷冻真空干燥机。
(5)将离心管中干燥后的血清于-20℃低温冰箱中冷冻保存。
(6)血清样品的具体信息见表4。
表4家蚕不同部位入药血清的编号
分别称取空白组、家蚕粉提取物正丁醇部位组、70％乙醇部位组的不同入药时间的干燥血清10mg放入10mL容量瓶中，分别加入70％乙醇定容至刻度，浸泡2h，超声提取1h，静置，备用。
取0.48mL KMnO4标准溶液和1.20mL H2SO4标准溶液加入10mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度，测其在525nm处吸光度A0为0.288；取0.48mL KMnO4标准溶液和1.20mL H2SO4标准溶液加入10mL容量瓶中，分别加入1mL的入血血清溶液，加超纯水定容至刻度，放置5min后，测其在525nm处吸光度为A；按照ΔA＝A0－A计算ΔA，然后将ΔA代入标准曲线方程y＝0.0114x－0.0035中y值，计算得到x值，即为家蚕不同部位入药血清中的抗氧化活性物质的浓度。
结果如图7所示，ΔA随着家蚕粉入血时间的变长而逐渐增大，说明入药时间越久其抗氧化活性越好。70％乙醇部位的血清中抗氧化活性物质含量多于正丁醇部位。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种利用分光光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的方法，其特征在于：包括：
1)称取干燥粉碎的蚕制品0.08～0.12g，加入甲醇或65～75％乙醇并定容至50mL，浸泡1.5～2.5h，超声提取0.5～1.5h，静置，得到蚕制品提取液，备用；
2)取0.80～1.60mL浓度为2.0×10-3～2.5×10-3mol/L的KMnO4溶液和2.00～4.00mL浓度为0.8～1.2mol/L的H2SO4溶液，混合，加水定容至25mL，测其在525nm处吸光度为A0；
3)取0.80～1.60mL浓度为2.0×10-3～2.5×10-3mol/L的KMnO4溶液和2.00～4.00mL浓度为0.8～1.2mol/L的H2SO4溶液，混合，加入0.4～0.6mL步骤1)得到的蚕制品提取液，加水定容至25mL，放置5～7min后，测其在525nm处吸光度为A；
4)按照ΔA＝A0－A计算ΔA，然后将ΔA代入标准曲线方程y＝0.0114x－0.0035中y值，计算得到x值，即为蚕制品中抗氧化活性物质的含量。
2.根据权利要求1所述的利用分光光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的方法，其特征在于：所述步骤1)中，称取干燥粉碎的蚕制品0.1g，加入70％乙醇并定容至50mL，浸泡2h，超声提取1h，静置，得到所述蚕制品提取液。
3.根据权利要求1所述的利用分光光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的方法，其特征在于：所述步骤2)中，取1.20mL浓度为2.3×10-3mol/L的KMnO4溶液和3.00mL浓度为1mol/L的H2SO4溶液，混合，加水定容至25mL，测其在525nm处吸光度为A0。
4.根据权利要求1所述的利用分光光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的方法，其特征在于：所述步骤3)中，取1.20mL浓度为2.3×10-3mol/L的KMnO4溶液和3.00mL浓度为1mol/L的H2SO4溶液，混合，加入0.5mL步骤1)得到的蚕制品提取液，加水定容至25mL，放置5min后，测其在525nm处吸光度为A。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的利用分光光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的方法，其特征在于：所述蚕制品包括家蚕、僵蚕、蚕沙。
6.根据权利要求5所述的利用分光光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的方法，其特征在于：所述家蚕为五龄蚕。
7.根据权利要求5所述的利用分光光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的方法，其特征在于：所述僵蚕为生僵蚕和/或制僵蚕。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的利用分光光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的方法，其特征在于：所述蚕制品为家蚕，家蚕活体清理干净后，置-20℃冷冻保存，然后在不高于-45℃下冷冻干燥3～5天至其完全干燥后，粉碎，然后进行所述步骤1)。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的利用分光光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的方法，其特征在于：所述蚕制品为僵蚕，僵蚕粉碎，然后进行所述步骤1)。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的利用分光光度法测定蚕制品中抗氧化活性物质含量的方法，其特征在于：所述蚕制品为蚕沙，蚕沙干燥后粉碎，然后进行所述步骤1)。
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