CN107312774A - 核酸的分离 - Google Patents

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Abstract

本文提供了与分离核酸相关的技术。具体地，所述技术涉及从成问题的样品例如粪便提取核酸的方法和试剂盒。

Description

核酸的分离
本申请是基于申请日为2012年5月11日，优先权日为2011年5月12日，申请号为201280034773.0(PCT/US2012/037581)，发明名称为：“核酸的分离”的专利申请的分案申请。
本发明要求美国临时专利申请序列号61/485,214、61/485,338、61/485,386、和61/485,448的权益，其每一项均于2011年5月12日提交，并且其每一项通过引用整体并入本文。
领域
本文提供了与分离核酸相关的技术。具体地，本技术涉及从成问题的样品例如粪便提取核酸的方法和试剂盒。
发明背景
从样品分离特定的靶核酸是许多医学诊断测定中的重要步骤。例如，已知基因中的某些突变和甲基化状态是与疾病相关、伴随或预兆性的。可从样品中回收包含这些基因的DNA并且测试具体突变和甲基化状态的存在。
实际上，这些测定需要从样品分离并测定若干基因靶。对于许多检测方法来说，检测单个基因中的罕有突变或甲基化状态需要分离并且测试大量的DNA。这一问题在测定一组基因时被加剧，所述基因中的每一个必须大量存在以用于稳健的诊断测试。因此，为了检测多个基因中的罕见突变和甲基化事件，所分离的DNA必须被高度浓缩并且组成检测测定的很大部分。
然而，这一需求带来了许多问题。例如，制备这样的量和浓度的DNA需要大的样品作为投入物(例如具有几克例如大约2-4克的质量)以提供足够核酸用于检测并且因此需要可从大的样品制备DNA的方法。此外，测定抑制剂常常随着DNA制品一起被分离和浓缩。因此，通过常规方法生产的浓缩的DNA制品同样常常保留不可接受的浓度的抑制剂，其之后被引入随后的测定中。而且，如果在大批的非选择性的DNA制品中同时提取组中的所有靶，那么测定的敏感度受损，因为当制品被分为等份用于测试时测定中存在是较少的从组中任一种基因提取的DNA。如果另一方面，组中的所有成员被一起提取和测试并且由此存在于同一测定混合物中，那么检测任一种单个的特定靶的敏感度因非靶DNA分子的存在而受损。
此外，如果复杂的样品中存在特定的诊断靶，那么它将以相对于样品中其他材料—核酸和非核酸两种—相对小的量存在，因此为设计用于检测其的分析方法带来了挑战。例如，来自粪便样品的DNA的分析因细菌构成了粪的大约60％的干重而其余的大部分是作为食物被受试者消化的植物和动物物质的残留的事实而变得复杂。像这样，仅是从消化道的内膜蜕化的那些的人类受试者的细胞是粪便中非常小的部分并且存在大量来自其他材料的核酸。而且，在检测指示直肠癌的基因修饰的测定中，来源于直肠中可能存在的肿瘤的细胞将仅占从消化道内膜蜕化的人类受试者消化道细胞的一小部分。因此，癌细胞(和它们包含的DNA)构成极小量的粪便质量。这样的样品同样常常是非常粘性的，其在核酸的样品制备和分离上存在问题。
从样品分离DNA的常规方法和试剂盒通常从样品制备总DNA(例如通过非特异性的制备方法)。对于复杂的样品例如粪便样品来说，这是常规方法特有的缺点，因为从粪便样品分离的总DNA包含伴随来自受试者的DNA一起的来自消化道常驻细菌(以及存在的任何病毒、真核生物以及古生菌)的DNA。而且，常规方法和试剂盒主要设计用于从小样品例如具有少于1克诸如50至200毫克的质量的样品制备DNA，将来自复杂样品的靶核酸的产量限制在非常小的量。另外的缺点是大多数常规技术并不有效地去除抑制剂并且常常需要长的加工步骤，例如孵育。因此，常规方法不适于高敏感度和高特异性的多个基因组分析，因为它们不能从大的样品例如几克的粪便样品制备足够量的高度浓缩的无抑制剂的DNA。使用用常规方法制备的DNA的测定将不能提供可以检测罕有的突变或甲基化事件所需要的敏感度阈值测定的样品。使用常规方法或试剂盒获取获得这样的敏感度所需的起始质量需要除了额外的纯化步骤之外的多重DNA提取(例如使用多重试剂盒)以去除抑制剂。因此，所需要的是从样品制备一组基因的每个成员的浓缩的无抑制剂的DNA以便在诊断测定中使用。
概述
本文提供的是与分离核酸有关的技术。具体地，所述技术涉及用于从粪便样本中脱落的肠道细胞提取并且纯化核酸以便用于定量和敏感的测定。所述技术具体为使用抑制剂去除步骤从粪便纯化特定DNA以及从粪便上清液直接捕获DNA或这些步骤的组合的新方法。所述技术进一步提供了适于与复杂并且粘性的样品例如粪便样品一起使用的过滤设备。因此，本文提供的是从样品分离靶核酸的方法，所述方法包括从样品去除测定抑制剂，如果存在的话，以产生澄清的样品；用捕获试剂从澄清的样品捕获靶核酸，如果存在的话，以形成捕获复合物；从澄清的样品分离捕获复合物；并且从核酸溶液中的捕获复合物回收靶核酸，如果存在的话。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在捕获步骤之后保留澄清的样品；和使用所保留的澄清的样品和第二捕获试剂重复分离和回收步骤。
在一些实施方案中，除去抑制剂包括将样品匀浆化以产生匀浆；将匀浆离心以产生上清液；用抑制剂吸收组合物处理上清液以结合抑制剂复合物中的抑制剂，如果存在的话；以及从上清液分离抑制剂复合物以产生澄清的样品。一些实施方案中的抑制剂吸收组合物是聚乙烯吡咯烷酮，在一些实施方案中，聚乙烯吡咯烷酮是不溶的而在一些实施方案中，聚乙烯吡咯烷酮是聚乙烯聚吡咯烷酮(polyvinylpolypyrrolidone)。通过以预量过的形式提供聚乙烯吡咯烷酮在一些实施方案中是有用的，例如在一些实施方案中聚乙烯吡咯烷酮作为片剂提供。各种技术被用于从样品分离抑制剂复合物。例如，在一些实施方案中，分离抑制剂复合物包括离心以从上清液分离抑制剂复合物。
在一些实施方案中，离心包括通过旋转离心柱离心。因此，在一些实施方案中，本文提供了涉及过滤以及特别但不排他地涉及过滤器和通过离心的方式过滤的方法。特别地，本文提供的技术的一些实施方案通过提供其中旋转过滤器的底部末端和主体都从多孔的或可透过的材料制得的技术解决了旋转过滤器堵塞的问题。也就是说，旋转过滤器的壁是由与用于常规设计中底部末端的过滤设备的相同或相似的材料制成。如此，当过滤器的底部部分在过滤过程中开始堵塞时，壁提供了可从其过滤样品的另外的表面。
本文中这一技术被提供为包含中空主体、底部末端和与底部末端相对的开放的顶部末端的旋转过滤器，其中所述中空主体由多孔的过滤材料制得。在一些实施方案中，所述底部末端从多孔的过滤材料制得。旋转过滤器的中空主体和底部末端呈现适于使用过滤器的过滤应用的任何形状。例如，在一些实施方案中，中空主体是管状，而在一些实施方案中，底部末端是半球形。在其他实施方案中，底部末端是盘形、锥形、或椭圆体的一部分。而且，旋转过滤器从适于过滤样品的任意材料制得。因此，在一些实施方案中，多孔过滤材料是聚乙烯。样品包含不同尺寸的颗粒、物质、沉淀物等，其将通过过滤被除去。因此，可选择过滤材料以具有提供所期望的分离的物理特性。例如，在一些实施方案中，多孔过滤材料具有20微米的标称孔径。在一些实施方案中，过滤器的使用产生了使用者为另外的加工保留的滤液。如此，一些实施方案提供包含如所描述的旋转过滤器的旋转过滤器组件和适合容纳旋转过滤器并收集滤液的收集容器。
本文还提供了从样品产生滤液的方法，包括将有待过滤的样品放置在旋转过滤器中并且离心旋转过滤器，其中在过滤期间，样品的一部分经过所述旋转过滤器的多孔的过滤材料以产生滤液。
所述技术可以作为用于样品分离的试剂盒提供。这些试剂盒的实施方案包括如所描述的旋转过滤器和使用说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括收集容器。在一些实施方案中，包含旋转过滤器的试剂盒进一步包含用于样品制备例如用于抑制剂去除和/或靶核酸分离的另外的试剂和材料。
在一些实施方案中，所述技术的方法和系统包括捕获核酸靶。捕获靶核酸，在一些实施方案中，包括将样品例如澄清的样品制品暴露于变性条件产生变性的样品；并且将变性样品中的靶核酸与捕获试剂结合以形成捕获复合物。许多处理和条件在将大分子例如DNA变性中有用。例如，在一些实施方案中，变性条件包括加热，例如在一些实施方案中，变性条件包括在90℃加热。补充有待变性的样品有利于变性；因此，在一些实施方案中，澄清的样品进一步包括变性剂。在某些优选的实施方案中，变性剂包括异硫氰酸胍。而且，在一些实施方案种，捕获试剂包括与靶核酸的至少一部分互补的寡核苷酸。在一些优选的实施方案中，捕获试剂包含颗粒例如磁性颗粒。寡核苷酸，在所述技术的一些实施方案中，与靶核苷酸的至少一部分杂交，并且因此在一些实施方案中，结合步骤包括将寡核苷酸和靶核酸杂交。将捕获试剂(例如捕获试剂/靶核酸复合物)分离在某些实施方案中通过将捕获试剂暴露于磁场来完成；也就是说，在本文提供的一些实施方案中，分离步骤包括将捕获复合物暴露于磁场并且在一些实施方案中将捕获复合物暴露于磁场将靶核酸定域化。磁场通过适用于本方法的任何磁体或磁性设备产生。例如，在一些实施方案中，分离步骤包括将样品放在通过以北极靠近样品定向的第一磁体和以南极靠近样品定向的第二磁体所产生的磁场中；并且等待足够长的时间以允许磁场将磁性颗粒移动至所期望的位置。用于产生强磁场的设备描述于例如美国专利申请序列号13/089,116中，其通过引用并入本文。
所述技术提供用于从捕获试剂回收靶核酸。在一些实施方案中，回收靶核酸包括从捕获复合物洗脱靶核酸，例如在一些实施方案中，通过加热。在一些实施方案中，从捕获复合物洗脱靶核酸包括将捕获复合物暴露于高pH，例如在一些实施方案中，通过加入氢氧化钠溶液。
在一些实施方案中，所述技术提供从单个样品例如粪便样品捕获多种核酸的方法、系统和试剂盒。例如，本文提供的是从粪便样品分离核酸的方法，包括将粪便样品与靶特异性捕获试剂接触；将靶核酸，当存在时，与靶特异性试剂结合以形成复合物；将包含靶特异性捕获试剂和靶核酸的复合物，当存在时，从粪便样品分离；将靶核酸，当存在时，从复合物洗脱以产生包含靶核酸，当存在时，的靶核酸溶液；并且重复使用不同的靶特异性捕获试剂的所述方法。所述方法适用于大样品，例如具有至少4克的质量。而且，每个洗脱的靶核酸都是充分纯化、充分浓缩并且充分不含抑制剂的以致每种洗脱的靶核酸，当存在时，在靶核酸溶液占到定量PCR体积的大约三分之一时通过定量PCR检测。
在所提供的方法的一些实施方案中，靶核酸是人类靶核酸。在另外的实施方案中，靶核酸是DNA。当不限于将核酸从粪便样品分离的方式时，在一些实施方案中，靶特异性捕获试剂是序列特异性核酸捕获试剂。在一些实施方案中，序列特异性核酸捕获试剂是寡核苷酸，而在一些实施方案中寡核苷酸与磁性或顺磁性颗粒共价连接。一些实施方案给出磁体被用于分离步骤，而一些实施方案给出在单个分离步骤中使用多个靶特异性捕获试剂同时分离多于一种靶。
所述方法不限于被加工的样品的类型。例如，在一些实施方案中，样品是粘性样品，例如在一些实施方案中具有高于十厘泊的粘度，在一些实施方案中具有高于二十厘泊的粘度。此外，样品具有各种各样的尺寸。所述方法被用于加工具有，在一些实施方案中，多于一克的质量的样品，而在一些实施方案中，样品具有多于五克的质量。
本文提供的技术涉及从样品除去抑制剂至低于抑制测定的量。因此，在一些实施方案中，该方法给出核酸溶液包含第一量的测定抑制剂，其少于第二量的测定抑制剂，其中第二量的测定抑制剂在将五微升的核酸溶液用于具有二十五微升体积的PCR中时抑制PCR。在一些实施方案中，核酸溶液包含少于第二量的测定抑制剂的第一量的测定抑制剂，其中第二量的测定抑制剂在将一微升核酸溶液用于具有二十五微升体积的PCR中时抑制PCR。
所述技术涉及医学分子诊断，其中对生物物质(例如分子)的状态、存在、量、序列等的质询被用于辅助医学评估。因此，在一些实施方案中，靶核酸与选自由结肠癌和腺瘤组成的组的疾病状态有关联。
