CN107290846A - 基于环状可编程led照明的定量相位显微成像方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于环状可编程LED照明的高效率定量相位显微成像方法，其步骤依次如下：部分相干照明成像系统下，系统光学传递函数推导；倾斜轴对称相干点光源照明下，对弱物体近似下的相位传递函数推导；光轴对称相干点光源到离散环状点光源的扩展，及光轴对称情况下的系统传递函数的非相干叠加；原始图像采集；定量相位反卷积重构。本发明推导出了在部分相干照明情况下倾斜轴对称点光源的系统相位传递函数，并推广运用到离散环状点光源的光学传递函数；LED阵列的可编程控制方式使环状照明孔径灵活可调，以适用于不同数值孔径的显微物镜，提高了系统的兼容性和灵活性。

Description

基于环状可编程LED照明的定量相位显微成像方法
技术领域
本发明属于光学显微测量、成像技术，特别是一种基于环状可编程LED照明的高效率定量相位显微成像方法。
背景技术
相位恢复是光学测量与成像的一个重要技术，在生物医学和工业检测上都发挥着重要作用。最为经典的定量相位测量方法是干涉法(Cuche E,Bevilacqua F,DepeursingeC.Digital holography for quantitative phase-contrast imaging[J].Opticsletters,1999,24(5):291-293.)，利用激光光源分束产生两束光线，物光透过样片再与参考光发生干涉，产生干涉条纹，通过解调算法即可获得物体的相位延迟。然而，干涉测量方法尤其明显的缺点：(1)干涉测量一般需要高度相干性的光源(如激光)，从而需要较为复杂的干涉装置；(2)额外的参考光路的引入导致对于测量环境的要求变得十分苛刻；(3)高相干性的光源引入的散斑相干噪声限制了成像系统的空间分辨率与测量精度。
区别于传统基于干涉方法的定量相位成像，相位恢复的方法则不需要借助光学的干涉就可以实现定量相位的获取。通过测量光波场的振幅/强度，利用不同轴向平面上的光强度分布来计算物体的相位分布，利用光强传输方程来求解相位是一种典型的直接求取相位法(Teague M R.Deterministic phase retrieval:a Green’s function solution[J].JOSA,1983,73(11):1434-1441.)。光强传输方程是一个二阶椭圆偏微分方程，阐明了沿着光轴方向上光强度的变化量与垂直于光轴的平面上光波相位的定量关系。沿轴向拍摄一系列强度图像，再利用中心差分公式求得在聚焦位置处的光强轴向微分以及光强分布，再通过数值求解光强传输方程可直接获取相位信息。与干涉法、迭代相位恢复法相比，光强传输方程的方法主要优点包括：(1)非干涉，仅仅通过测量物面光强直接求解相位信息，不需要引入额外参考光；(2)非迭代，通过直接求解微分方程获得相位；(3)可以很好的应用于白光照明，如传统明场显微镜中的科勒照明( illumination)；(4)无需相位解包裹，直接获取相位的绝对分布，不存在一般干涉测量中的2π相位包裹问题；(5)无须复杂的光学系统，对于实验环境没有苛刻的要求，且对振动不敏感。
在科勒照明系统中，随着照明数值孔径的增大，光学成像系统由相干照明变为部分相干照明，如图1(a)-(c)所示。最终的成像分辨率也会随之增大，但采集的强度图像对比度会比较差，使观察效果不明显，所以一般照明光阑的数值孔径设置为物镜数值孔径的70％～80％，以获得最佳的观测效果，这一结论也在绝大多数显微镜操作手册中得以体现。导致这一结论的根本原因是当显微成像系统的相干系数(其定义为照明数值孔径与物镜数值孔径之比，σ＝NAill/NAobj；当σ≈0时成像系统为相干照明系统，而当σ≤1时成像系统为部分相干照明系统)变大时，系统传递函数的响应幅值在不断衰减，致使所观测的图像对比度变弱。但是传递函数的截止频率点在不断拓展至2倍物镜分辨率，在图像强度对比变弱时成像分辨率是在不断的提高。这里就存在着成像分辨率与图像可测量对比的选取，在相干照明情况下图像的对比度是最强的，但是此时的成像分辨率只由物镜数值孔径决定。当相干系数σ＝1时，成像分辨率可拓展到两倍物镜数值孔径分辨率，而图像信息的对比度太弱导致相机无法采集到有用的信号。虽然部分相干照明已经引入基于光强传输方程的定量相位成像中(Gureyev T E,Roberts A,Nugent K A.Partially coherent fields,thetransport-of-intensity equation,and phase uniqueness[J].JOSA A,1995,12(9):1942-1946.[2]Paganin D,Nugent K A.Noninterferometric phase imaging withpartially coherent light[J].Physical review letters,1998,80(12):2586.)，但也无法避免在成像分辨率与图像可探测对比度之间的折中。而LED照明作为近年来一种新型的照明调控方式，使显微成像的手段和方法更为灵活和便捷(Zheng G,Horstmeyer R,YangC.Wide-field,high-resolution Fourier ptychographic microscopy[J].Naturephotonics,2013,7(9):739-745.