CN107338243A - 重组间充质干细胞及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组间充质干细胞，重组间充质干细胞内转入有miR‑124和miR‑21。本发明还提供了上述重组间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：通过脂质体转染方式，将miR‑124和miR‑21转染进入间充质干细胞，筛选出表达水平上调的细胞，得到重组间充质干细胞。本发明的重组间充质干细胞，其迁移能力和增殖能力均得到提高，从而提高MSCs细胞移植治疗中枢神经系统等疾病的疗效。

Description

重组间充质干细胞及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组间充质干细胞及其制备方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种中胚层来源的具有多分化潜能的成体干细胞，存在于结缔组织和器官间质中，MSCs来源广泛，可从骨髓、脂肪、脐带(血)、牙龈、骨骼肌等组织中获得，其中以骨髓组织中的含量最为丰富。MSCs具有干细胞所特有的无限增殖及自我更新能力，在体外传代培养及冻存复苏后仍能保持其“干性”；具有多向分化潜能，在合适的体内外环境下，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等多种细胞类型；具有低免疫原性，通过产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，异体移植排异较轻，配型要求不严格。总之，MSCs具有增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制，易于产业化制备、体内植入后不良反应较弱等优点。因此，MSCs备受关注，有望成为继造血干细胞之后最具临床应用前景的多能干细胞。

现有技术中，MSCs可用于血液系统疾病、心血管疾病(如心肌梗死)、肝硬化、软骨与骨损伤修复等多种疾病替代性治疗的应用研究中。同时，MSCs在中枢神经系统疾病如脊髓损伤修复以及神经退行性疾病如脑萎缩、帕金森病、阿尔茨海默综合征等顽症的治疗方面具有重要的应用前景。MSCs还可作为基因载体，应用于基因缺陷引起的遗传性疾病的治疗，并用于解决某些自身免疫性疾病方面的问题。此外，MSCs与生物材料相结合，能够修复骨、软骨、肌腱等各种组织的缺损，这是组织工程中的新兴领域。

近年来的体内实验结果发现，虽然起始移植的MSCs细胞数量很多，然而最终迁移到损伤区域能够存活下来，并进一步分裂分化的细胞数量非常少。例如有文献报道脊髓损伤手术 26天后，在损伤局部可检测到的存活的移植细胞还不到1％，严重影响了干细胞修复局部损伤组织的效果。而无论MSCs发挥治疗作用的方式是分化为损伤组织的细胞类型以修复受损组织，还是着重于改善微环境，提高损伤区移植细胞的数量与质量都是至关重要的，这也是目前干细胞移植治疗领域的一个瓶颈。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种重组间充质干细胞及其制备方法，本发明的重组间充质干细胞，其迁移能力和增殖能力均得到提高，从而提高MSCs细胞移植治疗中枢神经系统等疾病的疗效。

本发明的重组间充质干细胞，重组间充质干细胞内转入有miR-124和miR-21。

进一步地，miR-124的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地，miR-21的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了上述重组间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

通过脂质体转染方式，将miR-124和miR-21转染进入间充质干细胞，筛选出表达水平上调的细胞，得到重组间充质干细胞。

进一步地，在转染之前，还包括将间充质干细胞进行分离、原代及传代培养的步骤。

进一步地，间充质干细胞来源于骨髓、肌肉和神经中的一种或几种。

进一步地，重组间充质干细胞的迁移能力和增殖能力得到提高。

进一步地，在筛选后，还包括采用miRNA定量检测技术，定量分析细胞并验证其表达水平的步骤。

进一步地，将重组间充质干细胞传代后，可进行体外验证，检测其定向迁移能力、增殖能力及神经方向分化能力。

进一步地，可构建脊髓损伤模型，将重组间充质干细胞移植入模型中，进行体内验证，检测其在动物体内的定向迁移能力、增殖能力及神经方向分化能力。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明提供了一种具有高迁移能力和高增殖能力的重组间充质干细胞，该干细胞具有上调的miR-124和miR-21，细胞的迁移、增殖与分化等生物学行为得到调控，显著提高了MSCs 的迁移速度与距离，该重组间充质干细胞可促进细胞划痕的愈合，MSCs的增殖能力得到提高，有效增加细胞的数量，相比MSCs，本发明的重组间充质干细胞向神经元方向的分化潜能得到明显增强。