本文描述的技术在一些实施方案中以试剂盒的形式提供—例如，实施方案给出所述技术是用于从样品分离靶核酸的试剂盒，其包括包含与磁性颗粒共价连接的寡核苷酸的捕获试剂、产生磁场的装置、聚乙烯吡咯烷酮和使用说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含匀浆溶液。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含洗脱溶液，而一些实施方案中试剂盒进一步包含异硫氰酸胍。在一些实施方案中，通常聚乙烯吡咯烷酮以预量过的形式存在。例如，聚乙烯吡咯烷酮在一些实施方案中以片剂或胶囊的提供。试剂盒的一些实施方案提供用于除去聚乙烯吡咯烷酮的旋转过滤器。
在一些实施方案中，使用磁场分离靶核酸。如此，本文描述的试剂盒的实施方案提供了产生磁场的装置。用于产生适于与本文提供的技术的实施方案一起使用的磁场的一种设备是两个磁体或成套的磁体并且将第一磁体或成套磁体的北极放置靠近样品而将第二磁体或成套磁体的南极靠近样品。在一些实施方案中，试剂盒进一步提供用于收集样品的设备，例如具有主体和与主体连接的可拆卸的样品小容器的设备，其中可拆卸的样品小容器包括适于装入样品的样品收集空间(例如如美国专利申请序列号61/476,707中所描述的)。
在一些实施方案中，试剂盒提供用于加工样品并且容纳用于加工样品或者从加工样品获得的各种组合物的容器。例如，在一些实施方案中，试剂盒进一步包括其中容纳样品的容器，而在一些实施方案中试剂盒进一步包括其中容纳所分离的靶核酸的容器。试剂盒，在一些实施方案中，在除了样品被加工和/或分析物被测定的位点之外的位点使用。因此，在一些实施方案中，试剂盒进一步包括运送容器。
本文提供的技术在从样品制备核酸的系统中有用。在一些实施方案中，系统包含用于从样品除去抑制剂的聚乙烯吡咯烷酮、用于从样品捕获靶核酸的试剂和产生磁场的功能。在一些实施方案中，所述系统进一步包括用于收集样品的功能，而在一些实施方案中所述系统进一步包括用于运送核酸溶液的功能。
基于本文所包含的教导，另外的实施方案对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
本发明涉及如下项：
1.一种旋转过滤器，其包括：
a)中空主体；
b)底部末端；和
c)与所述底部末端相对的开放的顶部末端，
其中所述中空主体由多孔的过滤材料制得。
2.如项1所述的旋转过滤器，其中所述底部末端由多孔的过滤材料制得。
3.如项1所述的旋转过滤器，其中所述多孔的过滤材料是聚乙烯。
4.如项1所述的旋转过滤器，其中所述多孔的过滤材料具有20微米的标称孔径。
5.如项1所述的旋转过滤器，其中所述底部末端具有选自由半球形、盘形、锥形或椭圆体的一部分组成的组的形状。
6.一种旋转过滤器组件，其包含如项1所述的旋转过滤器和适合容纳所述旋转过滤器的收集容器。
7.一种从样品产生滤液的方法，所述方法包括：
a)将有待过滤的样品放置在根据项1所述的旋转过滤器中；并且
b)离心所述旋转过滤器，
其中在所述过滤期间，所述样品的一部分经过所述旋转过滤器的多孔的过滤材料以产生滤液。
8.一种从包含核酸的粗制样品制品除去测定抑制剂的方法，所述方法包括：
a)在分离所述核酸之前将不溶的聚乙烯吡咯烷酮在所述测定抑制剂与所述聚乙烯吡咯烷酮结合产生复合物的条件下加至所述粗制的样品制品；
b)将所述复合物从所述粗制样品制品分离以产生含有所述核酸的澄清的样品制品。
9.如项8所述的方法，其中所述粗制样品制品是从粪便样品制备的上清液。
10.如项9所述的方法，其中所述粪便样品具有至少4克的质量。
11.如项9所述的方法，其中所述粪便样品具有至少8克的质量。
12.如项8所述的方法，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是聚乙烯聚吡咯烷酮。
13.如项8所述的方法，其中所述分离包括离心。
14.如项8所述的方法，其中所述澄清的样品制品是根据项7生产的。
15.如项8所述的方法，其中所述聚乙烯吡咯烷酮包含具有约100微米至约130微米的平均直径的颗粒。
16.一种用于从包含核酸的粗制样品制品除去测定抑制剂的系统，所述系统包括：
a)用于结合所述测定抑制剂并且产生复合物的不溶的聚乙烯吡咯烷酮；
b)将所述复合物从所述粗制样品制品分离以产生包含所述核酸的澄清的样品制品的功能性；和
c)保留包含所述核酸的澄清的样品制品的功能性。
17.如项16所述的系统，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是聚乙烯聚吡咯烷酮。
18.如项16所述的系统，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是预量形式的。
19.如项16所述的系统，其中所述聚乙烯吡咯烷酮作为片剂提供。
20.如项16所述的系统，其中所述分离所述复合物的功能性包括根据项1-5中任一项所述的旋转过滤器。
21.如项16所述的系统，其中所述保留包含所述核酸的澄清的样品制品的功能性是根据项6所述的收集容器。
22.一种从粪便样品分离许多不同靶核酸的方法，所述方法包括：
a)将包含多个不同靶核酸的粪便样品制品与第一靶特异性捕获试剂在第一靶核酸与所述第一靶特异性捕获试剂结合形成第一复合物的条件下接触；
b)将所述第一复合物从所述粪便样品分离以产生第一残留粪便样品制品；
c)将所述第一残留粪便样品制品与第二靶特异性捕获试剂在第二靶核酸与所述第二靶特异性捕获试剂结合形成第二复合物的条件下接触；
d)将所述第二复合物从所述第一残留粪便样品分离以产生第二残留粪便样品制品；
e)将所述第一靶核酸从所述第一复合物洗脱以产生第一靶核酸溶液；和
f)将所述第二靶核酸从所述第二复合物洗脱以产生第二靶核酸溶液。
23.如项22所述的方法，其中所述粪便样品制品是根据项8、9、10、11、12、13、14或15生产的澄清的样品制品。
24.如项22所述的方法，其中所述第一靶核酸和/或第二核酸是人类核酸。
25.如项22所述的方法，其中所述第一靶核酸和/或第二靶核酸是DNA。
26.如项22所述的方法，其还包括下列步骤：
g)将所述第二残留粪便样品制品与第三靶特异性捕获试剂在第三靶核酸与所述第三靶特异性捕获试剂结合形成第三复合物的条件下接触；
h)将所述第三复合物从所述第二残留粪便样品分离以产生第三残留粪便样品制品；和
i)将所述第三靶核酸从所述第三复合物洗脱以产生第三靶核酸溶液；
27.如项22所述的方法，其中所述第一靶特异性捕获试剂和/或所述第二靶特异性捕获试剂包含寡核苷酸。
28.如项27所述的方法，其中所述寡核苷酸与表面共价连接。
29.如项28所述的方法，其中所述表面是磁性颗粒或顺磁性颗粒。
30.如项29所述的方法，其中所述分离所述第一复合物和/或所述分离所述第二复合物包括将所述第一复合物和/或所述第二复合物暴露于磁体。
31.如项22所述的方法，其中所述粪便样品制品包含异硫氰酸胍。
32.如项31所述的方法，其还包括在所述接触步骤a和c之前将所述粪便样品制品暴露于将核酸变性的条件下的步骤。
33.如项32所述的方法，其中所述将核酸变性的条件包括在90℃加热至少10分钟。
34.如项26所述的方法，其还包括下列步骤：
j)将第n残留粪便样品制品与第n+1靶特异性捕获试剂在第n+1靶核酸与所述第n+1靶特异性捕获试剂结合形成第n+1复合物的条件下接触；
k)将所述第n+1复合物从所述第n残留粪便样品分离以产生第n+1残留粪便样品制品；
l)将所述第n+1靶核酸从所述第n+1复合物洗脱以产生第n+1靶核酸溶液，
其中n大于或等于3。
35.如项22、26或34中任一项所述的方法，其中所述接触步骤a、c和/或j包括将与所述第一靶特异性捕获试剂、所述第二靶特异性捕获试剂和/或所述第n+1靶特异性捕获试剂接触的所述粪便样品制品、所述第一残留粪便样品制品和/或所述第n残留粪便样品制品于室温孵育1小时。
36.一种从人类粪便样品分离靶人类DNA的方法，所述方法包括：
a)从人类受试者获得具有至少4克质量的粪便样品；
b)将所述粪便样品在匀浆缓冲液中匀浆化以产生匀浆化的粪便样品；
c)从所述匀浆化的粪便样品制备粪便上清液；
d)用PVP处理所述粪便上清液以产生澄清的粪便上清液；
e)将异硫氰酸胍加至10毫升的澄清的粪便上清液以产生含有2-3M异硫氰酸胍的样品溶液；
f)将所述样品溶液加热至90℃持续10分钟；
g)向所述样品溶液加入含有与磁性颗粒共价连接的寡核苷酸的靶特异性捕获试剂，其中所述寡核苷酸与所述靶人类DNA的至少一部分互补；
h)将所述样品溶液与所述靶特异性捕获试剂于室温孵育约1小时以产生包含所述靶特异性捕获试剂和所述靶人类DNA的复合物；
i)将包含所述复合物的所述样品溶液暴露于磁场以将所述复合物与所述样品溶液分离并且保留所述样品溶液；
j)将所述靶人类DNA从所述复合物洗脱以产生包含所述靶核酸，当存在时，的靶核酸溶液；
k)在每一步骤g中使用不同的靶特异性捕获试剂来重复所述方法的步骤f-j以在每一步骤j中产生不同的靶核酸溶液；和
l)在每个不同的靶核酸溶液上进行核酸检测反应，其中每个所述核酸检测反应的体积的至少三分之一来自所述靶核酸溶液。
37.如项36所述的方法，其中所述靶人类DNA来自与选自由结肠直肠癌和结肠直肠腺瘤组成的组的疾病状态相关的基因。
38.如项36所述的方法，其中进行所述重复步骤k)n次以产生n+1种不同的靶核酸溶液。
39.如项38所述的方法，其中n至少为3。
40.一种从样品分离靶核酸的方法，所述方法包括：
a)从所述样品除去测定抑制剂以产生澄清的样品制品；
b)靶特异性捕获试剂从所述澄清的样品制品捕获所述靶核酸以形成捕获复合物；
c)从所述澄清的样品制品分离所述捕获复合物；和
d)从核酸溶液中的所述捕获复合物回收所述靶核酸。
41.如项40所述的方法，其还包括：
e)在所述分离步骤之后保留残留的澄清样品制品；
f)使用所述残留的澄清样品和第二捕获试剂重复所述捕获、分离和回收步骤。
42.如项40所述的方法，其中从所述样品除去所述测定抑制剂包括：
a1)将所述样品匀浆化以产生匀浆；
a2)离心所述匀浆以产生上清液；
a3)用抑制剂吸收组合物处理所述上清液以结合抑制剂复合物中的抑制剂，如果存在的话；和
a4)从所述上清液分离所述抑制剂复合物以产生澄清的样品制品。
43.如项42所述的方法，其中所述抑制剂吸收组合物是聚乙烯吡咯烷酮。
44.如项43所述的方法，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是不溶的。
45.如项43所述的方法，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是聚乙烯聚吡咯烷酮。
46.如项43所述的方法，其中所述聚乙烯吡咯烷酮以预量的形式提供。
47.如项43所述的方法，其中所述聚乙烯吡咯烷酮作为片剂提供。
48.如项42所述的方法，其中分离所述抑制剂复合物包括离心以将所述抑制剂复合物从所述上清液分离。
49.如项48所述的方法，其中所述离心包括通过项1-5中任一项所述的旋转过滤器离心。
50.如项40所述的方法，其中捕获所述靶核酸包括：
b1)将所述澄清的样品制品暴露于变性条件以产生变性的样品；和
b2)将所述靶核酸与靶特异性捕获试剂结合以形成捕获复合物。
51.如项50所述的方法，其中所述变性条件包括加热。
52.如项50所述的方法，其中所述变性条件包括在90℃加热。
53.如项50所述的方法，其中所述将所述澄清的样品制品暴露于变性条件包括向所述澄清的样品制品加入变性剂。
54.如项53所述的方法，其中所述变性剂包括异硫氰酸胍。
55.如项50所述的方法，其中所述靶特异性捕获试剂包括与所述靶核酸的至少一部分互补的寡核苷酸。
56.如项50所述的方法，其中所述靶特异性捕获试剂包含磁性颗粒。
57.如项55所述的方法，其中所述结合包括将所述寡核苷酸与所述靶核酸杂交。
58.如项56所述的方法，其中所述分离步骤包括将所述捕获复合物暴露于磁场。
59.如项56所述的方法，其中所述分离步骤包括：
c1)将所述澄清的样品制品放置在由以其北极靠近所述样品定向的第一磁体和以其南极靠近所述样品定向的第二磁体产生的磁场中；和
c2)将所述磁体颗粒移至所期望的定位。
60.如项40所述的方法，其中回收所述靶核酸包括将所述靶核酸从所述捕获复合物洗脱。
61.如项60所述的方法，其中洗脱包括加热。
62.如项40所述的方法，其中所述样品是粘性样品。
63.如项40所述的方法，其中所述样品是粪便样品。
64.如项40所述的方法，其中所述样品具有多于一克的质量。