[2]Zuo C,Sun J,Zhang J,et al.Lensless phasemicroscopy and diffraction tomography with multi-angle and multi-wavelengthilluminations using a LED matrix[J].Optics express,2015,23(11):14314-14328.)。如何突破传统的圆形科勒照明模式，在定量相位成像中达到两倍物镜分辨率的同时，保证相机所采集的光强对比度不至于过弱，也就是成像系统中相位的传递函数响应足够大来保证高信噪比，而这个问题成为定量相位成像技术中的一个技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于环状可编程LED照明的高效率定量相位显微成像方法，不仅最终的成像结果可达到2倍于物镜数值孔径的成像分辨率，还使成像系统的相位传递函数响应有较强的鲁棒性；提升了定量相位成像质量和重构结果，并且可高度兼容传统显微镜，极大的提高了定量相位成像技术的效率。
实现本发明目的的技术解决方案为：一种基于环状可编程LED照明的高效率定量相位显微成像方法，步骤如下：
步骤一，对部分相干成像系统的光学传递函数进行推导，在照明光源与显微物镜的光瞳函数是关于光轴对称情况下，推导在部分相干照明成像系统中弱物体近似下的光学传递函数表达式；
步骤二，倾斜轴对称相干点光源照明下弱物体近似相位传递函数推导，当照明由圆形部分相干照明图案退化为倾斜轴对称相干点光源，即两个轴对称的离散相干光源分别内切在物镜光瞳的边缘，从LED阵列所处的光源面引入两个倾斜轴对称相干点光源，并计算在弱物体近似下成像系统的光学传递函数，通过引入离焦来产生相衬图像，使待测样品的相位信息可以被传递到离焦强度图像中；
步骤三，轴对称相干点光源到离散环状点光源的拓展，即任何关于轴对称的照明光源图案都被分解为许多半径不同的轴对称离散相干点光源，其光学传递函数被当成是每一对倾斜轴对称相干点光源的非相干叠加，即可得到离散情况下的环状点光源的光学传递函数；
步骤四，原始图像采集，环状LED照明图案与物镜光瞳内切时，沿光线传播方向移动载物台并利用相机采集两幅离焦强度图像与一幅聚焦位置强度图；
步骤五，定量相位反卷积重构，将由相机采集的三幅强度图像进行中心轴向差分，去除强度图像中的对于吸收率的成分，并对其进行傅里叶变换，在频域中除以相位的传递函数，加上正则化参数防止除零的情况发生，再对整体进行逆傅里叶变换，即可得到基于环状LED照明下的定量相位显微图像。
本发明与现有技术相比，其显著优点：(1)推导出了在部分相干照明情况下倾斜轴对称点光源的系统相位传递函数，并推广运用到离散环状点光源的光学传递函数。(2)提出了离散情况下的环状照明模式，并将此照明模式运用到定量相位的成像方法中。(3)将环状照明引入显微成像系统中，并且在成像系统中加入了聚光镜，不仅提升了系统的光能利用率，而且使系统照明数值孔径达0.95以上。(4)LED阵列的可编程控制方式使环状照明孔径灵活可调，以适用于不同数值孔径的显微物镜，提高了系统的兼容性和灵活性。
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
附图说明
图1是相干照明、部分相干照明与离散环状照明成像系统的光源图案示意图。
图2是基于环状可编程LED照明的定量相位成像的显微镜光路示意图。
图3是在不同离焦距离下对应各种不同照明光源模式的系统相位传递函数对比示意图。
图4为本发明显微成像方法的流程示意图。
图5为本发明成像方法对人肺癌细胞的定量相位成像结果示意图。
图6为利用本发明成像方法和高数值孔径的显微物镜得到的高分辨率人宫颈癌细胞的定量相位示意图。
具体实施方式
如图2所示，本发明是基于环状可编程LED照明的高效率定量相位显微成像系统，该成像系统的实际硬件平台包括LED阵列、载物台、聚光镜、待测样品、显微物镜、成像筒镜、相机，本系统采用了环状照明图案并在光路中加入了聚光镜。其中LED阵列放置在聚光镜的前焦面位置，并且LED阵列的中心处于显微物镜的光轴上，显微物镜的后焦面与成像筒镜的前焦面重合，相机的成像平面放置在成像筒镜的后焦面位置；成像时载物台上的待测样品调节到显微物镜的前焦面位置，构成无穷远校正成像系统。环状照明图案显示在所述LED阵列上，每个被点亮的LED单元发出的光经过聚光镜汇聚变成部分相干光线照射在待测样品上，该待测样品被放置在载物台上，光线透过待测样品，经过成像筒镜汇聚后照射相机的成像平面，再沿光轴方向移动载物台并采集三幅强度图像。
为了满足成像方法所需的最小频域采样率，所述的显微物镜数值孔径为NAobj，环状照明图案上每个被点亮的LED单元到LED阵列中心的距离为l，且满足其中f为聚光镜的焦距，一般在10-20mm之间。显微物镜放大率为Mag，相机像元尺寸为Δxcam，照明光线的波长为λ，且满足本发明中为了满足不同数值孔径的显微物镜的需求，环状照明图案半径大小可通过重新编程的方法来改变大小，即满足条件此时照明圆环半径大小始终与物镜数值孔径相匹配，如图1(d)所示。
LED阵列中包括若干个(至少261个)LED单元，它们等间隔排布形成一个二维阵列。其中每个LED单元均为红绿蓝三色LED单元，其典型波长为红光633nm、绿光525nm和蓝光465nm。每个LED单元之间中心间距d典型值1-4mm。LED阵列并不需要进行单独加工，一般在市场上可直接购置。表1给出了一个市面上可购置的LED阵列的产品参数。在此LED阵列中，LED单元共有32行、32列，一共1024个，每个LED单元的亮度在2000cd/m2以上。
