CN107354217A - 一种用于白花蛇舌草遗传多样性分析的issr分子标记方法 - Google Patents

一种用于白花蛇舌草遗传多样性分析的issr分子标记方法 Download PDF

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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

本发明提供一种用于白花蛇舌草遗传多样性分析的ISSR分子标记方法，属于分子生物学技术领域。该方法选用四条背景清晰、扩增效果好和多态性高的引物，利用ISSR‑PCR反应扩增所述白花蛇舌草基因组DNA，根据ISSR‑PCR结果，分析条带，建立白花蛇舌草的DNA指纹图谱，构建白花蛇舌草的遗传资源数据库。本发明为白花蛇舌草品种鉴定以及遗传多样性分析建立了新的方法，有效解决前人在遗传标记数据库构建中，库的代表性差的问题；也解决了已有标记技术在白花蛇舌草遗传资源方面的不足，具有多态性高、重复性好、费用低、检测程序简单和不受环境影响的优点。

Description

一种用于白花蛇舌草遗传多样性分析的ISSR分子标记方法
【技术领域】
本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种用于白花蛇舌草遗传多样性分析的ISSR分子标记方法。
【背景技术】
白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd.为壮族民间常用中草药，为一年生草本，叶对生，无柄；花单生或双生于叶腋，花梗略粗壮，4数；蒴果膜质，扁球形；广泛分布于我国长江以南地区，多见于水田等湿润的旷地。白花蛇舌草具有清热解毒、活血化瘀、利水渗湿、消肿止痛的功效，内服多用于治疗肿瘤、蛇咬伤、小儿疳积；外用主治泡疮、刀伤、跌打等症。
白花蛇舌草种质资源在DNA分子水平上存在极其丰富的遗传多样性。充分了解白花蛇舌草种质资源的遗传多样性与谱系关系是种质创新与遗传育种的基本要求和前提。目前对白花蛇舌草的研究多集中在形态学、化学、药理学；分子方面，有学者对白花蛇舌草进行了DNA提取的考察，还有学者利用RAPD、AFLP、ITS序列对白花蛇舌草进行研究。
ISSR分子标记是在SSR标记基础上发展起来的一种新技术,其基本原理是在SSR的5’或3’端加锚1-4个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段基因组DNA序列进行扩增。ISSR兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子标记的优点，与SSR相比，ISSR不需要预先获知序列信息而使成本降低，且多态性更丰富；与RAPD相比，ISSR重复性高，稳定性好，同时具备RAPD的简便、易操作等特点。目前，还未有学者利用ISSR分子标记对白花蛇舌草的遗传多样性研究。
【发明内容】
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种用于白花蛇舌草遗传多样性分析的ISSR分子标记方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于白花蛇舌草遗传多样性分析的ISSR分子标记引物体系，所述引物体系包括的引物为121号、156号、157号和160号引物；其中，
121号引物的核苷酸序列为ACACACACACACTC，如SED ID No.1所示；
156号引物的核苷酸序列为ACACACACACACCT，如SED ID No.2所示；
157号引物的核苷酸序列为ACACACACACACCG，如SED ID No.3所示；
160号引物的核苷酸序列为GATGATGATGATGC，如SED ID No.4所示。
优选地，利用上述引物体系分析白花蛇舌草遗传多样性的方法，具体步骤为：
(1)提取白花蛇舌草的基因组DNA，利用ISSR-PCR反应扩增所述白花蛇舌草的基因组DNA；
(2)对步骤(1)所述PCR扩增得到的PCR产物进行电泳、显色，显色结束后，拍照获取谱带信息并保存；
(3)对步骤(2)所获得的谱带信息进行分析，同一位点有相同的扩增条带记为“1”，无则记为“0”，从而得到“1”、“0”矩阵图；采用POPGENE1.32、NTSYS2.10软件对白花蛇舌草的ISSR-PCR数据进行归类和分析，利用POPGENE1.32分别计算出有效等位基因Ne、等位基因数Na、Shannon’s信息指数、Nei’s基因多样性指数等遗传多样性参数,居群内基因多样性Hs、居群总基因多样度Ht、居群间遗传分化系数Gst以及基因流Nm等遗传分化指标。再利用NTSYS2.10软件做聚类分析图。
步骤(1)中ISSR-PCR反应所使用的引物的核苷酸序列为SED ID No.1-4。
所述步骤(1)中ISSR-PCR反应体系及程序为：20μL体系：2×Taq PCR Mastermix10.0μL、引物1.0μL、模板DNA1.0μL、ddH2O 8.0μL；扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火30s，退火温度由不同引物的Tm决定，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸5min,4℃保存。
优选地，所述退火温度设定比引物Tm低5℃.
优选地，所述步骤(2)中的电泳为1.2％的琼脂糖凝胶电泳，电压75V，电泳时间50min，用D2000DNA Marker作为标准参照。
需要说明的是，所述的引物体系在辅助鉴定白花蛇舌草中的应用也在本发明的保护范围之内。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
(1)本发明中ISSR分子标记引物体系带型稳定、清晰且重复性好，多态性高，利用这4个引物对白花蛇舌草进行聚类分析，为白花蛇舌草品种鉴定以及遗传多样性分析建立了新的方法。
(2)本发明有效解决前人在遗传标记数据库构建中，库的代表性差的问题；也解决了已有标记技术在白花蛇舌草遗传资源方面的不足，具有多态性高、重复性好、费用低、检测程序简单和不受环境影响的优点。本发明以ISSR为起点，弥补了国内外对白花蛇舌草分子标记研究甚少的不足，发明成果可用于白花蛇舌草品种资源保存与鉴定、遗传关系与品种纯度分析、分子标记辅助育种、新品种保护以及解决品种争议等方面，具有相当大的科学价值与应用价值。