本发明还提供了一种全新的、更加有效的高迁移能力重组MSCs的制备方法，上调有效调控MSCs趋化性迁移行为的关键miRNAs分子：miR-124，以及调控MSCs增殖能力的关键miRNA分子：miR-21。证明了通过调控miR-124可以在体外、体内得到高定向迁移能力的MSCs细胞群体；通过调控miR-21可以在体外得到高增殖能力的MSCs细胞群体，并且具有高神经分化方向潜能。从而进一步提高MSCs细胞移植治疗中枢神经系统疾病等顽症的疗效，本发明对于提高干细胞如MSCs在临床上治疗各种疾病的细胞移植治疗效果具有重要价值。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明重组间充质干细胞的实时定量PCR检测结果；

图2是实施例1中细胞划痕实验中各细胞的荧光检测结果；

图3是实施例1中细胞划痕实验中，不同物质与划痕愈合面积关系测试结果；

图4是实施例1中EDU检测实验中各细胞的荧光检测结果；

图5是实施例1中EDU检测实验中，各细胞增殖情况的统计结果；

图6是实施例1中，间充质干细胞分化实验中，不同物质与细胞分化免疫荧光结果；

图7是脊髓损伤模型中重组间充质干细胞的荧光检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中，间充质干细胞来源于SD大鼠骨髓组织。

实施例1重组间充质干细胞的制备和验证

(1)间充质干细胞的分离、原代及传代培养，具体方法如下：

将大鼠间充质干细胞通过全骨髓贴壁培养法提取原代细胞，使用含有10％血清的低糖 (L-DMEM)培养基，放置于含有5％二氧化碳的37℃培养箱中。

(2)干细胞构建：

通过脂质体转染方式，将miR-124或miR-21转染进入间充质干细胞干细胞，从而构建成高表达miR-124或miR-21的重组间充质干细胞，具体操作如下：

1.将MSCs以5×10⁴/ml密度接种于35mm细胞培养皿中。待细胞长至80％汇合后开始转染。保证转染终浓度为50nM miRNA促进剂。

2. 5ul预先配置好的mimics溶液加入245μl L-DMEM，轻轻混合，室温静置5min。

3. 5μl脂质体2000与245μl L-DMEM(不含血清的培养基)轻轻混合，室温静置5min。

4.将以上稀释好的脂质体2000与miRNA mimic轻轻混匀，室温静置30min。

5.吸掉MSCs中的原培养基，无血清的L-DMEM洗1-2次，然后加入1500μl不含血清的L-DMEM培养基，最后加入混合好的转染液，轻轻摇匀，于培养箱中培养。

6. 6h后去除转染液，加入MSCs生长培养基(L-DMEM+10％FBS)，48h后提取RNA。

(3)表达水平验证：通过“茎环法”实时定量PCR检测转染后的miRNA组，并验证其表达水平，进一步筛选得到置信度高的表达水平显著上调的目标miRNA组。

验证结果如图1所示，图1中，nc代表空白对照组，mc代表转染mimics control组，m代表转染mimics组，图中*代表转染Micro-RNA124mimics组分别与转染mimics control组、未转染组之间用PCR检测micro-RNA124表达量之间的关系，*表示P<0.05，具有统计学意义。结果表明，采用以上方法成功构建了高表达miR-124重组间充质干细胞。