65.如项40所述的方法，其中所述样品具有多于五克的质量。
66.如项40所述的方法，其中所述样品具有大于十厘泊的粘性。
67.如项40所述的方法，其中所述样品具有大于二十厘泊的粘性。
68.如项40所述的方法，其中所述核酸溶液包含少于第二量的所述测定抑制剂的第一量的所述测定抑制剂，其中所述第二量的所述测定抑制剂在将五微升所述核酸溶液用于具有二十五微升体积的PCR时抑制PCR。
69.如项40所述的方法，其中所述核酸溶液包含少于第二量的所述测定抑制剂的第一量的所述测定抑制剂，其中所述第二量的所述测定抑制剂在将一微升所述核酸溶液用于具有二十五微升体积的PCR时抑制PCR。
70.如项40所述的方法，其中所述靶核酸与选自由结肠直肠癌和结肠直肠腺瘤组成的组的疾病状态有关。
71.一种用于从样品制备核酸溶液的试剂盒，所述试剂盒包含：
a)用于从所述样品除去抑制剂的聚乙烯吡咯烷酮；
b)用于从所述样品捕获靶核酸的试剂；和
c)产生磁场的功能性。
72.如项71所述的试剂盒，其还包括收集所述样品的功能性。
73.如项71所述的试剂盒，其还包括运送所述核酸溶液的功能性。
74.一种包含如项1所述的旋转过滤器和使用说明书的试剂盒。
75.如项74所述的试剂盒，其还包括收集容器。
76.一种用于从包含核酸的粗制样品制品去除测定抑制剂的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)不溶的聚乙烯吡咯烷酮；和
b)旋转离心柱。
77.如项76所述的试剂盒，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是聚乙烯聚吡咯烷酮。
78.如项76所述的试剂盒，其中所述旋转离心柱包括根据项1-5中任一项所述的旋转过滤器。
79.如项76所述的试剂盒，其中所述聚乙烯吡咯烷酮包含具有约100至约130微米的平均直径的颗粒。
80.一种用于从人类粪便样品分离靶人类DNA的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)适用于加工具有至少4克质量的人类粪便样品的一定体积的粪便匀浆溶液；和
b)包含与磁性颗粒共价连接的寡核苷酸的靶特异性捕获试剂，其中所述寡核苷酸与所述靶人类DNA的至少一部分互补。
81.如项80所述的试剂盒，其还包括磁体。
82.如项80所述的试剂盒，其还包括聚乙烯吡咯烷酮。
83.如项82所述的试剂盒，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是聚乙烯聚吡咯烷酮。
84.如项82所述的试剂盒，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是预量形式的。
85.如项84所述的试剂盒，其中所述聚乙烯吡咯烷酮作为片剂提供。
86.如项80所述的试剂盒，其还包括异硫氰酸胍。
87.如项80所述的试剂盒，其还包括洗脱液或清洗溶液。
88.如项80所述的试剂盒，其还包括产生磁场的装置。
89.如项88所述的试剂盒，其中所述产生磁场的装置包括第一磁性特征和第二磁性特征，其中所述第一磁性特征的北极靠近所述样品放置而所述第二磁性特征的南极靠近所述样品放置。
90.如项80所述的试剂盒，其还包括收集粪便样品的设备。
91.如项90所述的试剂盒，其中所述设备包括：
a)主体；
b)配置为在开放状态和闭合状态之间变化的可拆卸的样品小容器，所述闭合状态的所述可拆卸的样品小容器包括配置为封闭样品的样品收集空间；和
c)与所述主体机械连接的发射器，所述发射器被配置为在所述可检测样品小容器处于闭合状态时将所述可拆卸的样品小容器从所述主体脱离。
92.如项80所述的试剂盒，其还包括配置为容纳所述粪便样品的样品容器。
93.如项80所述的试剂盒，其还包括容纳所分离的靶人类DNA的容器。
94.如项80所述的试剂盒，其还包括运送容器。
95.如项80所述的试剂盒，其还包括根据项1-5中任一项所述的旋转过滤器。
96.如项80所述的试剂盒，其还包括对照试剂。
97.如项96所述的试剂盒，其中所述对照包含核酸。
98.一种用于从样品制备核酸溶液的系统，所述系统包括：
a)用于从所述样品除去抑制剂的聚乙烯吡咯烷酮；
b)用于从所述样品捕获靶核酸的试剂；和
c)产生磁场的功能性。
99.如项98所述的系统，其还包括收集所述样品的功能性。
100.如项98所述的系统，其还包括运送所述核酸溶液的功能性。
101.一种包含如项1所述的旋转过滤器和使用说明书的系统。
102.如项101所述的系统，其还包括收集容器。
103.一种用于从粗制样品制品除去测定抑制剂的系统，所述系统包括：
a)不溶的聚乙烯吡咯烷酮；和
b)旋转离心柱。
104.如项103所述的系统，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是聚乙烯聚吡咯烷酮。
105.如项103所述的系统，其中所述旋转离心柱包括根据项1-5中任一项所述的旋转过滤器。
106.如项103所述的系统，其中所述聚乙烯吡咯烷酮包含具有约100至约130微米的平均直径的颗粒。
107.一种用于从人类粪便样品分离靶人类DNA的系统，所述系统包括：
a)适用于加工具有至少4克质量的人类粪便样品的一定体积的粪便匀浆溶液；和
b)包含与磁性颗粒共价连接的寡核苷酸的靶特异性捕获试剂，其中所述寡核苷酸与所述靶人类DNA的至少一部分互补。
108.如项107所述的系统，其还包括磁体。
109.如项107所述的系统，其还包括聚乙烯吡咯烷酮。
110.如项109所述的系统，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是聚乙烯聚吡咯烷酮。
111.如项107所述的系统，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是预量形式的。
112.如项111所述的系统，其中所述聚乙烯吡咯烷酮作为片剂提供。
113.如项107所述的系统，其还包括异硫氰酸胍。
114.如项107所述的系统，其还包括洗脱液或清洗溶液。
115.如项107所述的系统，其还包括产生磁场的装置。
116.如项115所述的系统，其中所述产生磁场的装置包括第一磁性特征和第二磁性特征，其中所述第一磁性特征的北极被放置靠近所述样品而所述第二磁性特征的南极被放置靠近所述样品。
117.如项107所述的系统，其还包括收集粪便样品的设备。
118.如项117所述的系统，其中所述设备包括：
a)主体；
b)配置在开放状态和闭合状态之间变化的可拆卸的样品小容器，所述闭合状态的所述可拆卸的样品小容器包括配置为封闭样品的样品收集空间；和
c)与所述主体机械连接的发射器，所述发射器被配置为在所述可检测样品小容器处于闭合状态时将所述可拆卸的样品小容器从所述主体脱离。
119.如项107所述的系统，其还包括配置为容纳所述粪便样品的样品容器。
120.如项107所述的系统，其还包括容纳所分离的靶人类DNA的容器。
121.如项107所述的系统，其还包括运送容器。
122.如项107所述的系统，其还包括根据项1-5中任一项所述的旋转过滤器。
123.如项107所述的系统，其还包括对照试剂。
124.如项123所述的系统，其中所述对照包含核酸。
附图简述
就下列附图而言，本技术的这些和其他特征、方面和优点将更容易理解：
图1提供了核酸分离工艺的各个方面的图解。图1A提供了显示核酸分离工艺的步骤的图解。图1B显示作为图1A的整个工艺的一个方面在从相同样品相继提取多种靶中有用的工艺的实施方案的流程图。
图2是聚乙烯吡咯烷酮的化学结构式。
图3是示例性旋转过滤器的图示。
图4是显示图3中所示的旋转过滤器的分解视图的图示。
图5是显示与图3和4的旋转过滤器相关联的旋转过滤器底部末端的一系列图示。图5A是盘形的、固体的(例如非多孔或者非可透过的)底部末端。图5B是盘形的、多孔的(可透过的)底部末端的图示；图5C是多孔的圆锥形底部末端的图示。
图6是装配有收集管的旋转过滤器的图示。
图7是图6中所描述的旋转过滤器的截面图。
图8是包括多孔材料的主体和由过滤器支撑物提供的底部末端的旋转过滤器的图示。图8A是装配的视图而图8B是分解的视图。
图9A-9D是显示从粪便样品除去抑制剂的曲线图。
图10A-10D是显示从旋转过滤器改善抑制剂去除的曲线图
图11A是比较常规技术对具有1厘泊和25厘泊粘度的样品的定域化效率的数据的曲线图。图11B是比较由Light和Miller提供的磁场定位设备(美国专利申请序列号13/089,116)为具有1厘泊和25厘泊粘度的样品提供的定位效率的数据的曲线图。
图12A是显示其中从粪便样品的单次提取回收大部分靶DNA的定量PCR的结果。图12B显示来自第一次提取和第二次提取的核酸溶液中基因A和基因V的浓度。
图13A-13D显示曲线图，其显示其中无论四种靶DNA从粪便样品提取的顺序如何四种靶DNA的回收是相似的定量PCR的结果。
图14提供比较实施方案的工作流程(工艺A)和使用基于现有方法的步骤从粪便样品分离DNA的示例性工艺(工艺B，参见，例如WO 2010/028382)的图解。
详细说明
本技术涉及产生DNA样品，并且特别地涉及产生包含小体积(例如少于100，少于60微升)的高度纯化、低丰度核酸并且基本上和/或有效地不含抑制用于测试DNA样品的测定(例如PCR、INVADER、QuARTS等)的物质的DNA样品的方法。这些DNA样品在定性从患者获取的样品中基因、基因变体(例如等位基因)或者基因修饰(例如甲基化)的存在或定量测量从患者获取的样品中基因、基因变体(例如等位基因)或者基因修饰(例如甲基化)的活性、表达或量的诊断测定中有用。例如，一些癌症与特定的突变等位基因或者特定的甲基化状态相关并且因此检测和/或定量这些突变等位基因或甲基化状态在癌症的诊断和治疗中具有预测价值。
许多有价值的基因标记以极其低的量存在于样品中并且产生这些标记的许多事件是罕有的。因此，即使是敏感的检测方法例如PCR也需要大量的DNA以提供足够的低丰度靶以满足或取代测定的检测阈值。而且，甚至是少量抑制性物质的存在都会损害与检测这些低量靶有关的这些测定的准确性和精确性。因此，本文提供了提供对体积和浓度的必要管理以产生这样的DNA样品的方法。
某些生物样品例如粪便样品含有对PCR有抑制性的各种各样不同的化合物。因此，DNA提取程序包括除去和/或失活PCR抑制剂的方法。如此，本文提供的是涉及加工并且制备样品的方法，并且特别但不排他地涉及从含有核酸的样品除去测定抑制剂的方法、系统和试剂盒。
定义
为了有利于理解本技术，下文定义了许多术语和短语。另外的定义陈述在整个详细说明中。
如本文所用的，“一(a)”或“一(an)”或“该(the)”可意指一个或多于一个。例如，“一个”零件可以意指一个零件或多个零件。
如本文所用的，“抑制剂“意指就抑制物不存在时测定的活性、精确性或准确性来说，起作用以直接或间接减少测定的活性、精确性或准确性的任何化合物、物质或组合物或其组合。抑制剂可以是分子、原子或分子或原子的组合而不受限制。
如本文所用的，将混合物经过过滤器的过程被称为“过滤”。过滤固体在液体中的悬浮液后所产生的液体被称为“滤液”而过滤器中残留的固体称为“滞留物”、“残留物”或“滤渣”。
如本文所用的，“不溶的”是指物质基本上不溶解于水中并且基本上与其不相混合的特性。当从非水相分离水相时，不溶的物质不会进入或成为水相的一部分。
如本文所用的，术语“受试者”和“患者”是指任何动物，例如犬、猫、鸟、家畜以及特别地哺乳动物，优选地人类。在一些情况下，受试者同样是“使用者”(并且因此使用者也是受试者或患者)、
如本文所用的，术语“样品”和“样本”可互换使用，并且是最广义的。在某个意义上，样品意指包括从任何来源获得的样本或培养物以及生物和环境样品。生物样品可以从动物(包括人类)获得并且涵盖流体、固体、组织和气体。生物样品包括血液产品，例如血浆、血清、粪便、尿和类似物。环境样品包括环境材料例如表面物质、土壤、泥土、污水、生物膜、水、晶体和工业样品。但这些样品不被解释为限制可适用于本发明的样品类型。