表1 LED阵列的物理参数
LED阵列中每个LED单元均可通过单独点亮，点亮LED单元的具体方法为现有常规技术，实现电路可以采用(但不限于)单片机、ARM、或者可编程逻辑器件等现有技术即可实现，具体实现方法可参考相关文献(如郭宝增,邓淳苗：基于FPGA的LED显示屏控制系统设计[J].液晶与显示,2010,25(3):424-428)。
本发明利用上述基于环状可编程LED照明的成像系统实现高效率定量相位显微成像方法步骤如下：
步骤一，对部分相干照明系统的光学传递函数进行推导。在照明光源与显微物镜的光瞳函数是关于光轴对称情况下，推导在部分相干照明成像系统中弱物体近似下的光学传递函数表达式。
具体实施过程为：在基于环状可编程LED照明的高效率定量相位显微成像系统构成的无穷远校正成像系统中，对于非相干照明((σ＞＞1))来说，在相机的成像平面所采集的强度图像为
其中，r为空域中的二维变量，h(r)为成像系统的振幅点扩散函数，t(r)为物体的复振幅，Iu(r)表示在光源面上所有点光源产生的强度的叠加。
而对于相干照明成像系统来说光强图像则可表示为
对于一个部分相干成像系统来说，在相机成像平面所采集的光强与成像系统之间的关系可表示为
其中a0为复振幅中的振幅平均值，TCC(0；0)是入射光线对物体的透射分量，φ(u)表示物体相位的傅里叶变换，而TCC(u；0)则可用弱物体近似下的光学传递函数WOTF来描述：
WOTF(u)≡TCC(u；0)＝∫∫S(u')P(u'+u)P(u')du'
以上公式即为弱物体近似下成像系统的光学传递函数(WOTF)。其中u表示在频域极坐标系中的二维变量，u'为频域中临时积分变量，S(u)为在聚光镜的前焦面上的光源分布，P(u)为显微物镜的光瞳函数，其绝对值可表达为
其中ρP为显微物镜光瞳的归一化截止频率。
步骤二，倾斜轴对称相干点光源照明下弱物体近似相位传递函数推导。当照明由圆形部分相干照明图案退化为倾斜轴对称相干点光源，即两个轴对称的离散相干光源分别内切在物镜光瞳的边缘。从LED阵列所处的光源面引入两个倾斜轴对称相干点光源，并计算在弱物体近似下成像系统的光学传递函数，通过引入离焦来产生相衬图像，使待测样品的相位信息可以被传递到离焦强度图像中。
具体实施过程为：如果光源分布S(u)与显微物镜光瞳P(u)是轴对称分布的，WOTF是实函数并且是偶函数，样品在聚焦位置处的相位信息并不能被传递到光强信息中。通过轴向离焦的方式在WOTF中引入相衬与虚部分量，在显微物镜的后焦面处的光瞳函数可表达为
将此光瞳函数代入WOTF，即可得到在离焦情况下的复光学传递函数：
其中振幅的传递函数HA(u)和相位传递函数HP(u)分别对应着WOTF的实数部分和虚数部分，可表示为：
HA(u)＝2a0Re[WOTF(u)]
HP(u)＝2a0Im[WOTF(u)]
上式中Re和Im分别表示对函数求取实部与虚部。在LED阵列所处的光源面引入两个倾斜轴对称相干点光源，其光源分布S(u)为
S(u)＝δ(u-ρs)+δ(u+ρs)
其中δ表示单位冲激函数，ρs为点光源到光源中心的频率归一化距离。将S(u)代入WOTF中，并且不同点光源到中心距离对应不同情况下的光源分布，当ρs≠0时光源产生两轴对称倾斜照明光，此时的相位传递函数为：
其中|P(u-ρs)|和|P(u+ρs)|为一对被倾斜点光源移位的物镜光瞳函数。而当ρs＝0时两个被移动的光瞳函数在中心位置彼此重叠，此时便对应着相干情况下的相位传递函数，当引入傍轴近似与弱离焦近似时相干情况下的相位传递函数便可推导到光强传输方程在频域中的传递函数：
Hp(u)＝|P(u)|sin(πλz|u|2)≈|P(u)|πλz|u|2。
步骤三，轴对称相干点光源到离散环状点光源的扩展。在相干模式分解理论中，任何关于轴对称的照明光源图案都可以被分解为许多半径不同的轴对称离散相干点光源。其光学传递函数可以被当成是每一对倾斜轴对称相干点光源的非相干叠加，即可得到离散情况下的环状点光源的光学传递函数。
具体实施过程为：任何关于轴对称的部分相干照明的光源图案都可以被分解为许多轴对称相干点光源，其光学传递函数可以被当成是每一对倾斜轴对称相干点光源的非相干叠加。最终显示在LED阵列上的环状光源表示为：
其中N为被点亮的LED数量，在频域中每一个被点亮的LED光源到LED阵列的中心距离为ρp，即环状LED照明图案基本内切与显微物镜光瞳，如图1(d)所示。为了满足成像方法所需的最小频域采样率，所采用的显微物镜数值孔径为NAobj，其放大倍率为Mag，相机像元尺寸为Δxcam，这几者之间满足利用相干模式分解理论可以得到在离散情况下的环状LED照明的相位传递函数。
如图3所示，通过对比不同光源的照明模式在光学系统中的相位传递函数响应幅值大小，离散环状点光源(图3(b)和图3(d))的相位传递函数在归一化空间频率内基本上是相对平坦的常数并且没有过零点(传递函数过零点的会导致过零点附近的空间频率无法恢复，所以应尽量避免函数过零点的出现)；由于4颗LED组成的环状照明无法保证该传递函数在大部分方向保证足够的响应，所以从图3(d)可以看出该二维相位传递函数基本可以保证大部分方向上的频谱响应覆盖；图3(a)中所示的相干照明情况下的相位传递函数响应虽然幅值较大，但是其空间频率被物镜限制在相干衍射极限，导致最终的相位重构分辨减低；图3(c)中的相位传递函数虽然可以将传递函数的截止频率拓展至两倍物镜空间频率，但是其响应幅值在10-3左右，即在相干系数σ＝0.99的传统圆形科勒照明下，所产生相位对比度是不足以被相机探测到的，导致重构信噪比非常低。