(4)重组间充质干细胞的体外验证：传代培养步骤(2)构建的重组间充质干细胞，并检验其定向迁移能力、增殖能力及神经方向分化能力。

通过细胞划痕实验来检验重组间充质干细胞的迁移能力，检测0h、6h、12h、24h的细胞分布情况，结果如图2-3所示。图2中，BMSC NC组表示空白对照组不同时间点同一视野下划痕的变化情况，BMSC MC组表示转染mimics control后的bmsc细胞组不同时间点同一视野下划痕的变化情况，BMSC M-21组表示转染microRNA-21mimics后的bmsc细胞组不同时间点同一视野下划痕的变化情况，BMSC M-124组表示转染microRNA-124mimics后的bmsc细胞组不同时间点同一视野下划痕的变化情况，从图中可看出，BMSC M-124组细胞划痕愈合速率较其他组更快。从图3中可看出，统计不同处理组不同时间细胞划痕愈合面积之间的关系可以看出，24h-nc组与24h-mir-124组之间具有统计学意义，p<0.05。

通过EDU检测方法检测图2中各组细胞的增殖能力，结果如图4和5所示。图4中EDU(+) 下方的图表示EDU标记的增殖的细胞，各组细胞带有绿色荧光，Hoechst33342(+)下方的图表示视野内所有具有细胞核的细胞，各组细胞带有蓝色荧光，Merge下方图表示以上两组带绿色和蓝色细胞叠加后的结果。对于不用实验处理分组之间用EDU检测细胞增殖情况，统计结果显示(图5)，m-21组与nc组之间具有统计学意义，P<0.01.

采用经典的bfgf及bha诱导分化方式检验图2中各组细胞的神经方向分化能力，结果如图6所示。图6中，NEUN(+)下方的图表示细胞内神经元特异抗体存在，细胞向神经元方向分化，各组细胞带有绿色荧光，Hoechst33342(+)下方的图表示视野内所有具有细胞核的细胞，各组细胞带有蓝色荧光，Merge下方图表示以上两组带绿色和蓝色细胞叠加后的结果。

(5)重组间充质干细胞的体内验证：使用钳夹法构建动物脊髓损伤模型，通过腰椎穿刺方法移植cm-dil标记的重组MSCs细胞，然后冰冻切片免疫荧光染色，检验重组MSCs细胞移植进入体内以后的迁移、增殖、分化能力，结果如图7所示。图7中，BMSC NC代表空白对照组细胞，CM-DIL(+)代表体外活细胞染料cm-dil标记的bmsc细胞，细胞带有红色荧光，GFAP(+)代表脊髓组织细胞内神经胶质细胞相关抗体表达阳性的区域组织细胞，细胞带有绿色荧光，Hoechst33342(+)代表视野内所有具有细胞核的细胞，细胞带有蓝色荧光，Merge为以上三幅图叠加后的结果。图7表明，体外用活细胞染料cm-dil标记BMSC，移植进入脊髓损伤的SD大鼠体内，细胞不但可以存活且迁移至脊髓损伤部位，还可以分化为神经胶质相关细胞。

通过以上实验可知，采用本发明的方法，通过在间充质干细胞中转染miR-124和miR-21，所得到的重组间充质干细胞具有高迁移能力和高增殖能力，该重组间充质干细胞可用于脊髓损伤的修复。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 重组间充质干细胞及其制备方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> RNA

<213> 核苷酸序列

<400> 1

UAAGGCACGC GGUGAAUGCC 20

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 核苷酸序列

<400> 2

UAGCUUAUCA GACUGAUGUU GA 22

Claims (7)

1.一种重组间充质干细胞，其特征在于：所述重组间充质干细胞内转入有miR-124和miR-21。

2.根据权利要求1所述的重组间充质干细胞，其特征在于：所述miR-124的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的重组间充质干细胞，其特征在于：所述miR-21的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

通过脂质体转染方式，将所述miR-124和miR-21转染进入间充质干细胞，筛选出表达水平上调的细胞，得到所述重组间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：在转染之前，还包括将所述间充质干细胞进行分离、原代及传代培养的步骤。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞来源于骨髓、肌肉和神经中的一种或几种。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述重组间充质干细胞的迁移能力和增殖能力得到提高。