CN107338185A

CN107338185A - 一种细胞或溶液中生物分子的捕获方法

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Publication number: CN107338185A
Application number: CN201710650827.0A
Authority: CN
Inventors: 查梅特·杰罗姆; 颜菁; 鲍尔·沃尔夫冈安德烈斯·克里斯蒂安; 余子夷; 杨洋
Original assignee: Suzhou Bofu Biological Medicine Technology Co Ltd
Current assignee: SUZHOU BOFU BIOLOGICAL MEDICINE TECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2017-08-02
Filing date: 2017-08-02
Publication date: 2017-11-10
Anticipated expiration: 2037-08-02
Also published as: CN107338185B

Abstract

本发明公开了一种细胞或生物分子的捕获方法。该方法包括如下步骤：（I）使含有目标细胞或生物分子的介质进入包括用于捕获所述目标细胞或生物分子的捕获机构的装置中；（II）使介质流经捕获机构，以使目标细胞或生物分子结合至所述捕获结构上；（III）去除没有特异性地结合至所述捕获机构上的不需要的未结合的杂物、细胞或分子；（IV）使目标细胞或生物分子自所述捕获机构脱离；以及（V）收集目标细胞或生物分子。所述捕获机构包括一个或多个层叠的捕获筛，所述捕获筛包括网状基体及形成于所述网状基体上的捕获层，所述捕获层含有能够与所述目标细胞或生物分子特异性结合的捕获物。本发明的方法具有高特异性和高通量，并适于由被细胞表达的分子捕获细胞或捕获溶液中的生物分子，特别适于捕获和分选循环肿瘤细胞。

Description

一种细胞或溶液中生物分子的捕获方法

技术领域

本发明涉及用于通过由细胞表达的生物分子来捕获细胞或捕获溶液中生物分子的装置，特别涉及一种用于通过由目标细胞表达的生物分子来捕获目标细胞（如，循环肿瘤细胞）或捕获溶液中目标生物分子的捕获筛以及具有这种捕获筛的装置。

背景技术

循环肿瘤细胞即血液循环的肿瘤细胞，被认为和肿瘤的远端转移等问题有重大关系。一般癌症患者的10ml血液中仅有1-10个循环肿瘤细胞，其捕获速度慢或特异性差是快速检测病人血样迫切需要解决的难题。

现在的分选方法如传统的免疫磁珠分选法重复性好、灵敏度高、特异性好、可以定量分析循环肿瘤细胞，但是操作速度慢、通量小。膜微孔过滤技术和梯度密度离心法虽然操作简单，分离后细胞活性较好，但特异性低和假阳性率高。微流控技术操作简单、所需抗体量少，但成本较高、假阴性率高。并且微流控技术公司现在主要针对科研客户，需要提前混合多种试剂，过于依赖老式芯片，产业化困难，因此进入体外诊断领域困难。其他的如美国的Cell Search系统灵敏度高、特异性高，但耗血量大、所需抗体量大、成本高，无法实现活细胞捕获，无法对循环肿瘤细胞进行收集再培养，因此只能做DNA测序却不能做RNA测序，不能作为用药指导。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于捕获细胞或溶液中生物分子的方法，其具有高特异性和高通量，并适于由被细胞表达的分子捕获细胞或捕获溶液中的生物分子，特别适于捕获和分选循环肿瘤细胞。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种细胞或溶液中生物分子的捕获方法，包括如下步骤：

（I）使含有目标细胞或生物分子的介质进入包括用于捕获所述目标细胞或生物分子的捕获机构的装置中；

（II）使所述介质流经所述捕获机构，以使所述目标细胞或生物分子结合至所述捕获结构上；

（III）去除没有特异性地结合至所述捕获机构上的不需要的未结合的杂物、细胞或分子；

（IV）使所述目标细胞或生物分子自所述捕获机构脱离；以及

（V）收集所述目标细胞或生物分子；

其中，所述捕获机构包括至少一个捕获筛，所述捕获筛包括网状基体及形成于所述网状基体上的捕获层，所述捕获层含有能够与所述目标细胞或生物分子特异性结合的捕获物。该方法采用一种含有一个或者多个层叠的多孔捕获筛，基于筛网表面的分子特异性识别与筛网的物理空间效应，捕获目标细胞或生物分子。