术语“靶”，当有关于核酸捕获、检测或分析方法使用时，通常是指具有特征例如有待被检测或分析的核苷酸的特定序列(例如在疑似包含靶核酸的样品中)的核酸。在一些实施方案中，靶是具有期望确定其甲基化状态的特定序列。当有关于聚合酶链式反应使用时，“靶”通常是指通过被用于聚合酶链式反应的引物结合的核酸的区域。因此，力求将“靶”从样品中可能存在的其它核酸序列分选出来。“区段”被定义为靶序列中核酸的一个区域。术语“样品模板”是指来源于分析靶的存在的样品的核酸。
如本文所用的，“基因座”是指在染色体或RNA分子上核酸例如基因或任何其他表征的序列的所定义的区域或区段中的特定位点例如突变、多态性的位点，或CpG二核苷酸中的C残基。基因座不限于特定大小或长度并且可以是染色体的一部分、基因、功能性遗传元件或者单个核苷酸或碱基对。如本文所用的，与CpG位点可以被甲基化有关时，基因座是指CpG二核苷酸中的C残基。
如本文所用的，“收集液体”是放入样品以保存、稳定或以另外方式维持其作为从其获取样品的样本的代表性样品的完整性的液体。尽管不限制于作为收集液体有用的组合物的类型，但是收集液体的实例是水性缓冲液，任选地包含防腐剂和有机溶剂例如乙腈。
如本文所用的，“捕获试剂”是指能够与分析物(例如靶)结合的任何剂。优选地，“捕获试剂”是指能够与分析物特异性结合的任何剂，例如具有比与任何其他部分更高的与分析物的结合亲和性和/或特异性。任何部分，例如细胞、细胞器、无机分子、有机分子及其混合物或复合物，如果其对分析物具有必要的结合亲和性和/或特异性，则可被用作捕获试剂。捕获试剂可以是肽、蛋白质例如抗体或受体、寡核苷酸、核酸、维生素、低聚糖、碳水化合物、脂质、小分子或其复合物。包括核酸例如寡核苷酸的捕获试剂可以通过序列特异性杂交(例如通过常规Watson-Crick基因对的形成)或通过其他结合反应捕获核酸靶。当捕获寡核苷酸与靶核酸杂交时，杂交可涉及寡核苷酸的一部分或者完整寡核苷酸序列并且寡核苷酸可以与靶核酸序列的一部分或完整靶核酸序列结合。
如本文所用的，“PVP”是指聚乙烯吡咯烷酮，其是从单体N-乙烯吡咯烷酮制得的水溶性的聚合物。术语PVP用于本文是指不同交联聚合状态的PVP，包括本领域中同样已知为聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)的PVP制品。
如本文所用的，“磁体”是产生磁场的材料或物体。磁体可以是永磁体或电磁体。
术语“扩增(amplifying)”或“扩增(amplification)”在核酸背景下是指产生多核苷酸或多核苷酸的一部分的多个拷贝，通常从少量的多核苷酸(例如单个多核苷酸分子)起始，其中扩增产物或扩增子一般是可以检测的。多核苷酸的扩增涵盖多种化学和酶促过程。在聚合酶链式反应(PCR)或连接酶链式反应(LCR；参见例如美国专利第5,494,810号，通过引用整体并入本文)期间从靶或模板DNA的一个或少数拷贝生成多个DNA拷贝是扩增的一种形式。其他类型的扩增包括但不限于等位基因特异性PCR(参见，例如美国专利第5,639,611号，通过引用整体并入本文)、装配PCR(参见，例如美国专利第号5,965,408，通过引用整体并入本文)、解旋酶依赖性扩增(参见，例如美国专利第号7,662,594，通过引用整体并入本文)、热启动PCR(参见，例如美国专利第5,773,258和5,338,671号，每一个通过引用整体并入本文)、内部序列特异性PCR、反向PCR(参见，例如Triglia等人，(1988)Nucleic AcidsRes.,16:8186，通过引用整体并入本文)、连接介导的PCR(参见，例如Guilfoyle,R等人，Nucleic Acids Research,25:1854-1858(1997)；美国专利第号5,508,169，其每一个通过引用整体并入本文)、甲基化特异性PCR(参见，例如Herman等人，(1996)PNAS 93(13)9821-9826，通过引用整体并入本文)、迷你引物PCR、多连接依赖性探针扩增(参见，例如Schouten等人，(2002)Nucleic Acids Research 30(12):e57，通过引用整体并入本文)、多重PCR(参见，例如Chamberlain等人，(1988)Nucleic Acids Research 16(23)11141-11156；Ballabio等人，(1990)Human Genetics 84(6)571-573；Hayden等人，(2008)BMC Genetics9:80，其每一个通过引用整体并入本文)、巢式PCR、重叠-延伸PCR(参见，例如Higuchi等人，(1988)Nucleic Acids Research 16(15)7351-7367，通过引用整体并入本文)、实时PCR(参见，例如Higuchi等人，(1992)Biotechnology 10:413-417；Higuchi等人，(1993)Biotechnology 11:1026-1030，其每一个通过引用整体并入本文)、逆转录PCR(参见，例如Bustin,S.A.(2000)J.Molecular Endocrinology 25:169-193，通过引用整体并入本文)、固相PCR、热不对称交错PCR和降落PCR(参见，例如Don等人，Nucleic Acids Research(1991)19(14)4008；Roux,K.(1994)Biotechniques 16(5)812-814；Hecker等人，(1996)Biotechniques 20(3)478-485，其每一个通过引用整体并入本文)。多核苷酸扩增同样可使用数字PCR来完成(参见，例如Kalinina等人，Nucleic Acids Research.25；1999-2004,(1997)；Vogelstein和Kinzler,Proc Natl Acad Sci USA.96；9236-41,(1999)；国际专利申请第WO05023091A2号；美国专利申请公开第20070202525号；其每一个通过引用整体并入本文)。
术语“聚合酶链式反应”(“PCR”)是指K.B.Mullis美国专利第4,683,195、4,683,202和4,965,188号的方法，其描述了增加基因组或其他DNA或RNA的混合物中靶序列区段的浓度而无需克隆或纯化的方法。用于扩增靶序列的这一工艺由以下组成：将大量过量的两条寡核苷酸引物引入含有所期望的靶序列的DNA混合物，之后是在DNA聚合酶存在下精确序列的热循环。所述两条引物与双链靶序列中它们各自的链互补。为了影响扩增，混合物被变性并且之后引物退火至靶分子中它们的互补序列。退火之后，将引物用聚合酶延伸以便形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以被重复多次(即，变性、退火和延伸组成一个“循环”；可以有多个“循环”)以获得高浓度的所期望的靶序列的扩增区段。所扩增的所期望靶序列的区段的长度通过引物相对于彼此的相对位置来确定，并且因此这一长度是可控制的参数。由于工艺的重复方面，所述方法被称作“聚合物链式反应”(“PCR”)。因为靶序列的所期望的扩增区段成为混合物中的主要序列(就浓度而言)，它们被称为“PCR扩增的”并且是“PCR产物”或“扩增子”。本领域技术人员应当理解术语“PCR”使用例如实时PCR、巢式PCR、逆转录PCR(RT-PCR)、单引物和任意引物PCR等涵盖最初描述的方法的许多变体。
如本文所用的，术语“核酸检测测定”是指确定关注的核酸的核苷酸组成的任何方法。核酸检测测定包括但不限于DNA测序方法、探针杂交方法、结构特异性断裂测定(例如INVADER测定(Hologic,Inc.)并且被描述于例如美国专利第5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567、6,090,543和6,872,816号；Lyamichev等人，Nat.Biotech.,17:292(1999)，Hall等人，PNAS,USA,97:8272(2000)和US 2009/0253142，其每一个为了所有目的通过引用整体并入本文)；酶错配切割法(例如Variagenics,美国专利第6,110,684、5,958,692、5,851,770号，其每一个通过引用整体并入本文)；聚合酶链式反应(PCR)，上文所描述的；分枝杂交法(例如Chiron,美国专利第5,849,481、5,710,264、5,124,246和5,624,802号，通过引用整体并入本文)；滚环复制(例如美国专利第6,210,884、6,183,960和6,235,502号，通过引用整体并入本文)；NASBA(例如美国专利第5,409,818号，通过引用整体并入本文)；分子信标技术(例如美国专利第6,150,097号，通过引用整体并入本文)；E-传感器技术(Motorola，例如美国专利第6,248,229、6,221,583、6,013,170和6,063,573号，通过引用整体并入本文)；循环探针技术(例如美国专利第5,403,711、5,011,769和5,660,988号，通过引用整体并入本文)；Dade Behring信号扩增法(例如，美国专利第6,121,001、6,110,677、5,914,230、5,882,867和5,792,614号，通过引用整体并入本文)；连接酶链式反应(例如Baranay Proc.Natl.Acad.Sci USA 88,189-93(1991))；和三明治杂交方法(例如美国专利第5,288,609号，通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，靶核酸被扩增(例如通过PCR)并且所扩增的核酸使用侵入性切割测定同时检测。配置将检测测定(例如侵入性切割测定)与扩增测定组合进行的测定描述于美国专利公开US 20090253142 Al(申请序列第12/404,240号)中，其为了所有目的通过引用整体并入本文。另外的扩增加上侵入性切割检测配置，称为QuARTS法，描述于美国专利申请序列第12/946,737；12/946,745和12/946,752号中，其为了所有目的通过引用整体并入本文。
术语“侵入性切割结构”如本文中所用的是指包含i)靶核酸，ii)上游核酸(例如INVADER寡核苷酸)和iii)下游核酸(例如引物)的切割结构，其中上游和下游核酸退火至靶核酸的共同区并且其中在上游核酸的3’部分和下游核酸与靶核酸之间形成的双链体之间形成重叠。在来自上游和下游核酸的一个或多个碱基占据就靶核酸碱基而言相同的位置处发生重叠，无论上游核酸的重叠碱基是否与靶核酸互补并且无论这些碱基是天然碱基还是非天然碱基。在一些实施方案中，与下游双链体重叠上游核酸的3’部分是非碱基化学部分例如芳香环结构，诸如例如美国专利第6,090,543号所公开的，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，核酸中的一个或多个可以彼此连接，例如通过共价键诸如核酸茎-环或通过非核酸化学键合(例如多碳链)。
如本文所用的，术语“互补的”或“互补性”在提及多核苷酸(即核苷酸序列)使用时是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸。例如，序列“5’-A-G-T-3’”与序列“3’-T-C-A-5’”互补。互补性可以是“部分的”。其中仅核酸碱基中的一些根据碱基配对规则相配。或者，可有核酸之间“完全的”或“整体的”互补性。核酸链之间互补性的程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。这在扩增反应以及依赖核酸之间的结合的检测方法中特别重要。
如本文所用的，术语“引物”是指纯化的限制性酶切消化或合成产生的寡核苷酸(无论是不是天然存在的)，其在放置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下(例如在核苷酸和诱导剂诸如生物催化剂(例如DNA聚合酶或类似物存在时)时能够起到合成起始点的作用。为了在扩增中的最大功效引物通常是单链的，但是可选择地可以是部分或完全双链的。引物与模板核酸杂交的部分对于在诱导剂存在的情况下引导延伸产物的合成足够长。引物的精确长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用的方法。引物可以包括标记、标签、捕获部分等。