当成像系统切换到不同数值孔径的显微物镜时，通过对LED阵列重新编程改变环状照明图案使其重新内切与显微物镜光瞳，即满足条件此时照明圆环半径大小始终与物镜数值孔径相匹配，计算此时光学成像系统参数对应的环状照明的相位传递函数。
步骤四，原始图像采集。将环状LED光源作为定量相位显微成像系统的照明光源，环状LED照明图案与物镜光瞳内切时，沿光线传播方向移动载物台并利用相机采集两幅离焦强度图像与一幅聚焦位置强度图。
步骤五，定量相位反卷积重构。将由相机采集的三幅强度图像进行中心轴向差分，去除强度图像中的对于吸收率的成分，并对其进行傅里叶变换，在频域中除以相位的传递函数，加上正则化参数防止除零的情况发生，再对整体进行逆傅里叶变换，即可得到基于环状LED照明下的定量相位显微图像。
具体实施过程为：传统的光强传输方程可表示为：
其中I(r)为在聚焦面上的光强分布，φ(r)为待测物体的相位。此光强传输方程可利用泊松方程快速傅里叶变换求解并且可写成频域拉普拉斯滤波形式
其中分别为弱离焦情况下采集的三幅光强图像的傅里叶变换，而1/(πλz|u|2)为逆拉普拉斯形式对应着相干照明和弱离焦近似的情况下的相位传递函数的逆形式。而对更一般的部分相干照明来说，弱物体近似的光学传递函数的正向形式为：
其中系统的相位传递函数对应着弱物体近似下的光学传递函数的虚部，通过相位传递函数的逆形式，便可得到物体定量相位的傅里叶变换，在进行逆傅里叶变换即可得到在环状LED照明下的定量相位分布
其中表示逆傅里叶变换，参数α表示正则化参数，通常其为一较小的值，防止出现分母为零的情况。
通过以上步骤和流程，如图4所示的重构流程图，将本发明成像方法运用于未染色人类癌细胞的定量相位成像。图5是本发明成像方法对人肺癌细胞的定量相位成像结果，其中图5(a1)与图5(a2)分别为相干照明和环状照明下的整个相机成像区域上定量相位结果；从图5(a)中选取三个子区域定量相位并计算其相位梯度图像作对比，如图5(b)、图5(c)和图5(d)，可看到环状照明情况下的相位成像分辨率是高于传统的相干照明情况的。在两种照明情况下的三个相位子区域中分别选取两点，并绘制两点之间的相位变化曲线，从这些曲线变化可以看出环状照明方案比传统的相干照明下的分辨率高出一倍(在第一幅相位一维剖线图中，三角形虚线的变化孔径频率是原点实线的两倍)，所以本发明所提出基于环状LED照明可达到两倍于物镜的成像分辨率。图6为利用本发明成像方法与高数值孔径的显微物镜所得到的人体宫颈癌细胞的高分辨率定量相位图与高分辨率相位梯度图。其中显微物镜的数值孔径为0.75，环状照明图案通过重新编程的方式与物镜光瞳内切，最终达到的成像分辨率为两倍物镜分辨率。通过选取三个子区域进行放大，如图6(c1)-(c3)，可以清晰地观察到宫颈癌细胞核质与细胞质中的颗粒状细胞器。

Claims (5)

1.一种基于环状可编程LED照明的高效率定量相位显微成像方法，其特征在于步骤如下：
步骤一，对部分相干成像系统的光学传递函数进行推导，在照明光源与显微物镜的光瞳函数是关于光轴对称情况下，推导在部分相干照明成像系统中弱物体近似下的光学传递函数表达式；
步骤二，倾斜轴对称相干点光源照明下弱物体近似相位传递函数推导，当照明由圆形部分相干照明图案退化为倾斜轴对称相干点光源，即两个轴对称的离散相干光源分别内切在物镜光瞳的边缘，从LED阵列所处的光源面引入两个倾斜轴对称相干点光源，并计算在弱物体近似下成像系统的光学传递函数，通过引入离焦来产生相衬图像，使待测样品的相位信息可以被传递到离焦强度图像中；
步骤三，轴对称相干点光源到离散环状点光源的拓展，即任何关于轴对称的照明光源图案都被分解为许多半径不同的轴对称离散相干点光源，其光学传递函数被当成是每一对倾斜轴对称相干点光源的非相干叠加，即可得到离散情况下的环状点光源的光学传递函数；
步骤四，原始图像采集，环状LED照明图案与物镜光瞳内切时，沿光线传播方向移动载物台并利用相机采集两幅离焦强度图像与一幅聚焦位置强度图；
步骤五，定量相位反卷积重构，将由相机采集的三幅强度图像进行中心轴向差分，去除强度图像中的对于吸收率的成分，并对其进行傅里叶变换，在频域中除以相位的传递函数，加上正则化参数防止除零的情况发生，再对整体进行逆傅里叶变换，即可得到基于环状LED照明下的定量相位显微图像。
2.根据权利要求1所述的基于环状可编程LED照明的高效率定量相位显微成像方法，其特征在于在步骤一中，在基于环状可编程LED照明的高效率定量相位显微成像系统构成的无穷远校正成像系统中，对于非相干照明而言，在相机的成像平面所采集的强度图像为
<mrow> <mi>I</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>=</mo> <mo>|</mo> <mi>h</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mo>)</mo> </mrow> <msup> <mo>|</mo> <mn>2</mn> </msup> <mo>&amp;CircleTimes;</mo> <mo>|</mo> <mi>t</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mo>)</mo> </mrow> <msup> <mo>|</mo> <mn>2</mn> </msup> <mo>=</mo> <mo>|</mo> <mi>h</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mo>)</mo> </mrow> <msup> <mo>|</mo> <mn>2</mn> </msup> <mo>&amp;CircleTimes;</mo> <msub> <mi>I</mi> <mi>u</mi> </msub> <mrow> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mo>)</mo> </mrow> </mrow>