优选地，步骤（I）中，所述介质通过注射或泵流入所述装置。

优选地，步骤（II）中，使所述介质在流出所述装置之前多次流经所述捕获机构。

更优选地，所述注射或泵的操作方向是可转换的，所述介质先正向流经所述捕获机构，之后再反向流经所述捕获机构。

优选地，步骤（III）中，用纯水或其他温和溶剂冲洗所述捕获机构以去除所述未结合的杂物、细胞或分子。

优选地，步骤（IV）中，注入细胞分离缓冲液使所述细胞或生物分子脱离所述捕获机构。

更优选地，步骤（IV）中，所述细胞分离缓冲液包含胰蛋白酶。

优选地，步骤（V）中，所述目标细胞或生物分子被计数。

更优选地，步骤（V）中，通过采用阻抗测量或其它方法，如光学方法（有或没有荧光标记）的电极来对所述目标细胞或生物分子进行计数。

进一步地，所述装置具有一微流体通道，所述电极设于所述微流体通道内，并且所述目标细胞或生物分子通过所述微流体通道被收集。

优选地，所述生物分子为溶液中的或在细胞表面表达的蛋白质、寡核苷酸（DNA和/或RNA）、酶或它们的任意组合。

更优选地，所述生物分子为循环肿瘤细胞表面的上皮细胞粘附分子，所述目标细胞为循环肿瘤细胞。

更优选地，所述捕获物为能够与被在循环肿瘤细胞表面表达的上皮细胞黏附分子特异性结合的抗-上皮细胞黏附分子抗体。

进一步地，所述抗-上皮细胞黏附分子抗体采用traut’s试剂或带有生物素-亲和素的硫醇盐分子连接至所述网状基体。

优选地，所述捕获物为选自抗体（包括纳米抗体）、寡核苷酸（包括适配子（aptamer））及分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers）中的一种或多种的组合。

更优选地，所述捕获物通过物理吸附和/或化学键结合至所述网状基体上。所述化学键结合通过硫醇盐分子、使用traut’s试剂、盐化作用（silanisation）或点击化学（clickchemistry）实现。

优选地，所述网状基体的尺寸为1-100 mm×1-100 mm，所述筛的孔为2 µm-800 µm。更优选地，所述网状基体的尺寸为2-10 mm×2-10 mm，所述筛的孔为20 µm-100 µm。

优选地，所述网状基体包括：

不锈钢体；以及

形成于所述不锈钢体表面的保护层；

其中，所述保护层由金或其它贵金属或其合金（如AuPd）制成，所述捕获物连接至所述保护层。

更优选地，所述保护层通过物理镀膜（如，磁控溅射）或化学方法沉积形成。

优选地，所述装置包括多个层叠的捕获筛。

优选地，所述装置进一步包括具有入口、第一出口和位于所述入口和所述第一出口之间的腔体的主体，所述捕获机构固定在所述腔体内，所述入口、所述第一出口分别与所述腔体的两端连通；以及

步骤（I）中，使所述介质经由所述入口进入所述装置的腔体内；以及

步骤（III）中，经由所述第一出口去除未结合的杂物、细胞或生物分子。

所述主体优选采用现有的制造技术如注塑成形技术制造。主体的材料应该兼容溶剂。例如，聚醚醚酮满足上述条件。

优选地，步骤（V）中，通过设于所述主体内和所述腔体相通的微流体通道收集所述目标细胞或生物分子。

本发明采用以上方案，相比现有技术具有如下优点：

易于功能化并具有较高的通量；堵塞的风险低；较高的特异性；较高的效率；可在试验后将细胞收集。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是捕获循环肿瘤细胞的流程图；

图2是一种用于捕获循环癌症细胞（简称CTCs）的装置的示意图；

图3是一种带有被捕获的循环肿瘤细胞的捕获筛的示意图；

图4是一种捕获筛的剖视图；

图5示出了一种采用图2所示的装置捕获循环肿瘤细胞的典型流程；

图6a和6b分别为示出了被捕获筛所捕获的两种表达目标捕获分子的循环肿瘤细胞的照片。

上述附图中，

1、主体；10、腔体；101、上腔体；102、下腔体；11、入口；12、第一出口；13、微流体通道；14、第二出口；

2、捕获机构；20、筛；201、不锈钢体；202、保护层；21、抗体；

3、计数机构；30、电极；

4、循环肿瘤细胞；5、血液细胞。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域的技术人员理解。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以互相结合。