如本文所用的，术语“核酸分子”是指含有包括但不限于DNA或RNA的分子的任何核酸。所述术语涵盖包括DNA或RNA的已知碱基类似物中任一个的序列，包括但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧羟基-甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、次黄嘌呤、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假-尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、2,2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5'-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羟乙基甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
如本文所用的，术语“核碱基”在本领域中使用时与其他术语包括“核苷酸”，“脱氧核糖核酸”，“核苷酸残基”，“脱氧核苷酸残基”，“核苷三磷酸(NTP)”，或脱氧核苷三磷酸(dNTP)是同义词。
“寡核苷酸”是指包括至少两个核酸单体单元(例如核苷酸)，通常多于三个单体单元，并且更加通常多于十个单体单元。寡核苷酸的实际大小通常取决于不同因素，包括最终寡核苷酸的功能和用途。为了进一步说明，寡核苷酸通常少于200个残基长度(例如在15和100个之间)，然而，如本文中所用的，所述术语同样预期包含较长的多核苷酸链。寡核苷酸常常涉及它们的长度。例如，24个残基的寡核苷酸被称为“24-聚体”。通常，核苷酸单体通过磷酸二酯键或其类似键包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺磷酸硫醇酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoraniladate)、氨基磷酸酯酯(phosphoroamidate)以及类似键连接，包括相关的抗衡离子，例如H+、NH4 +、Na+以及类似物，如果抗衡离子存在的话。而且，寡核苷酸通常是单链的。寡核苷酸任选地通过任何适合的方法制备，包括但不限于分离存在的或天然的序列，DNA复制或扩增，逆转录，适当序列的克隆和限制性消化，或者通过下列方法直接合成，例如Narang等人(1979)Meth Enzymol.68:90-99的磷酸三酯法；Brown等人(1979)Meth Enzymol.68:109-151的磷酸二酯法；Beaucage等人(1981)Tetrahedron Lett.22:1859-1862的二乙基亚磷酰胺法；Matteucci等人(1981)JAm Chem Soc.103:3185-3191的三酯法；自动化合成法；或者Caruthers等人1984年7月3日提交的美国专利第4,458,066号，标题为“制备多核苷酸的工艺”的固相支持法，或者本领域技术人员已知的其他方法。所有这些参考文献通过引用并入。
生物聚合物的“序列”是指生物聚合物中单体单元(例如核苷酸、氨基酸等)的顺序和身份。核酸的序列(例如碱基序列)通常以5’至3’的方向读取。
术语“野生型”是指当从天然存在的来源分离时具有基因或基因产物的表征的基因或基因产物。野生型基因是在群组中最常观察到的并且因此任意指代基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰的”、“突变的”和“变体”是指当与野生型基因或基因产物相比时，序列或功能特性上表现出修饰(即改变的表征)的基因或基因产物。应当注意的是可分离的天然存在的突变；这些通过在与野生型基因或基因产物相比时具有改变的表征的事实而被鉴定。
如本文所用的，术语“基因”是指包含对于产生多肽、前体或RNA(例如rRNA、tRNA)来说必须的编码序列的核酸序列(例如DNA)。多肽可以被全长编码序列或被编码序列的任意部分编码，只要全长或片段多肽的所期望的活性或功能特性(例如酶活性、配体结合、信号传导、免疫原性等)被保留。所述术语同样涵盖结构基因的编码区和在5’和3’两末端约1kb的距离或任一端更多的距离毗邻编码区定位的序列以使基因相当于全长mRNA的长度。位于编码区的5’并且存在于mRNA上的序列被称为5’非翻译序列。位于编码区的3’或下游并且存在于mRNA上的序列被称为3’非翻译序列。术语“基因”涵盖cDNA和基因组形式的基因。基因的基因组形式或克隆含有被称为“内含子”或“插入区”或“插入序列”的非编码序列打断的编码区。内含子是转录为核RNA(例hnRNA)的基因的区段；内含子可以含有调控序列(例如增强子)。内含子从核或初级转录物除去或“剪切”；内含子因此在信使RNA(mRNA)转录物中不存在。翻译期间mRNA起作用以指定新生多肽中的氨基酸的序列或顺序。
除了含有内含子之外，基因的基因组形式还可以包括位于RNA转录物中存在的序列的5’和3’两端的序列。这些序列被称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于mRNA转录物上存在的非翻译序列的5’或3’)。5’侧翼区域可含有调控序列例如控制或影响基因转录的启动子和增强子。3’侧翼区域可含有指导转录终止、转录后切割和多腺苷酸化的序列。
如本文所用的，术语“试剂盒”是指递送材料的任何递送系统。在核酸纯化系统和反应测定的背景下，这样的递送系统包括允许试剂和设备的储存、运输或递送的系统(例如适合的容器中的抑制剂吸附剂、颗粒、变性剂、寡核苷酸、旋转过滤器等)和/或从一个位置到另一个位置的支持材料(例如缓冲液、进行程序的书面说明等)。例如，试剂盒包括含有相关反应试剂和/或支持材料的一个或多个附件(例如盒子)。如本文所用的，术语“分立的试剂盒”是指含有两个或多个单独的容器的递送系统，每个容器含有整个试剂盒组分的一部分。容器可以被一起或单独递送至期望的接受者。例如，第一个容器可含有用于样品收集的材料和缓冲液，而第二个容器含有捕获寡核苷酸和变性剂。术语“分立的试剂盒”预期涵盖含有联邦食品，药品，化妆品法案520(e)节所规定的分析物特异性试剂(ASR)的试剂盒但不限于此。事实上，包含每个含有整个试剂盒组分的一部分的两个或更多个单独的容器的任何递送系统都包括在术语“分立的试剂盒”中。相反，“组合试剂盒”是指在单个容器中(例如装有每种所期望的组分的单个盒子中)含有反应测定的所有组分的递送系统。术语“试剂盒”包括分立的和组合的试剂盒两种。
术语“系统”如本文所用的是指用于特定目的物品的集合。在一些实施方案中，物品包括使用说明书，作为在例如物品上、纸上或可记录的媒介(例如磁盘、CD、闪存盘等)上提供的信息。在一些实施方案中，说明书将使用者指向在线位点，例如网站。
如本文所用的，术语“信息”是指事实或数据的任何集合。对于使用计算机系统，包括但不限于互联网，储存或加工的信息来说，所述术语是指以任何形式(例如模拟、数字、光学等)储存的任何信息。如本文所用的，术语“与受试者有关的信息”是指关于受试者(例如人类、植物或动物)的事实或数据。术语“基因组信息”是指关于基因组的信息，包括但不限于核酸序列、基因、百分比甲基化、等位基因频率、RNA表达水平、蛋白表达、与基因型相关的表型等。“等位基因频率”是指关于等位基因频率的事实或数据，包括但不限于等位基因鉴定、等位基因的存在和受试者(例如人类)的表征之间的统计学关联，个体或群体中等位基因存在或不存在，具有一个或多个特定表征的个体中等位基因存在的百分比可能性等。
本技术的实施方案
尽管本文本公开内容是指某些示例性说明的实施方案，但应当理解的是这些实施方案以示例的方式而不以限制性方式存在。
1.总体方法
本文提供的是分离DNA，例如从粪便样品，的方法。如图1中所概述的，工艺包括将样品(例如粪便样品)在适当的缓冲液中匀浆化并且从匀浆制备上清液。用组合物(例如交联的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)诸如聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP))处理上清液以除去抑制剂并且产生澄清的上清液。澄清的上清液中的DNA被变性，例如通过加入异硫氰酸胍(GTC)和/或加热样品。之后，加入靶捕获试剂例如连接与靶互补的寡核苷酸的磁珠，并且将溶液在促进靶和捕获试剂关联(例如通过杂交)的条件下孵育(例如常温一小时)以产生靶:捕获试剂复合物。在将所述靶:捕获试剂复合物分离并除去之后(例如，通过施加磁场)，将所获得的溶液再次加热以将澄清的上清液中残留的DNA变性并且可加入另外的靶捕获试剂以分离另一种靶。工艺可以被重复，例如至少四次，以分离测定所需的那么多的靶(例如相继或系列提取)。清洗来自每个捕获和分离步骤的分离的靶:捕获试剂复合物并且将靶DNA用适于下游分析的小体积缓冲液洗脱。
2.抑制剂去除
样品可以是含有破碎核酸或抑制酶促反应的杂质的材料的样品。特别地，这些杂质抑制与核酸反应的酶例如核酶诸如限制性内切酶、逆转录酶、核酸聚合酶、连接酶等的催化活性，特别是用于聚合酶链式(PCR)、LCR(连接酶链式反应)、TMA(转录介导的扩增)、NASBA(核酸碱基特异性扩增)、3SR(自身持续的序列复制)以及类似反应的酶的催化活性。
2.1PVP
在一些实施方案中，样品中的抑制剂通过用聚乙烯吡咯烷酮处理来去除(同样参见，例如美国专利申请序列号No.61/485,338，其通过引用并入本文)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是从单体N-乙烯吡咯烷酮制得的水溶性聚合物(参见图2)。聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)是对PVP的高度交联修饰。交联的程度变化并且没有建立PVP和PVPP之间区分的限定的阈值。因此，本文所用的术语PVP是指处于不同交联聚合状态的PVP，包括本领域中也称为PVPP的PVP制品。然而，一个重要的特性在于随着交联的程度增加，聚合物在水中变得越来越不溶。交联形式吸收水，这导致聚合物膨胀。PVP和PVPP的合成和物理特性是本领域熟知的(例如，参见Haaf,Sanner,&Straub.Polymers of N-vinylpyrrolidone:synthesis,characterization,and uses.Polymer J.17(1):143(1985))。
PVP已经被用于许多技术应用，包括用作血浆扩容剂；用作许多药片中的粘合剂；用作胶棒和热熔胶中的胶黏剂；用作电池、陶瓷、纤维玻璃、油墨、喷墨打印纸和化学机械平坦化工艺中的添加剂；用作溶液聚合作用的乳化剂和崩解剂；用作光致抗蚀剂；用于生产膜，例如渗析和水纯化过滤器；作为牙齿美白凝胶中的增稠剂。
已经发现PVP在结合杂质和从溶液中除去它们中有用，特别地在葡萄酒制作和啤酒制作中除去多酚类(参见，例如Redmanji,Gopal,&Mola.A novel stabilization ofbeer with Polyclar Brewbrite.MBAA TQ 39(1):24(2002))。已经描述了与加工生物样品有关的可溶和不溶形式的PVP的使用，例如作为中和酚类的方法(参见，例如美国专利第7,005,266号；Shames等人Identification of widespread Helicobacter hepaticusinfection in feces in commercial mouse colonies by culture and PCRassay.J.Clin.Microbiol.33(11):2968(1995)；Morgan等人Comparison of PCR andmicroscopy for detection of Cryptosporidium parvum in human fecal specimens:Clinical trial.J.Clin.Microbiol.36(4):995(1998))。