其中，r为空域中的二维变量，h(r)为成像系统的振幅点扩散函数，t(r)为物体的复振幅，Iu(r)表示在光源面上所有点光源产生的强度的叠加；
而对于相干照明成像系统来说光强图像则可表示为
<mrow> <mi>I</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>=</mo> <mo>|</mo> <mi>h</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>&amp;CircleTimes;</mo> <mi>t</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mo>)</mo> </mrow> <msup> <mo>|</mo> <mn>2</mn> </msup> </mrow>
对于一个部分相干成像系统来说，在相机成像平面所采集的光强与成像系统之间的关系表示为
<mrow> <mi>I</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>=</mo> <msubsup> <mi>a</mi> <mn>0</mn> <mn>2</mn> </msubsup> <mi>T</mi> <mi>C</mi> <mi>C</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mn>0</mn> <mo>;</mo> <mn>0</mn> <mo>)</mo> </mrow> <mo>+</mo> <mn>2</mn> <msub> <mi>a</mi> <mn>0</mn> </msub> <mi>Re</mi> <mo>{</mo> <mo>&amp;Integral;</mo> <mi>T</mi> <mi>C</mi> <mi>C</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>;</mo> <mn>0</mn> <mo>)</mo> </mrow> <mo>&amp;lsqb;</mo> <mi>&amp;Delta;</mi> <mi>a</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>+</mo> <msub> <mi>ia</mi> <mn>0</mn> </msub> <mi>&amp;phi;</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>&amp;rsqb;</mo> <mi>exp</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>i</mi> <mn>2</mn> <mi>&amp;pi;</mi> <mi>r</mi> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mi>d</mi> <mi>u</mi> <mo>}</mo> </mrow>
其中a0为复振幅中的振幅平均值，TCC(0；0)是入射光线对物体的透射分量，φ(u)表示物体相位的傅里叶变换，而TCC(u；0)则可用弱物体近似下的光学传递函数WOTF来描述：
WOTF(u)≡TCC(u；0)＝∫∫S(u')P(u'+u)P(u')du'
以上公式即为弱物体近似下成像系统的光学传递函数WOTF，其中u表示在频域极坐标系中的二维变量，S(u)为在聚光镜的前焦面上的光源分布，P(u)为显微物镜的光瞳函数，其绝对值可表达为
<mrow> <mo>|</mo> <mi>P</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>|</mo> <mo>=</mo> <mfenced open = "{" close = ""> <mtable> <mtr> <mtd> <mrow> <mn>1</mn> <mo>,</mo> </mrow> </mtd> <mtd> <mrow> <mi>i</mi> <mi>f</mi> <mi> </mi> <mi>u</mi> <mo>&amp;le;</mo> <msub> <mi>&amp;rho;</mi> <mi>P</mi> </msub> </mrow> </mtd> </mtr> <mtr> <mtd> <mrow> <mn>0</mn> <mo>,</mo> </mrow> </mtd> <mtd> <mrow> <mi>i</mi> <mi>f</mi> <mi> </mi> <mi>u</mi> <mo>&gt;</mo> <msub> <mi>&amp;rho;</mi> <mi>P</mi> </msub> </mrow> </mtd> </mtr> </mtable> </mfenced> </mrow>
其中ρP为显微物镜光瞳的归一化截止频率。