本发明提供一种目标细胞或生物分子的捕获方法，其中所述目标生物分子在溶液中或表达在细胞膜的表面。该方法包括如下步骤：

（I）使含有所述目标细胞或生物分子的介质进入包括用于捕获所述目标细胞或生物分子的捕获机构的装置中；

（V）收集所述目标细胞或生物分子。

具体地，步骤（I）中，所述介质通过注射或泵流入所述装置。步骤（II）中，使所述介质在流出所述装置之前多次流经所述捕获机构。更具体地，所述注射或泵的操作方向是可转换的，以使所述介质先正向流经所述捕获机构，之后再反向流经所述捕获机构。步骤（III）中，在纯水或其他温和溶剂中冲洗所述捕获机构以去除所述未结合的杂质、细胞或分子。步骤（IV）中，注入含有胰蛋白酶的细胞分离缓冲液使所述细胞或生物分子脱离所述捕获机构。步骤（V）中，所述目标细胞或生物分子被进一步分析。典型地，所述细胞被计数，之后被收集以用于进一步分析。该方法可以捕获任何目标细胞或生物分子，而且这些分子可以是浮在溶液（生物流体或其它）中或是附接在细胞上（在这种情形下，它将是捕获细胞）。

例如，所述生物分子为循环肿瘤细胞表面的上皮细胞粘附分子，因此该方法用于快速捕获循环肿瘤细胞。如图1所示，步骤（I）中，将未经处理的血液（即，所述含有目标细胞或生物分子的介质）注入包括用于捕获所述目标细胞或生物分子的捕获机构的装置中。步骤（II）使所述未经处理的血液流经所述捕获机构，以使CTCs的上皮细胞粘附分子结合至所述捕获结构上；步骤（III）中，去除可能经非特异性相互作用存在于捕获装置上不需要的杂物、血液细胞或分子或它们的结合；步骤（IV）中，注入细胞分离缓冲液使CTCs自所述捕获机构脱离；步骤（V）中，收集CTCs并计数。

图2-4示出了所述装置并在下面对该装置进行详细描述。

本发明公开的装置依赖于一或多个层叠的捕获筛在结合宏观/微小-流体装置（图2所示）中捕获循环肿瘤细胞（CTCs）。“宏观”部分用于通过增加捕获面积同时减少试验时间来优化捕获。“微小”部分用于检测和收集循环肿瘤细胞。

图2示出了用于捕获循环肿瘤细胞的流体装置的一个实施例。该装置包括：

内部具有一个腔体10的主体1，并具有一个入口11和一个第一出口12以及一个第二出口14；

捕获机构2，包括至少一个捕获筛20；以及

计数机构；

其中，主体1采用现有制造技术如注塑成形技术制造。主体的材料也应该为可兼容溶剂的材料。例如，PEEK（聚醚醚酮，polyetheretherketone）可满足所有条件。优选地，主体1采用注塑成形法制造而形成所述腔体10。捕获机构2设于腔体10内。入口11和第一出口12分别位于腔体的相对两端，捕获机构2设于腔体10中并位于入口11和第一出口12之间。更具体地，入口11开设于主体的1上表面，第一出口开设于主体1的下表面，也就是说，入口11高于捕获机构2而第一出口12低于捕获机构2。腔体10被捕获机构2分隔为两个部分，即上腔体101（第一腔体）和下腔体102（第二腔体）。上腔体101和下腔体102都大致为长方体形，且上腔体101的沿水平方向的截面（具体指面积）大于下腔体102的沿水平方向的截面。捕获机构2包括一个或多个层叠的捕获筛20，捕获筛20包括网状基体及形成于网状基体上的捕获层，捕获层含有能够与目标细胞或生物分子特异性结合的捕获物。捕获机构2的捕获筛20被制备为具有捕获物，该捕获物可采用任何基于亲和性的技术特异性地和目标细胞或溶液中的被细胞表达的分子或被表达在细胞膜表面上分子。介质中，尤其是溶液（如未经处理的血液）中的目标细胞或生物分子可经由入口被导至上腔体101，之后流经捕获结构2到达下腔体102中，并且最后经由第一出口12流出主体1。在这个过程中，目标细胞或生物分子被捕获机构2捕获，而血液的其它部分通过捕获机构2而不被捕获。捕获筛的优点是高的表面积-体积比，允许大量样品的处理同时又降低了堵塞风险。结合特异性抗体技术设计出了抗体捕获筛，利用抗原表位筛选，保证了高敏感性、特异性、细胞活性。一旦目标细胞或生物分子被捕获，它们可被释放（如，化学、热力学、电学方法），以用于进一步分析。典型地，所述细胞被计数，且之后被收集用于进一步分析。捕获机构2可包括多个层叠的捕获筛20，可以是直接相叠在一起或相邻两层之间具有间隔。