以允许其引入有待加工的样品中的形式提供PVP，例如作为粉末、浆体、悬浮液、粒料以及类似形式。在本文提供的本技术的一些实施方案中，PVP以随时可用的形式预量提供。例如，在一些实施方案中，PVP被压制成含有对处理样品来说适当的PVP质量的片剂。片剂的不同大小和形状被提供给不同体积和类型的样品。惰性结合剂、填充剂和其他组合物可被加至片剂以提供物理、热学、化学和生物学稳定性，或提供其他所期望的表征例如在样品中改进的分散或控制释放。
PVP颗粒的交联程度和大小两者都是影响所获得的核酸制品的下游测定的参数。例如，已经发现可溶的PVP抑制某些下游测定。因此，所述方法从使用完全不溶解的(例如充分交联的)PVP获益以允许通过下游加工步骤(例如离心和/或旋转过滤)充分除去PVP。此外，当交联的PVP颗粒太小时，它们在旋转柱中填充太紧并且限制了样品流出至旋转柱收集空间内。例如，在本技术的一些实施方案的开发过程中进行的实验证实具有100-130微米平均粒度的PVP产生令人满意的结果而具有30–50微米平均粒度的PVP限制了流动和过滤。另外的实验可显示其他的大小和溶解度可以适于本方法的实施方案。
2.2旋转过滤器
本文提供的技术涵盖了旋转过滤器的使用，例如如美国专利申请序列号61/485,214中提供的，过滤所处理的PVP处理的样品以去除与PVP结合的抑制剂。如上文所讨论的，在PVP处理方法的开发中，实验证实在一些条件下具有过滤器的常规旋转柱在堵塞的底部末端中熔合。因此，本技术的一些实施方案包含使用耐堵塞的旋转过滤器。图3-8描述了处于组装和分解视图中并且与收集管相关联的耐堵塞的旋转过滤器的不同构造。耐堵塞过滤器被设计为如果底部末端开始被来自样品的滤渣堵塞则允许有待过滤的样品通过主体壁。
适于与本文提供的技术一起使用的旋转过滤器通常从就样品而言惰性的材料制得，也就是说所述材料除了过滤样品之外不以影响随后测定的方式(例如导致样品的降解、导致其分解等)与样品反应或者以另外的方式污染或修饰样品。这样的材料的实例是聚乙烯。其他适合的材料是例如尼龙、醋酸纤维素、聚四氟乙烯(PTFE，也称作Teflon)、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、聚醚和聚醚砜。操作压力，有待过滤的组合物的化学和物理表征、从样品除去的实体的大小以及材料的机械特性(例如在过滤应用所需的速度下经受离心的能力)是在选择适合的旋转过滤器时要考虑的因素。
制造过滤器以具有适于不同过滤应用的各种孔径。例如具有0.2微米孔径的过滤器通常公认去除大部分细菌，而较小孔径是除去病毒和细菌芽孢所需要的。为了除去较大的颗粒，较大孔径是适当的。例如，当本文提供的本技术的一个方面使用具有20毫米的孔径的旋转过滤器，在过滤应用中有用的其他孔径是0.22、0.45、10、20、30和45微米。因此，预期较大和较小的孔径，在由这些特定值界定的区间中的孔径中值。对于一些过滤应用来说，过滤器是由被过滤器截留的分子的平均分子量表征的。例如，具有5,000Da截留分子量(MWCO)的过滤器被设计截留具有至少约5,000Da分子量的截留分子和复合物。过滤器可提供10,000Da；30,000Da；50,000Da；100,000Da的MWCO以及过滤任务所需要的其他限制。操作压力和从样品去除的实体的尺寸是在选择孔径或截留值时所要考虑的因素。
3.核酸捕获
靶核酸是使用序列特异性靶捕获试剂捕获的，例如连接与靶互补的寡核苷酸的磁珠。加入捕获试剂之后，在促进靶与捕获试剂关联(例如通过杂交)产生靶:捕获试剂复合物的条件下孵育溶液。在分离和除去靶:捕获试剂复合物(例如，通过磁场的应用)之后，所获得的溶液被再次加热以将澄清的上清液中保留的DNA的变性并且可加入另一种靶捕获试剂以分离另一种靶(通过杂交和应用磁场)。工艺可以重复，例如至少四次，以分离测定所需要的那么多的靶(例如诸如美国专利申请序列号61/485,386所描述的相继或系列分离，其通过引用并入本文)。同样，可通过使用包含过个捕获序列的捕获试剂在一个捕获步骤中分离不止一个靶。
3.1捕获试剂
在一个方面中，本文提供的方法涉及捕获试剂的使用。这些试剂是与试图分离和纯化的特定靶优先(例如特异性并且选择性地)反应的分子、部分、物质或组合物。与分析物靶具有所期望的结合亲和性和/或特异性的任何捕获试剂被用于本技术。例如，在一些实施方案中，捕获试剂是大分子例如肽、蛋白(例如抗体或受体)、寡核苷酸、核酸(例如能够与靶核酸杂交的核酸)、维生素、寡糖、碳水化合物、脂质或小分子或者其复合物。作为示例性并且非限制性的实例，抗生物素蛋白靶捕获试剂可被用于分离和纯化包含生物素部分的靶，抗体可被用于分离并纯化包含适当抗原或表位的抗体而寡核苷酸可被用于分离和纯化互补的寡核苷酸(例如聚-dT寡核苷酸可被用于分离和纯化包含聚A尾部的靶)。
能够结合或者特异性结合靶的任何核酸，包括单链、双链和三链的核酸，被用作本设备中的捕获试剂。这样的核酸的实例包括DNA例如A-、B-或Z-型DNA，和RNA例如mRNA、tRNA和rRNA，适体，肽核酸和对糖、磷酸酯或核苷碱基的其他修饰。因此，有许多捕获靶的策略并且因此多种类型的捕获试剂是本领域中已知的。当不限于靶核酸可被捕获的方式时，本文提供的技术的实施方案包括使用与靶互补并且因此通过与靶核酸的特异性和选择性杂交捕获靶的寡核苷酸。
此外，靶捕获试剂包括定域、浓缩、聚集等的功能，并且因此靶捕获试剂在靶被靶捕获试剂捕获(例如结合、杂交等)例如形成靶:捕获试剂复合物时提供了分离和纯化靶的方法。例如，在一些实施方案中，靶捕获试剂与靶反应的部分(例如寡核苷酸)与允许使用者在宏观水平操作的固相支持物(例如小珠、表面、树脂、柱)连接。常常，固相支持物允许使用机械方法从非均质的溶液分离并纯化靶:捕获试剂复合物。例如当与小珠连接时，分离通过将小珠从非均质溶液除去，例如通过物理移动，来实现。在小珠是磁性或顺磁性的实施方案中，磁场被用来实现将捕获试剂(以及由此的靶)从非均质溶液物理分离。本领域中描述了用于分离靶的磁珠，例如如美国专利第5,648,124号和欧洲专利申请第87309308号中所描述的，其为了所有目的通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，捕获试剂的与靶反应的组分(例如寡核苷酸)与捕获试剂提供靶:捕获试剂复合物的定域、浓缩和/或聚集的组分(例如磁珠)共价连接。这些共价连接的捕获试剂的示例性实施方案由Stone,等人(“Detection of rRNA from four respiratorypathogens using an automated Qβreplicase assay”,Molecular and Cellular Probes10:359–370(1996))提供，其为了所有目的通过引用整体并入本文。发现这些共价连接的捕获试剂在从同一个样品制品中相继分离多个特异性靶中有用。而且，这些捕获试剂提供DNA靶的分离而没有与其他方法有关联的许多问题。例如，用于捕获生物素化靶的常规链霉亲和素小珠的对于加工含有大量游离生物素的样品(例如粪便样品)来说是成问题的，因为游离生物素干扰靶的分离。
3.2磁性颗粒定域剂
使用磁性颗粒定域剂捕获靶:捕获试剂复合物。然而因为粘滞曳力影响磁性微粒，样品粘度可对定域功效具有深刻影响。粪便样品具有20厘泊至40厘泊范围内的粘度，然而，作为参照，20℃时水具有约1厘泊的粘度而20℃时蜂蜜具有约3,000厘泊的粘度。因此对于某些应用来说，为了提供更有效的分离，更强的磁场可能是优选的。
已经发现使用具有特定排布的磁体的磁性设备获得特别有效的分离。例如，一个特别有效的排布提供成环排布在样品周围的平行平面层中的两套磁体，其中一层中的磁体都以它们的北极朝向样品来定向而其它层中的磁体都以它们的南极朝向样品来定向(即，“N-S”结构，与其他定向例如其中两层中的所有北极或所有南极都朝向样品定向“N-N”定向相反)。这样的设备的实例由Light和Miller，美国专利申请序列号13/089,116(“MagneticMicroparticle Localization Device”)提供，其为了所有目的通过引用整体并入本文。在一些结构中，设备的磁体在放入样品管(例如50毫升圆锥形管)孔周围排布，以使得它们产生样品中的磁通量。磁通量影响溶液中磁性颗粒的移动以使它们在样品管的区域聚集、浓缩和/或分离，这有利于除去所回收的靶DNA(Light，同上)
这样的设备已经显示对大的、粘性的样品(例如粪便样品)中的磁性颗粒的定域化特别有效并且因此对于从这些样品中分离DNA来说是有用的(Light，同上)。例如图11A和11B显示样品粘度对使用常规磁性技术(11A)或Light和Miller的磁性定域化技术(11B)(Light，同上)将磁珠从1或25厘泊粘度的溶液清除的影响。在所显示的曲线图中，吸光度的降低表明溶液中悬浮的微粒的浓度降低。收集的25厘泊溶液的数据用方块(■)来显示而收集的1厘泊溶液的数据用方块(◆)来显示。这些曲线图显示当使用常规技术时粘度上的增加显著减缓了分离，而Light和Miller的磁性颗粒定域设备清除了更粘性的溶液而仅有速度上的适度减少。
本文所描述的化学和工艺，在组合使用时，提供从复合物和抑制性样品例如粪便样品分离核酸的系统，其明显比之前所用的方法更迅速。而且，系统产生基本上更加不含有抑制性物质的核酸制品并且产生较高产量的靶核苷酸，用于例如诊断测试。而且，这一系统的实施方案容易为了有效的样品加工被整合至实验室工作流程中，以便与任何下游分析或检测技术一起使用。即时系统的实施方案和示例性的常规系统的工作流程、时间线和工艺产量的比较示于图14中。
4.试剂盒
预期本技术的实施方案以试剂盒的形式提供。试剂盒包含本文描述的组合物、设备、装置等的技术方案和试剂盒的使用说明书。这些说明书描述了从样品制备分析物的适当的方法，例如收集样品和从样品制备核酸。试剂盒的各个组分被包装在适当的容器和包装(例如管形瓶，盒，透明包装，安瓿瓶，罐，瓶，管等)中并且组分被一起包装在适当的容器(例如，一个或多个盒子)中用于方便的储存、运输和/或被试剂盒的使用者使用。应当理解的是液体组分(例如缓冲液)可以以有待被使用者重构的冷冻干燥的形式提供。试剂盒可以包括评估、确认和/或确保试剂盒的性能的对照或参照。例如，测定样品中存在的核酸的量的试剂盒可包括用于比较的包含已知浓度的相同或不同核酸的对照，以及在一些实施方案中，对对照核酸特异性的检测试剂(例如引物)。试剂盒适于在临床环境中使用，而在一些实施方案中，用于在使用者家中使用。试剂盒的组分，在一些实施方案中，提供用于从样品制备核酸溶液的系统功能。在一些实施方案中，系统的某些组分由使用者提供。
实施例
实施例1
在本文提供的本技术的实施方案的开发过程中，证实了PVP(例如PVPP)从粪便样品除去PCR抑制剂(参见图9)。从两个不同的粪便上清液样品的上清液采集20毫升的体积。对于每个粪便样品，用PVP处理一个等份而其他的不处理。另外地，将样品相同地加工以捕获两种不同的核酸靶(图9，基因A和基因V)。在捕获并且最终洗脱之后，通过使用25微升反应体积中的1微升洗脱物的SYBR Green定量PCR(qPCR)测定检测两种靶的回收率。对于来自两个粪便上清液的两个靶，将用PVP处理的等份扩增，然而未处理的等份未能产生任何qPCR信号。这些结果证实当从粪便样品提取DNA用于使用定量PCR测定的测定时PVP作为抑制剂去除处理的必要性和功效。
实施例2
在本文提供的本技术的实施方案的开发过程中，收集数据证实旋转过滤器改进了PCR抑制剂的去除。实验比较不同大小的PVP(例如PVPP)从粪便上清液样品去除PCR抑制剂的能力。比较了两种商业上可获得的PVP组合物：10和XL，其分别由具有30-50微米和100-130微米的平均直径的PVP颗粒组成。通过qPCR测定使用两种PVP组合物的抑制剂去除，其中1微升或5微升分离的DNA洗脱物被用于25微升体积。首先，将两种类型的PVP通过成团块(离心)从粪便上清液分离。对于两种PVP类型，当将1微升洗脱的DNA加至qPCR时样品显示同等的回收和扩增曲线形状。然而，使用5微升洗脱液未能产生任何qPCR信号，表明PCR抑制剂被保留在样品中(参见图10A和10B)。