3.根据权利要求1所述的基于环状可编程LED照明的高效率定量相位显微成像方法，其特征在于步骤二中，如果光源分布S(u)与显微物镜光瞳P(u)是轴对称分布的，WOTF是实函数并且是偶函数，样品在聚焦位置处的相位信息并不能被传递到光强信息中，通过轴向离焦的方式在WOTF中引入相衬与虚部分量，在显微物镜的后焦面处的光瞳函数表达为
<mrow> <mi>P</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>=</mo> <mo>|</mo> <mi>P</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>|</mo> <msup> <mi>e</mi> <mrow> <mi>i</mi> <mi>k</mi> <mi>z</mi> <msqrt> <mrow> <mn>1</mn> <mo>-</mo> <msup> <mi>&amp;lambda;</mi> <mn>2</mn> </msup> <mo>|</mo> <mi>u</mi> <msup> <mo>|</mo> <mn>2</mn> </msup> </mrow> </msqrt> </mrow> </msup> <mo>,</mo> <mo>|</mo> <mi>u</mi> <mo>|</mo> <mi>&amp;lambda;</mi> <mo>&amp;le;</mo> <mn>1</mn> </mrow>
将此光瞳函数代入WOTF，即可得到在离焦情况下的复光学传递函数：
<mrow> <mi>W</mi> <mi>O</mi> <mi>T</mi> <mi>F</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>=</mo> <mi>S</mi> <mrow> <mo>(</mo> <msup> <mi>u</mi> <mo>&amp;prime;</mo> </msup> <mo>)</mo> </mrow> <mo>|</mo> <msup> <mi>P</mi> <mo>*</mo> </msup> <mrow> <mo>(</mo> <msup> <mi>u</mi> <mo>&amp;prime;</mo> </msup> <mo>)</mo> </mrow> <mo>|</mo> <mo>|</mo> <mi>P</mi> <mrow> <mo>(</mo> <msup> <mi>u</mi> <mo>&amp;prime;</mo> </msup> <mo>+</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>|</mo> <mi>exp</mi> <mo>&amp;lsqb;</mo> <mi>i</mi> <mi>k</mi> <mi>z</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mo>-</mo> <msqrt> <mrow> <mn>1</mn> <mo>-</mo> <msup> <mi>&amp;lambda;</mi> <mn>2</mn> </msup> <mo>|</mo> <msup> <mi>u</mi> <mo>&amp;prime;</mo> </msup> <msup> <mo>|</mo> <mn>2</mn> </msup> </mrow> </msqrt> <mo>+</mo> <msqrt> <mrow> <mn>1</mn> <mo>-</mo> <msup> <mi>&amp;lambda;</mi> <mn>2</mn> </msup> <mo>|</mo> <mi>u</mi> <mo>+</mo> <msup> <mi>u</mi> <mo>&amp;prime;</mo> </msup> <msup> <mo>|</mo> <mn>2</mn> </msup> </mrow> </msqrt> <mo>)</mo> </mrow> <mo>&amp;rsqb;</mo> <msup> <mi>du</mi> <mo>&amp;prime;</mo> </msup> </mrow>
其中振幅的传递函数HA(u)和相位传递函数HP(u)分别对应着WOTF的实数部分和虚数部分，表示为：
HA(u)＝2a0Re[WOTF(u)]
HP(u)＝2a0Im[WOTF(u)]
上式中Re和Im分别表示对函数求取实部与虚部；
在LED阵列所处的光源面引入两个倾斜轴对称相干点光源，其光源分布S(u)为
S(u)＝δ(u-ρs)+δ(u+ρs)
其中δ表示单位冲激函数，ρs为点光源到光源中心的频率归一化距离，将S(u)代入WOTF中，并且不同点光源到中心距离对应不同情况下的光源分布，当ρs≠0时光源产生两轴对称倾斜照明光，此时的相位传递函数为：