【附图说明】
图1为121号引物对23个白花蛇舌草品种的扩增产物电泳图。
图2为156号引物对23个白花蛇舌草品种的扩增产物电泳图。
图3为157号引物对23个白花蛇舌草品种的扩增产物电泳图。
图4为160号引物对23个白花蛇舌草品种的扩增产物电泳图。
图5为23份来自7个不同省区白花蛇舌草样品基于ISSR的聚类分析图。
【具体实施方式】
为了更清楚地表达本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
采集23份来自广西壮族自治区、广东省、湖南省、浙江省、福建省、江西省和安徽省7个省区白花蛇舌草样品，样品来源如下表1。
表1
1、DNA的提取
以表1所示的23个不同地区取得的白花蛇舌草样品，分别采用试剂盒法提取DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测各品种甘薯的总DNA纯度、质量以及完整性。
2、引物的合成
委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成如下4种引物：
121号引物的核苷酸序列为ACACACACACACTC，如SED ID No.1所示；
156号引物的核苷酸序列为ACACACACACACCT，如SED ID No.2所示；
157号引物的核苷酸序列为ACACACACACACCG，如SED ID No.3所示；
160号引物的核苷酸序列为GATGATGATGATGC，如SED ID No.4所示。
3、ISSR-PCR扩增及电泳检测
以提取的各不同地区的白花蛇舌草的基因组DNA为模板，分别利用ISSR-PCR反应进行扩增。ISSR-PCR反应体系及程序为：20μL体系：2×Taq PCR Mastermix 10.0μL、引物1.0μL、模板DNA 1.0μL、ddH2O 8.0μL；扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火30s，退火温度由不同引物的Tm决定(每种引物的具体退火温度见表2)；72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸5min，4℃保存。
对所述PCR扩增得到的PCR产物，取8μLPCR产物用进行电泳、显色，电泳采用1.2％的琼脂糖凝胶电泳，电压75V，电泳时间50min，用D2000DNA Marker作为标准参照。显色结束后，拍照获取谱带信息并保存。
表2
引物 序列 退火温度(℃)
121 ACACACACACACTC 51.6
156 ACACACACACACCT 48.9
157 ACACACACACACCG 52.6
160 GATGATGATGATGC 54.2
4、多样性分析
对所获得的谱带信息进行分析，ISSR为显性标记，同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为是同一位点的产物。同一位点有相同的扩增条带记为“1”，无则记为“0”，从而得到“1”、“0”矩阵图。采用POPGENE1.32、NTSYS2.10软件对白花蛇舌草的ISSR-PCR数据进行归类和分析，利用POPGENE1.32分别计算出有效等位基因Ne、等位基因数Na、Shannon’s信息指数、Nei’s基因多样性指数等遗传多样性参数,居群内基因多样性Hs、居群总基因多样度Ht、居群间遗传分化系数Gst以及基因流Nm等遗传分化指标。再利用NTSYS2.10软件做聚类分析图。
5、结果与分析
(1)多态性分析
如图1-4为4种引物对23个白花蛇舌草品种的扩增产物电泳图，可以看出，所获得的条带清晰且丰富，条带统计结果见表3，4条引物共扩增出45条条带，其中多态性条带37条，多态性百分比(PPB)为82.22％。由此可见，不同引物所扩增出的条带数不同，且同一引物、不同地区的白花蛇舌草间扩增的带数也不相同，反映23个样品之间丰富的多态性和复杂的遗传背景，这不仅为分析白花蛇舌草的亲缘关系提供可能，同时表明白花蛇舌草遗传多样性和遗传背景复杂性。
表3
引物 扩增条带/条 多态性条带/条 多态性比(PPB)(％)
121 14 13 92.86
156 13 12 92.30
157 10 9 90.00
160 8 7 87.50
总数 45 37 82.22
(2)聚类分析
由等位基因数(Na)、有效等位基因(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)和Shannon’s信息指数(I)这几个参数可以反映多样性。Ne值越大，说明等位基因越重要，等位基因作用越大。I和H值越大，说明该样品遗传多样性水平越高。整体样本的物种水平可知，白花蛇舌草的Na值为1.8222，Ne值为1.5132，H值为0.3028，I值为0.4509。不同产地白花蛇舌草的居群总基因多样度(Ht)为0.2877，居群内基因多样性(Hs)为0.1012，居群间遗传分化系数(Gst)为0.6483。其中Gst>Hs，说明居群间遗传分化度比居群内遗传分化度更高。基因流(Nm)为0.2712<1，说明居群间遗传分化水平较低，不同产地居群间基因交流较少。聚类图见图5，分析可知，来源地相同的白花蛇舌草居群多表现出较为密切的亲缘关系，不同来源地的白花蛇舌草居群间遗传差异相对较大。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
<110>广西中医药大学
<120>一种用于白花蛇舌草遗传多样性分析的ISSR分子标记方法
<160> 4
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
ACACACACACACTC 14
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
ACACACACACACCT 14
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
ACACACACACACCG 14
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
GATGATGATGATGC 14