在一种实施方式中，如图3所示，可捕获循环肿瘤细胞表面的分子的抗体21被连接至每个筛20。优选地，抗体21为抗-上皮细胞粘附分子抗体（anti - epithelial celladhesion molecule antibodies，简称anti-EpCAM）。抗-上皮细胞粘附分子抗体可与分子，特别是循环肿瘤细胞的上皮细胞粘附分子(EpCAM)特异性结合，如此表达的循环肿瘤细胞可被捕获。从如2可以看出，循环肿瘤细胞4被结合至筛20上的抗体21上，而其他血液细胞5则不受筛20影响。

筛20的材料可以选择金或其它贵金属以及包覆有金或其它贵金属的不锈钢。优选地，如图4所示，捕获筛包括：不锈钢体201和设于不锈钢体201上的保护层202。

保护层202的材料为金或金合金（如，AuPd），并且抗体21连接在保护层202上。保护层202为采用磁控溅射或电化学方法沉积在不锈钢体201上的AuPd层。抗-上皮细胞粘附分子抗体通过traut’s试剂（特劳特的试剂）连接在筛20上，带有生物素-亲和素的硫醇盐分子可替换traut’s试剂。

微流体通道13也设于主体1内，其与腔体10的下腔体连通，被筛20捕获的循环肿瘤细胞可在被细胞分离缓冲液从筛20上分离后通过微流体通道13被收集。所述计数机构3设于微流体通道13内以对捕获的循环肿瘤细胞进行计数。计数机构3包括阻抗测量电极30。第二出口14开设于主体1的上表面，和微流体通道13连通，用于供捕获的循环肿瘤细胞流出主体1。

如图5所示，步骤（I）中，采用泵将未经处理的血液经由入口11注入腔体10内；

步骤（II）中，将未经处理的血液泵下去以通过捕获筛20，以使CTCs结合在捕获筛20上，转换泵的操作方向使血液多次通过捕获筛20，来提高结合率，同时废血经由第一出口12流出；

步骤（III）中，用水或其它温和溶剂冲洗捕获筛20来经由第一出口12去除所有未结合的杂物、细胞或分子；

步骤（IV）中，关闭第一出口12并注入细胞分离缓冲液（如含有胰蛋白酶的缓冲液），以使被筛20捕获的CTCs自筛20脱离；以及

在步骤（V）中，通过微流体通道13收集CTCs，并通过设于微流体通道内的阻抗测量电极来对流经的CTCs进行计数。计数后，所述CTCs经由第二出口14流出。

示例1

在此，给出了一种用于分选CTCs的所述捕获筛的制备方法。该制备方法包括：

（I）筛的选择；

金筛：选择金筛的孔（如，64 µm或40 µm）以最大化和肿瘤细胞的接触时间，同时预防堵塞风险。在一下试验中所用金筛的尺寸为2×2mm²。根据具体操作优选较大的尺寸。

不锈钢和金筛：选择51µm孔并且采用磁控溅射包覆AuPd。这种筛更便宜且比金的机械强度高，因此这种筛更适于集成在装置中。

（II）预功能化；

在功能化之前采用了多种清洗方法来制备筛，包括高压蒸汽灭菌法、氧等离子清洗以及在多种溶液中超声清洗，包括食人鱼溶液（piranha solutions）。例如，用于64μm的金筛的最好结果包括在洗涤剂中超声处理15分钟，冲洗，在70%乙醇溶液中超声处理15分钟，冲洗，高纯水5分钟。采用更其它容积（如，食人鱼溶液）可缩短处理时间。

（III）抗体；

典型地，取10µl抗体并冷冻，其后用其制备反应混合物（即，抗体+具有EDTA的PBS），足够2 × 50 µl（50µl是浸没2 mm²的金筛的最小体积）。

（IV）Traut’s试剂；

购买后迅速冷冻。Traut’s试剂和抗体的比例为4:1。其它方法，包括带有生物素-亲和素的硫醇盐分子可替代Traut’s试剂来连接至筛以形成所述捕获筛。

（V）具有抗体的Traut’s试剂的孵育时间；

最佳反应时间为1小时。在合适的条件下该时间可被缩短。

（VI）具有筛的上述溶液的孵育；

试验了不同孵育时间（10分钟至12小时之间）和不同条件（4℃、室温以及37℃）。最好为室温下1小时（在更长的孵育时间是可观察到小的改善但不是很有意义）。

示例2

进行了试验来证实筛捕获由肿瘤细胞表达的EpCAM的效率。在该情形下，筛孔为51μm。

细胞选择——对EpCAM蛋白具有高表达水平的细胞（如CaCo2和MCF7细胞）被使用。

细胞生长——在37℃的DMEM缓冲液中生长。

细胞制备和筛的孵育——CaCo2和MCF7细胞分化成1:2。试验在一个旋转的37℃的加热盘上进行。分离后，细胞在DMEM缓冲液中稀释1:10，0.5ml用于孵育所述捕获筛，孵育时间为1小时。