<mrow> <msub> <mi>H</mi> <mi>p</mi> </msub> <msub> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mrow> <mi>o</mi> <mi>b</mi> <mi>l</mi> </mrow> </msub> <mo>=</mo> <mo>|</mo> <mi>P</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>-</mo> <msub> <mi>&amp;rho;</mi> <mi>s</mi> </msub> <mo>)</mo> </mrow> <mo>|</mo> <mi>sin</mi> <mo>&amp;lsqb;</mo> <mi>k</mi> <mi>z</mi> <mrow> <mo>(</mo> <msqrt> <mrow> <mn>1</mn> <mo>-</mo> <msup> <mi>&amp;lambda;</mi> <mn>2</mn> </msup> <mo>|</mo> <mi>u</mi> <mo>-</mo> <msub> <mi>&amp;rho;</mi> <mi>s</mi> </msub> <msup> <mo>|</mo> <mn>2</mn> </msup> </mrow> </msqrt> <mo>-</mo> <msqrt> <mrow> <mn>1</mn> <mo>-</mo> <msup> <mi>&amp;lambda;</mi> <mn>2</mn> </msup> <mo>|</mo> <msub> <mi>&amp;rho;</mi> <mi>s</mi> </msub> <msup> <mo>|</mo> <mn>2</mn> </msup> </mrow> </msqrt> <mo>)</mo> </mrow> <mo>&amp;rsqb;</mo> <mo>+</mo> <mo>|</mo> <mi>P</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>+</mo> <msub> <mi>&amp;rho;</mi> <mi>s</mi> </msub> <mo>)</mo> </mrow> <mo>|</mo> <mi>sin</mi> <mo>&amp;lsqb;</mo> <mi>k</mi> <mi>z</mi> <mrow> <mo>(</mo> <msqrt> <mrow> <mn>1</mn> <mo>-</mo> <msup> <mi>&amp;lambda;</mi> <mn>2</mn> </msup> <mo>|</mo> <mi>u</mi> <mo>+</mo> <msub> <mi>&amp;rho;</mi> <mi>s</mi> </msub> <msup> <mo>|</mo> <mn>2</mn> </msup> </mrow> </msqrt> <mo>-</mo> <msqrt> <mrow> <mn>1</mn> <mo>-</mo> <msup> <mi>&amp;lambda;</mi> <mn>2</mn> </msup> <mo>|</mo> <msub> <mi>&amp;rho;</mi> <mi>s</mi> </msub> <msup> <mo>|</mo> <mn>2</mn> </msup> </mrow> </msqrt> <mo>)</mo> </mrow> <mo>&amp;rsqb;</mo> </mrow>
其中|P(u-ρs)|和|P(u+ρs)|为一对被倾斜点光源移位的物镜光瞳函数；而当ρs＝0时两个被移动的光瞳函数在中心位置彼此重叠，此时便对应着相干情况下的相位传递函数，当引入傍轴近似与弱离焦近似时相干情况下的相位传递函数便推导到光强传输方程在频域中的传递函数：
Hp(u)＝|P(u)|sin(πλz|u|2)≈|P(u)|πλz|u|2。
4.根据权利要求1所述的基于环状可编程LED照明的高效率定量相位显微成像方法，其特征在于步骤三中：任何关于轴对称的部分相干照明的光源图案都被分解为许多轴对称相干点光源，其光学传递函数被当成是每一对倾斜轴对称相干点光源的非相干叠加，最终显示在LED阵列上的环状光源表示为：
<mrow> <mi>S</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>=</mo> <munderover> <mo>&amp;Sigma;</mo> <mrow> <mi>i</mi> <mo>=</mo> <mn>0</mn> </mrow> <mi>N</mi> </munderover> <mi>&amp;delta;</mi> <mrow> <mo>(</mo> <msub> <mi>u</mi> <mi>i</mi> </msub> <mo>)</mo> </mrow> <mo>,</mo> <mo>|</mo> <msub> <mi>u</mi> <mi>i</mi> </msub> <mo>|</mo> <mo>&amp;ap;</mo> <mo>|</mo> <msub> <mi>&amp;rho;</mi> <mi>p</mi> </msub> <mo>|</mo> </mrow>
其中N为被点亮的LED数量，在频域中每一个被点亮的LED光源到LED阵列的中心距离为ρp，即环状LED照明图案基本内切与显微物镜光瞳；为了满足成像所需的最小频域采样率，所采用的显微物镜数值孔径为NAobj，其放大倍率为Mag，相机像元尺寸为Δxcam，这几者之间满足利用相干模式分解理论得到在离散情况下的环状LED照明的相位传递函数；
当成像系统切换到不同数值孔径的显微物镜时，通过对LED阵列重新编程改变环状照明图案使其重新内切与显微物镜光瞳，即满足条件此时照明圆环半径大小始终与物镜数值孔径相匹配，计算此时光学成像系统参数对应的环状照明的相位传递函数。