之后，将旋转离心柱过滤作为可替代的方法尝试从粪便上清液分离PVP。当PVP在旋转柱中填充得如此紧实以致液体粪便上清液不能通过时，较小粒径的PVP不能以这一方式处理。然而，较大粒径的PVP并没有相同的问题而样品制品可以被容易地旋转过滤。旋转离心柱含有聚乙烯熔块(20微米标称孔径)以收集PVP。当经由装配有聚乙烯熔块的旋转离心柱过滤从粪便上清液分离巨大的颗粒PVP时，qPCR中的洗脱物体积可以增加至5微升或6微升而没有明显的抑制(参见图10C和10D)。如表1中所显示的，当使用5或6微升的洗脱物时，所计算的链数为当使用1微升洗脱物时所计算的链数的约5或6倍。这些结果证实PVP处理加上旋转离心柱过滤对于从粪便样品除去PCR抑制剂的益处。
表1
实施例3
在本文提供的本技术的实施方案的开发过程中，进行试验比较常规技术(例如背部有1-英尺外部直径×八分之一英寸厚N52钕磁体的Promega PolyA Tract)与Light和Miller的磁性微粒定域设备(S-N结构的N52等级钕磁体)对低(即1厘泊)和高(即25厘泊)粘度样品的定域功效。
适当粘度(例如1或25厘泊)的测试溶液被放置在常规设备或本文提供的技术的一个实施方案中用于测试。将样品暴露于磁场，以对每个样品标明的时间间隔将液体吸出并且通过光谱测定法定量悬浮液中残留的颗粒。吸光度上的减少表明溶液中悬浮微粒的减小的浓度(即更多颗粒被定域化并且通过磁分离从悬浮液除去)。常规技术的结果提供于下文图11A中。磁性微粒定域化设备的结果提供于图11B中。在图11A和B中，对25厘泊溶液收集的数据以方块(■)显示而对1厘泊溶液收集的数据以菱形(◆)显示。
实施例4
在本文提供的本技术的实施方案的开发过程中，证实了在单次提取中给定靶的大部分DNA从粪便上清液耗尽。根据图1中显示的流程图进行提取。最终洗脱之后，两个靶(基因A和基因V)从提取1和2中的回收使用25微升体积反应中的1微升洗脱物通过SYBR GreenqPCR测定监测。对于两个靶来说，提取1产生对靶的良好回收，而来自提取2的洗脱物未能产生任一靶的任何qPCR信号(图12)。
实施例5
在本文提供的本技术的实施方案的开发过程中，证实了DNA提取可以通过最少四个变性/杂交循环在单个样品上反复进行而不损害粪便上清液中人类DNA的完整性。在这一实施例中，从样品捕获四个靶(基因A、F、V和W)并且它们的捕获顺序是变化的。洗脱后，每个靶的回收通过SYBR Green qPCR监测。在图13中，曲线图显示每个基因当其在提取序列中被第一个、第二个、第三个和第四个捕获时的扩增曲线。扩增曲线的重叠证实回收率基本上相等而无论提取的顺序如何。表3表示来自图13的结果的量。
表3
对于所有四种基因，无论提取的顺序如何，平均Cp(交点—扩增曲线与固定阈值交叉的循环数)和链数基本上相等。
实施例6
多个靶核酸的系列分离的示例性程序：
如图1中所图解的：
1.将粪便样品匀浆化，例如用缓冲液，以形成粪便匀浆。处理匀浆以将残留的固体与流体分离，例如通过离心或过滤，以产生“粪便上清液”。
2.处理粪便上清液以除去测定抑制剂(例如用聚乙烯聚吡咯烷酮，如美国专利申请序列号61/485,338中所描述的，其通过引用全文并入文本)，产生“澄清的上清液”。
3.将十毫升澄清上清液(代表约4克粪便的当量)与异硫氰酸胍(GTC)混合至2.4M的最终浓度；
4.之后将混合物在90℃水浴中加热10分钟以将粪便中存在的DNA(和蛋白)变性。
5.将含有共价连接(偶联)的与关注的靶序列互补的寡核苷酸(“靶特异性捕获探针”)的顺磁颗粒加至样品。之后将样品孵育(例如在室温，约22-25℃)一小时以使得靶DNA能够与磁性颗粒上的捕获探针杂交。
6.将澄清上清液、GTC和颗粒的混合物暴露于磁场以从粪便上清液/GTC混合物分离颗粒(现在含有与捕获探针杂交的靶DNA)，其被转移至新管中。参见例如美国专利申请序列号13/089,116，其通过引用并入本文。
7.之后清洗顺磁颗粒并且洗脱靶DNA，准备在检测测定中使用。
8.步骤6中保留的上清液/GTC混合物被送回90℃水浴中10分钟以重复变性(步骤4)。之后通过加入含有与不同靶DNA互补的捕获探针的磁性颗粒重复步骤5，并且重复杂交、颗粒分离和洗脱步骤以产生第二种DNA靶的纯化样品。
变性/杂交/分离循环(步骤4-6)可重复至少四次或更多次以从同一个粪便上清液样品系列提取不同的靶DNA。
实施例7
在本文提供的本技术的实施方案的开发过程中，在临床应用中测试了所述方法。下文提供使用本发明的系统和方法的工作流程的实例。
研究设计
这一研究基于来自多个医疗中心(包括美国和丹麦的转诊中心和社区医疗中心)的充分表征的已存档的粪便。获得了伦理审查委员会批准。从患有已经证明的结肠直肠癌(CRC)的病例患者、具有≥1厘米的至少一个结肠直肠腺瘤的病例以及年龄和性别匹配但没有经结肠镜检查测定的瘤形成的对照患者获得粪便。已经从临床和筛选环境招募患者，并且一些是有症状的。患有已知癌症状或者炎性肠疾病的那些被排除。测试了将近700个样品，其中133个具有≥1厘米的腺瘤而252个是癌症患者。
进行多标记粪便测试，其包括四种甲基化基因(波形蛋白、NDRG4、BMP3和TFPI2)、突变的KRAS、参照基因β-肌动蛋白(ACTB)和血红蛋白。为了评估测试性能，将病例和对照粪便以平衡的方式分散于两个不同的测试位点；所有测试由不知情的技术人员进行。
粪便收集和储存
在作为黄金标准的结肠镜检查之前，将全部粪便收集至塑料桶中。将防腐缓冲液加至粪便并且于-80℃获得缓冲的粪便。然而，加入缓冲液的时机、排便和冷冻之间的持续时间和样品在储存前是否被匀浆化并未标准化并且在因参与的中心而不同。
标记选择
鉴定各自或组合(例如KRAS+BMP3+NDRG4+TFPI2+波形蛋白+参照物和/或ACTB+血红蛋白)将结肠直肠腺瘤与正常黏膜几乎完全区分的候选基因。四种甲基化基因标记-NDRG4、BMP3、波形蛋白和TFPI2-作为最大区分显现。突变的KRAS和血红蛋白检测补充粪便中检测的甲基化基因标记，并且因此同样在标记组中被评估。最终，对参照基因β-肌动蛋白(ACTB)的测定被用于确定粪便中总的人类基因组当量，并且当粪便中的人类DNA水平随着结肠直肠瘤形成增加时，本身起到参照标记的作用。
粪便加工和靶基因捕获
融化之后立即，将缓冲的粪便彻底匀浆化并且离心。之后将粪便上清液的14毫升等份用浓度为50毫克/毫升的聚乙烯聚吡咯烷酮处理。在上清液材料上通过与寡核苷酸探针的杂交进行对靶基因序列的直接捕获。简单地说，将10毫升不溶的PVP处理的上清液于90℃在2.4M异硫氢酸胍(Sigma,St.Louis MO)中变性10分钟；随后向变性的粪便上清液中加入用每种寡核苷酸捕获探针功能化的300-500微克Sera-Mag羧化物修饰的小珠(ThermoFisher Scientific,Waltham MA)并且在室温下孵育一小时。在磁道上收集Sera-Mag小珠并且用MOPS清洗缓冲液(10mM MOPS；150mM NaCl，pH 7.5)清洗三次并且之后洗脱在具有20纳克每微升tRNA的60微升无核酸酶水(Sigma)中。在这一研究中，所选择的四个甲基化标记，波形蛋白、NDRG4、BMP3和TFPI2，以及一个参照基因ACTB在一个杂交反应中被一起捕获；随后将突变标记KRAS在另一个杂交反应中捕获。所用的捕获探针，本文与它们5’的六碳氨基修饰的键合(Integrated DNA Technology,Coralville,IA)一起显示，如下：
对于波形蛋白：
/5AmMC6/CTGTAGGTGCGGGTGGACGTAGTCACGTAGCTCCGGCTGGA-3′(SEQ ID NO:1)；
对于NDRG4：
/5AmMC6/TCCCTCGCGCGTGGCTTCCGCCTTCTGCGCGGCTGGGGTGCCCGGTGG-3′(SEQ IDNO:2)；
对于BMP3：
/5AmMC6/GCGGGACACTCCGAAGGCGCAAGGAG-3′(SEQ ID NO:3)；
对于TFPI2：
/5AmMC6/CGCCTGGAGCAGAAAGCCGCGCACCT-3′(SEQ ID NO:4)；
对于ACTB：
/5AmMC6/CCTTGTCACACGAGCCAGTGTTAGTACCTACACC-3′(SEQ ID NO:5)；
对于KRAS：
/5AmMC6/GGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGC-3′(SEQ ID NO:6)；和
/5AmMC6/CTCTATTGTTGGATCATATTCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGC-3′(SEQ ID NO:7)
甲基化测定
如我们之前已经描述过的(参见，例如美国专利申请序列号12/946,737；12/946,745；和12/946,752，其为了所有目的通过引用并入本文)通过QuARTS法将甲基化的标记定量。这一方法将基于聚合酶的靶DNA扩增工艺与基于侵入性切割的信号扩增工艺组合。我们使用EZ-96DNA甲基化试剂盒(Zymo Research,Irvine CA)用重亚硫酸盐处理45微升捕获的DNA并且将样品洗脱96孔PCR板上含有20纳克每微升tRNA的50微升的10mM Tris、0.1mMEDTA pH 8.0(Sigma)中；在96孔PCR板上于30微升反应体积中用QuARTS方法测定10微升重亚硫酸盐处理的DNA。PCR板在LightCycler 480(Roche)中循环。
设计两个单独的三重QuARTS测定以使用ACTB作为每一个的参照基因检测甲基化标记，波形蛋白、NDRG4、BMP3和TFPI2。第一个三重测定含有ACTB、波形蛋白和NDRG4而第二个含有ACTB、BMP3和TFPI2。每个QuARTS反应混合400–600nM引物和检测探针，100nM侵入性寡核苷酸，600–700nM的FAM(Hologic,Madison WI)、Yellow(Hologic)和Quasor 670(BioSearch Technologies,Novato CA)荧光共振能量转移报告盒(FRET)中的每一种，6.675纳克每微升的Cleavase 2.0(Hologic)，1单位热启动GoTaq DNA聚合酶(Promega,Madison WI)，10mM MOPS，7.5mM MgCl2以及250μM每种dNTP。QuARTS循环条件由95℃3分钟，之后每次包含95℃20秒、67℃30秒和70℃30秒的10个循环，随后每次包含95℃20秒、53℃1分钟和70℃30秒的45个循环以及最终在40℃保持30秒组成。对于下文的每个靶，两个甲基化特异性引物和探针(Integrated DNA Technology,Coralville,IA)如下：
对于波形蛋白：
引物5′-GGC GGT TCG GGT ATC G-3′(SEQ ID NO:8),
引物5′-CGT AAT CAC GTA ACT CCG AC T-3′(SEQ ID NO:9),
探针5′-GAC GCG GAG GCG AGT CGG TCG/3′C6/(SEQ ID NO:10)；
对于NDRG4：
引物5′-CGG TTT TCG TTC GTT TTT TCG-3′(SEQ ID NO:11),
引物5′-GTA ACT TCC GCC TTC TAC GC-3′(SEQ ID NO:12),
探针5′-CGC CGA GGG TTC GTT TAT CG/3′C6/(SEQ ID NO:13)；
对于BMP3：
引物5′-GTT TAA TTT TCG GTT TCG TCG TC-3′(SEQ ID NO:14),
引物5′-CTC CCG ACG TCG CTA CG-3′(SEQ ID NO:15),
探针5′-CGC CGA GGC GGT TTT TTG CG/3′C6/(SEQ ID NO:16)；和
对于TFPI2：
引物5′-TCG TTG GGT AAG GCG TTC-3′(SEQ ID NO:17),
引物5′-AAA CGA ACA CCC GAA CCG-3′(SEQ ID NO:18),
探针5′-GAC GCG GAG GCG GTT TTT TGT T/3′C6/(SEQ ID NO:19).
TFPI2测定具有特定的侵入性寡核苷酸：
5′-GCG GGA GGA GGT GCC-3′(SEQ ID NO:20).