Claims (6)

1.一种用于白花蛇舌草遗传多样性分析的ISSR分子标记引物体系，其特征在于：所述引物体系包括的引物为121号、156号、157号和160号引物；其中，
121号引物的核苷酸序列为ACACACACACACTC，如SED ID No.1所示；
156号引物的核苷酸序列为ACACACACACACCT，如SED ID No.2所示；
157号引物的核苷酸序列为ACACACACACACCG，如SED ID No.3所示；
160号引物的核苷酸序列为GATGATGATGATGC，如SED ID No.4所示。
2.一种利用权利要求1所述引物体系分析白花蛇舌草遗传多样性的方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)提取白花蛇舌草的基因组DNA，利用ISSR-PCR反应扩增所述白花蛇舌草基因组DNA；
(2)对步骤(1)所述PCR扩增得到的PCR产物进行电泳、显色，显色结束后，拍照获取谱带信息并保存；
(3)对步骤(2)所获得的谱带信息进行分析，同一位点有相同的扩增条带记为“1”，无则记为“0”，从而得到“1”、“0”矩阵图；采用分析软件分别计算出遗传多样性参数有效等位基因Ne、等位基因数Na、Shannon’s信息指数、Nei’s基因多样性指数,以及遗传分化指标居群内基因多样性Hs、居群总基因多样度Ht、居群间遗传分化系数Gst以及基因流Nm，再利用相关软件获得聚类分析图。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中ISSR-PCR反应体系及程序为：20μL体系：2×Taq PCR Mastermix 10.0μL、引物1.0μL、模板DNA1.0μL、ddH2O 8.0μL；扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火30s，退火温度由不同引物的Tm决定，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸5min,4℃保存。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的电泳为1.2％的琼脂糖凝胶电泳，电压75V，电泳时间50min，用D2000 DNA Marker作为标准参照。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述退火温度设定比引物Tm低5℃。
6.权利要求1所述的引物体系在辅助鉴定白花蛇舌草中的应用。
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