5.根据权利要求1所述的基于环状可编程LED照明的高效率定量相位显微成像方法，其特征在于步骤五中，传统的光强传输方程表示为：
<mrow> <mo>-</mo> <mi>k</mi> <mfrac> <mrow> <mo>&amp;part;</mo> <mi>I</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mo>)</mo> </mrow> </mrow> <mrow> <mo>&amp;part;</mo> <mi>z</mi> </mrow> </mfrac> <mo>=</mo> <mo>&amp;dtri;</mo> <mo>&amp;CenterDot;</mo> <mo>&amp;lsqb;</mo> <mi>I</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>&amp;dtri;</mo> <mi>&amp;phi;</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>r</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>&amp;rsqb;</mo> </mrow>
其中I(r)为在聚焦面上的光强分布，φ(r)为待测物体的相位，此光强传输方程利用泊松方程快速傅里叶变换求解并且可写成频域拉普拉斯滤波形式
<mrow> <mfrac> <mrow> <msub> <mover> <mi>I</mi> <mo>~</mo> </mover> <mn>1</mn> </msub> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>-</mo> <msub> <mover> <mi>I</mi> <mo>~</mo> </mover> <mn>2</mn> </msub> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> </mrow> <mrow> <mn>4</mn> <mover> <mi>I</mi> <mo>~</mo> </mover> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> </mrow> </mfrac> <mo>=</mo> <mrow> <mo>(</mo> <mi>&amp;pi;</mi> <mi>&amp;lambda;</mi> <mi>z</mi> <mo>|</mo> <mi>u</mi> <msup> <mo>|</mo> <mn>2</mn> </msup> <mo>)</mo> </mrow> <mover> <mi>&amp;phi;</mi> <mo>~</mo> </mover> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> </mrow>
其中分别为弱离焦情况下采集的三幅光强图像的傅里叶变换，而1/(πλz|u|2)为逆拉普拉斯形式对应着相干照明和弱离焦近似的情况下的相位传递函数的逆形式，而对更一般的部分相干照明来说，弱物体近似的光学传递函数的正向形式为：
<mrow> <mfrac> <mrow> <msub> <mover> <mi>I</mi> <mo>~</mo> </mover> <mrow> <mi>&amp;Delta;</mi> <mn>2</mn> </mrow> </msub> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>-</mo> <msub> <mover> <mi>I</mi> <mo>~</mo> </mover> <mrow> <mo>-</mo> <mi>&amp;Delta;</mi> <mn>2</mn> </mrow> </msub> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> </mrow> <mrow> <mn>4</mn> <msub> <mover> <mi>I</mi> <mo>~</mo> </mover> <mn>0</mn> </msub> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> </mrow> </mfrac> <mo>=</mo> <mi>Im</mi> <mo>&amp;lsqb;</mo> <mi>W</mi> <mi>O</mi> <mi>T</mi> <mi>F</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>&amp;rsqb;</mo> <mover> <mi>&amp;phi;</mi> <mo>~</mo> </mover> <mrow> <mo>(</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo> </mrow> </mrow>
其中成像系统的相位传递函数对应着弱物体近似下的光学传递函数的虚部，通过相位传递函数的逆形式，便可得到物体定量相位的傅里叶变换，在进行逆傅里叶变换即可得到在环状LED照明下的定量相位分布
其中表示逆傅里叶变换，参数α表示正则化参数。
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