非特异性结合的细胞的冲洗，所述筛采用纯水冲洗，在纯水溶液中孵育2分钟，然后在显微观察之前再次冲洗。

采用显微镜评价被捕获的细胞：显微镜拍摄筛的照片（图5a和5b）。图5a示出了在孵育1小时后被捕获在捕获筛上的表达目标捕获分子的CaCo2细胞，图5b在孵育1小时后被捕获在捕获筛上的表达目标捕获分子的MCF7细胞。从图5a和5b可以看出，由于细胞的EpCAM和筛上的抗-EpCAM抗体的结合，多个CaCo2和MCF7细胞被所述筛捕获，与此同时，筛没有被堵塞。应当注意的是，根据本发明的所述装置和所述方法可用于捕获不同浓度溶液中的目标生物分子。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，是一种优选的实施例，其目的在于熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限定本发明的保护范围。凡根据本发明的原理所作的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种细胞或溶液中生物分子的捕获方法，其特征在于，包括如下步骤：

（III）去除没有特异性地结合至所述捕获机构上的不需要的未结合的杂物、细胞或生物分子；

（V）收集所述目标细胞或生物分子；

其中，所述捕获机构包括一个或多个层叠的捕获筛，所述捕获筛包括网状基体及形成于所述网状基体上的捕获层，所述捕获层含有能够与所述目标细胞或生物分子特异性结合的捕获物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤（I）中，所述介质通过注射或泵流入所述装置；

和/或，步骤（II）中，使所述介质在流出所述装置之前多次流经所述捕获机构；

和/或，步骤（III）中，用纯水或其他温和溶剂冲洗所述捕获机构以去除所述未结合的杂物、细胞或分子；

和/或，步骤（IV）中，注入细胞分离缓冲液使所述目标细胞或生物分子脱离所述捕获机构；

和/或，步骤（V）中，所述目标细胞或生物分子被计数。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（II）中，所述注射或泵的操作方向是可转换的，所述介质先正向流经所述捕获机构，之后再反向流经所述捕获机构。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（IV）中，注入含有胰蛋白酶的细胞分离缓冲液使所述细胞或生物分子脱离所述捕获机构。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（V）中，通过采用阻抗测量或光学方法的电极来对所述目标细胞或生物分子进行计数，所述装置具有一微流体通道，所述电极设于所述微流体通道内，并且所述目标细胞或生物分子通过所述微流体通道被收集。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述生物分子为溶液中的或在细胞表面表达的蛋白质、寡核苷酸、酶或它们的任意组合；所述捕获物为选自抗体、寡核苷酸及分子印迹聚合物中的一种或多种的组合；所述捕获物通过物理吸附和/或化学键结合至所述网状基体上。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物分子为循环肿瘤细胞表面的上皮细胞粘附分子，所述目标细胞为循环肿瘤细胞，所述捕获物为能够与被在循环肿瘤细胞表面表达的上皮细胞黏附分子特异性结合的抗-上皮细胞黏附分子抗体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，通过采用traut’s试剂或带有生物素-亲和素的硫醇盐分子将所述抗-上皮细胞黏附分子抗体连接至所述网状基体上。

9.根据权利要求1、7或8所述的方法，其特征在于，所述网状基体包括：

不锈钢体；以及

形成于所述不锈钢体表面的保护层；

其中，所述保护层由贵金属或其合金制成，所述捕获物连接至所述保护层。

10.根据权利要求1、7或8所述的方法，其特征在于，所述网状基体的尺寸为1-100 mm×1-100 mm，所述筛的孔为2 µm-800 µm，所述装置进一步包括具有入口、第一出口和位于所述入口和所述第一出口之间的腔体的主体，所述捕获机构固定在所述腔体内，所述入口、所述第一出口分别与所述腔体的两端连通；以及

步骤（III）中，经由所述第一出口去除未结合的杂物、细胞或分子。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述网状基体的尺寸为2-10 mm×2-10mm，所述筛的孔为20 µm-100 µm。