用于检测重亚硫酸盐处理ACTB的引物和探针为：
引物5′-TTT GTT TTT TTG ATT AGG TGT TTA AGA-3′(SEQ ID NO:21),
引物5′-CAC CAA CCT CAT AAC CTT ATC-3′(SEQ ID NO:22),
探针5′-CCA CGG ACG ATA GTG TTG TGG/3′C6/(SEQ ID NO:23).
每个板包括重亚硫酸盐处理的DNA样品、标准曲线样品、阳性和阴性对照以及水空白。使用从工程化的质粒切下的300至1000个靶序列制作标准曲线。重亚硫酸盐处理的CpGenome普遍甲基化DNA(Millipore,Billerica,MA)和人类基因组DNA(Merck,Germany)被用作阳性和阴性对照。DNA链数通过将靶基因的Cp与相关测定的标准曲线相比较来确定。每个标记的百分比甲基化通过将甲基化基因的链数除以ACTB链数并乘以100来确定。
KRAS突变
使用10微升捕获的KRAS DNA作为模板，将KRAS基因用密码子12/13两侧的引物进行第一次PCR扩增。用480SYBR Green I Master(Roche,Germany)和200nM每种引物进行PCR。循环条件为95℃3分钟，之后是每次95℃20秒、62℃30秒和72℃30秒的15个循环。引物序列为：
5′-AGG CCT GCT GAA AAT GAC TG-3′(SEQ ID NO:24)，和
5′-CTA TTG TTG GAT CAT ATT CG TC-3′(SEQ ID NO:25)。
每个扩增样品在无核酸酶的水中稀释500倍。用自动化液体处理器(epMotion,Eppendorf,Hauppauge NY)将500倍样品稀释液的10微升等份加至96孔PCR板上。之后使用QuARTS测定评估KRAS基因密码子12/13处的七种突变。每种突变测定被设计为单重测定。KRAS突变特异性正向引物和探针为：
对于G12S突变：
引物5′-CTT GTG GTA GTT GGA GCA A-3′(SEQ ID NO：26)
探针5′-GCG CGT CCA GTG GCG TAG GC/3′C6/(SEQ ID NO：27)；
对于G12C突变
引物5′-AAA CTT GTG GTA GTT GGA CCT T-3′(SEQ ID NO：28)
探针5′-GCG CGT CCT GTG GCG TAG GC/3′C6/(SEQ ID NO：29)；
对于G12R突变
引物5′-TAT AAA CTT GTG GTA GTT GGA CCT C-3′(SEQ ID NO：30)
探针5′-GCG CGT CCC GTG GCG TAG GC/3′C6/(SEQ ID NO：31)；
对于G12D突变
引物5′-ACT TGT GGT AGT TGG AGC TCA-3′(SEQ ID NO：32)
探针5′-GCG CGT CCA TGG CGT AGG CA/3′C6/(SEQ ID NO：33)；
对于G12V突变
引物5′-ACT TGT GGT AGT TGG AGC TCT-3′(SEQ ID NO：34)
探针5′-GCG CGT CCT TGG CGT AGG CA/3′C6/(SEQ ID NO：35)；
对于G12A突变
引物5′-AAC TTG TGG TAG TTG GAG ATG C-3′(SEQ ID NO：36)
探针5′-GCG CGT CCC TGG CGT AGG CA/3′C6/(SEQ ID NO：37)；
对于G13D突变
引物5′-GGT AGT TGG AGC TGG TCA-3′(SEQ ID NO：38)
探针5′-GCG CGT CCA CGT AGG CAA GA/3′C6/(SEQ ID NO：39)。
对于所有的KRAS突变，所用的反向引物为
5′-CTA TTG TTG GAT CAT ATT CGT C-3′(SEQ ID NO：40)。
KRAS的QuARTS循环条件和试剂浓度与甲基化测定中的那些相同。每个板含有由工程化质粒制得的标准品、阳性和阴性对照以及水空白。并且在LightCycler 480(Roche)中运行。DNA链数通过将靶基因的Cp与这一测定的标准曲线比较来确定。基于500倍稀释因子和1.95的扩增效率计算50微升KRAS中每种突变标记的浓度。将这一值除以甲基化测定中的ACTB浓度并且之后乘以100以确定百分比突变。
红血蛋白测定
为了定量粪便中的血红蛋白，如Ahlquist，等人(“HemoQuant,a newquantitative assay for fecal hemoglobin.Comparison with Hemoccult”.Ann InternMed 101:297–302(1984))中所描述的在每个患者两个缓冲的粪便等份(每个标准化至16毫克粪便)上进行半自动的HemoQuant测试。这一测试使得能够评估排泄物血红蛋白的补充值。
数据分析
使用本文描述的样品加工方法的组合，包括抑制剂去除和靶捕获纯化，与所描述的甲基化和突变标记组合，在90％的特异性水平下对678个样品的研究获得了下列敏感度水平：63.8％的腺瘤检测敏感度和85.3％的直肠结肠癌敏感度。
上文说明书中提及的所有出版物和专利为了所有目的通过引用整体并入本文。所描述的组合物、方法和本技术用途的各种修改和变化对本领域技术人员来说是显而易见的且不偏离所描述的本技术的范围和精神。尽管本技术以与特定的示例性实施方案相关联描述，但是应当理解的是如所要求的本发明不应当被过度限制于这些特定的实施方案。事实上，对于药理学、生物化学、医学或相关领域的技术人员来说是显而易见的所描述的进行本发明的方式的各种修改预期在下文权利要求的范围内。
序列表
<110> 精密科学公司
Bruinsma, Janelle J.
Domanico, Michael J.
Lidgard, Graham P.
Zou, Hongzhi
Weisburg, William G.
Shenoi, Hemanth D.
Light, James P. II
<120> ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS
<130> EXCT-31920/WO-1/ORD
<150> US 61/485,214
<151> 2011-05-12
<150> US 61/485,338
<151> 2011-05-12
<150> US 61/485,386
<151> 2011-05-12
<150> US 61/485,448
<151> 2011-05-12
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 1
ctgtaggtgc gggtggacgt agtcacgtag ctccggctgg a 41
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 2
tccctcgcgc gtggcttccg ccttctgcgc ggctggggtg cccggtgg 48
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 3
gcgggacact ccgaaggcgc aaggag 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 4
cgcctggagc agaaagccgc gcacct 26
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 5
ccttgtcaca cgagccagtg ttagtaccta cacc 34
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 6
ggcctgctga aaatgactga atataaactt gtggtagttg gagc 44
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 7
ctctattgtt ggatcatatt cgtccacaaa atgattctga attagc 46
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 8
ggcggttcgg gtatc 15
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 9
cgtaatcacg taactccgac t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 10
gacgcggagg cgagtcggtc g 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 11
cggttttcgt tcgttttttc g 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 12
gtaacttccg ccttctacgc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 13
cgccgagggt tcgtttatcg 20
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 14
gtttaatttt cggtttcgtc gtc 23
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 15
ctcccgacgt cgctacg 17
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<211> 20
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 16
cgccgaggcg gttttttgcg 20
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<211> 18
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 17
tcgttgggta aggcgttc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 18
aaacgaacac ccgaaccg 18
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<211> 22
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 19
gacgcggagg cggttttttg tt 22
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 20
gcgggaggag gtgcc 15
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<211> 27
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 21
tttgtttttt tgattaggtg tttaaga 27
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 22
caccaacctc ataaccttat c 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 23
ccacggacga tagtgttgtg g 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 24
aggcctgctg aaaatgactg 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 25
ctattgttgg atcatattcg tc 22
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<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 26
cttgtggtag ttggagcaa 19
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 27
gcgcgtccag tggcgtaggc 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 28
aaacttgtgg tagttggacc tt 22
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 29
gcgcgtcctg tggcgtaggc 20
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 30
tataaacttg tggtagttgg acct 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 31
gcgcgtcccg tggcgtaggc 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 32
acttgtggta gttggagctc a 21
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 33
gcgcgtccat ggcgtaggca 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 34
acttgtggta gttggagctc t 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 35
gcgcgtcctt ggcgtaggca 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 序列表
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<223> 合成的
<400> 36
aacttgtggt agttggagat gc 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 37
gcgcgtccct ggcgtaggca 20
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<211> 18
<212> DNA
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ggtagttgga gctggtca 18
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<212> DNA
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<400> 39
gcgcgtccac gtaggcaaga 20
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<211> 22
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<213> 序列表
<220>
<223> 合成的
<400> 40
ctattgttgg atcatattcg tc 22

Claims (21)

1.从粪便样品分离靶核酸用于核酸检测反应的方法，所述方法包括：
a)从所述粪便样品除去测定抑制剂以产生澄清的样品制品，所述除去包括以下步骤：
a1)将所述样品匀浆化以产生匀浆；
a2)离心所述匀浆以产生上清液；
a3)使用不可溶的抑制剂吸收组合物处理所述上清液，以便如果抑制剂存在的话在不可溶的抑制剂复合物中结合抑制剂；和
a4)从所述上清液分离所述不可溶的抑制剂复合物以产生澄清的样品制品；
b)使用靶特异性捕获试剂从所述澄清的样品制品捕获所述靶核酸以形成捕获复合物，其中捕获所述靶核酸包括：
b1)将所述澄清的样品制品暴露于变性条件以产生变性的样品；
b2)使所述变性的样品中的所述靶核酸结合靶特异性捕获试剂以形成捕获复合物，其中所述靶特异性捕获试剂包含与颗粒共价连接的寡核苷酸，所述寡核苷酸与所述靶核酸的至少一部分互补；
b3)从所述澄清的样品制品分离所述捕获复合物；和
b4)在靶核酸溶液中从所述捕获复合物回收所述靶核酸。
2.权利要求1的方法，进一步包括在所述靶核酸溶液上进行核酸检测反应，其中所述核酸检测反应的体积的至少三分之一来自所述靶核酸溶液。
3.权利要求1的方法，进一步包括：
c)在步骤b3)中所述分离所述捕获复合物之后，保留残留的澄清的样品制品；和
d)使用所述残留的澄清的样品制品和对第二靶核酸特异性的第二靶特异性捕获试剂重复b1)至b4)的捕获、分离和回收步骤。
4.权利要求1的方法，其中所述抑制剂吸收组合物是不可溶的聚乙烯吡咯烷酮。
5.权利要求4的方法，其中所述不可溶的聚乙烯吡咯烷酮作为胶囊和压制的片剂提供，所述胶囊或压制的片剂包含预测量的量的不可溶的聚乙烯吡咯烷酮。
6.权利要求1的方法，其中分离所述抑制剂复合物包括离心以将所述抑制剂复合物从所述上清液分离。
7.权利要求6的方法，其中在所述离心以从所述上清液分离所述抑制剂复合物期间，所述上清液的流体级分穿过多孔过滤材料以产生所述澄清的样品制品。
8.权利要求1的方法，其中所述靶特异性捕获试剂包含磁性颗粒，且其中所述分离所述捕获复合物包括将所述捕获复合物暴露于磁场。
9.权利要求2的方法，其中所述核酸检测反应包括使用至少一种选自下组的酶：限制性内切核酸酶，皮瓣(flap)内切核酸酶，逆转录酶，连接酶，RNA聚合酶，和DNA聚合酶。
10.权利要求2的方法，其中所述核酸检测反应包括聚合酶链式反应。
11.权利要求1的方法，其中所述变性条件包括加热。
12.权利要求11的方法，其中所述变性条件包括在90℃加热。
13.权利要求1的方法，其中所述将所述澄清的样品制品暴露于变性条件包括向所述澄清的样品制品加入变性剂。
14.权利要求13的方法，其中所述变性剂包括异硫氰酸胍。
15.权利要求1的方法，其中回收所述靶核酸包括将所述靶核酸从所述捕获复合物洗脱。
16.权利要求15的方法，其中洗脱包括加热。
17.用于从人类粪便样品分离靶人类DNA的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)适用于加工具有至少4克质量的人类粪便样品的一定体积的粪便匀浆溶液；和
b)预测量形式的不可溶聚乙烯吡咯烷酮；
c)包含与磁性颗粒共价连接的寡核苷酸的靶特异性捕获试剂，其中所述寡核苷酸与所述靶人类DNA的至少一部分互补。
18.权利要求17的试剂盒，其还包括异硫氰酸胍。
19.权利要求17的试剂盒，其还包括洗脱液或清洗溶液。
20.权利要求17的试剂盒，其还包括对照核酸、磁体和/或旋转滤器的一种或多种。
21.权利要求17的试剂盒，其中所述不可溶的聚乙烯吡咯烷酮作为胶囊或压制的片剂提供。
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