CN107245478B - 一种南瓜抗坏血酸氧化酶的提取纯化方法 - Google Patents

一种南瓜抗坏血酸氧化酶的提取纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种南瓜抗坏血酸氧化酶的提取纯化方法，将青皮南瓜洗净后加入食盐，再粉碎得到粉碎液；将粉碎液经固液分离，所得分离液用板框过滤得到澄清液；在所得澄清液中加入所得吸附颗粒，搅拌后，经固液分离得到清液，再经浓缩、灭菌、干燥，即得干燥的抗坏血酸氧化酶。本发明能有效去除叶绿素，提高抗坏血酸氧化酶产品的纯度。生产过程中产物易与水分离，便于按需要的活性获得浓缩液，且灭菌效果好，产品合格率高。本发明工艺条件温和，方法简便，生产成本低，过程易于控制，对设备要求低，能耗低。本发明所得抗坏血酸氧化酶产品收率达80％以上，纯度达99％以上。

Description

一种南瓜抗坏血酸氧化酶的提取纯化方法
技术领域
本发明涉及一种南瓜抗坏血酸氧化酶的提取纯化方法。
背景技术
抗坏血酸氧化酶(ASO)是以分子氧为底物的氧化酶类，它隶属于蓝色氧化酶类，酶分子活性部位含有多个金属铜离子，在催化还原性有机底物单电子氧化的同时，为氧分子(O2)提供四个电子，将其直接还原成H2O。国际酶学委员会将其命名为L-抗坏血酸:O2氧化还原酶，编号为：EC 1.10.3.3。ASO对还原性底物要求较高，仅作用于L-抗坏血酸和其它有在羰基邻近含烯二醇基团的内酯环结构的化合物。ASO广泛存在于自然界，已从南瓜、黄瓜、柑桔等多种植物和微生物中得以纯化，许多研究集中在酶的分离纯化、细胞定位、分子结构、理化性质、催化机制和酶学特征，已阐明其三维结构、糖链结构和铜结合位点，已从南瓜和黄瓜中克隆出该酶的cDNA，并和其它含铜化酶的一级结构比较了同源性。
目前，通过南瓜提取纯化得到ASO的方法中还存在产品纯度不高，叶绿素难以去除等问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种南瓜抗坏血酸氧化酶的提取纯化方法，以更优化地去除叶绿素。
本发明通过下列技术方案实现：一种南瓜抗坏血酸氧化酶的提取纯化方法，经过下列各步骤：
(1)将青皮南瓜洗净后削皮，以瓜皮为原料，加入瓜皮质量1～3％的食盐，再按固液质量比为1:2加水混合后粉碎，得到粉碎液；
(2)将步骤(1)所得粉碎液经固液分离，所得分离液用醋酸调节pH值至5.0，再用板框过滤得到澄清液；
(3)按水：乙醇：纳米级硫酸铜：氨水的体积比为40～60：2～10：25～45：2～10，将氨水、乙醇、水和纳米级硫酸铜混合后，在室温下搅拌10～16小时，再加入硝酸溶液调节pH值为4～6，并继续搅拌70～120分钟，经离心清洗后，即得到表面改性的微球；将所得表面改性的微球超声分散到0.01mol/L的硝酸溶液中，在搅拌情况下，按微球质量的0.05～1％加入聚乙二醇-4000，然后按微球质量的2～50倍加入柠檬酸，搅拌30～90分钟以上，用去离子水离心沉积和超声分散循环的清洗方式，去除所得微球的反应残余物，即得到吸附颗粒；
(4)按固液比mg/L计为1:4～10，在步骤(2)所得澄清液中加入步骤(3)所得吸附颗粒，搅拌60～120分钟后，经固液分离得到清液；
(5)浓缩：用8000K～10000K的卷式膜浓缩机浓缩，按需要的活性确定浓缩倍数，即可得到浓缩液；
(6)灭菌：用0.45u孔径的膜过滤机把细菌过滤掉，得到无菌浓缩液(细菌的分子量都在0.6u以上)；
(7)干燥：用冷冻真空干燥机把无菌的浓缩液冻干即得干燥的抗坏血酸氧化酶。
所述步骤(3)的聚乙二醇-4000和柠檬酸为市购分析纯产品。
所述步骤(4)的搅拌由超声波震荡操作替代。
所得干燥的抗坏血酸氧化酶用80目的粉碎机打粉，经检测活性、微生物指标合格后即为成品。
本发明具备的优点及效果：本发明通过板框过滤、吸附颗粒结合膜过滤，能有效去除叶绿素，提高抗坏血酸氧化酶产品的纯度。生产过程中产物易与水分离，便于按需要的活性获得浓缩液，且灭菌效果好，产品合格率高。本发明工艺条件温和，方法简便，生产成本低，过程易于控制，对设备要求低，能耗低。本发明所得抗坏血酸氧化酶产品收率达80％以上，纯度达99％以上。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
(1)将青皮南瓜洗净后削皮，以瓜皮为原料，加入瓜皮质量2％的食盐，再按固液质量比为1:2加水混合后粉碎，得到粉碎液；
(2)将步骤(1)所得粉碎液经固液分离，所得分离液用醋酸调节pH值至5.0，再用板框过滤得到澄清液；
(3)按水：乙醇：纳米级硫酸铜：氨水的体积比为50：6：35：5，将氨水、乙醇、水和纳米级硫酸铜混合后，在室温下搅拌12小时，再加入硝酸溶液调节pH值为5，并继续搅拌100分钟，经离心清洗后，即得到表面改性的微球；将所得表面改性的微球超声分散到0.01mol/L的硝酸溶液中，在搅拌情况下，按微球质量的0.5％加入聚乙二醇-4000，然后按微球质量的30倍加入柠檬酸，搅拌60分钟以上，用去离子水离心沉积和超声分散循环的清洗方式，去除所得微球的反应残余物，即得到吸附颗粒；
(4)按固液比mg/L计为1:6，在步骤(2)所得澄清液中加入步骤(3)所得吸附颗粒，搅拌80分钟后，经固液分离得到清液；
(5)浓缩：用9000K的卷式膜浓缩机浓缩，按需要的活性确定浓缩倍数，即可得到浓缩液；
(6)灭菌：用0.45u孔径的膜过滤机把细菌过滤掉，得到无菌浓缩液(细菌的分子量都在0.6u以上)；
(7)干燥：用冷冻真空干燥机把无菌的浓缩液冻干即得干燥的抗坏血酸氧化酶。
实施例2
(1)将青皮南瓜洗净后削皮，以瓜皮为原料，加入瓜皮质量1％的食盐，再按固液质量比为1:2加水混合后粉碎，得到粉碎液；
(2)将步骤(1)所得粉碎液经固液分离，所得分离液用醋酸调节pH值至5.0，再用板框过滤得到澄清液；
(3)按水：乙醇：纳米级硫酸铜：氨水的体积比为40：2：25：2，将氨水、乙醇、水和纳米级硫酸铜混合后，在室温下搅拌10小时，再加入硝酸溶液调节pH值为4，并继续搅拌70分钟，经离心清洗后，即得到表面改性的微球；将所得表面改性的微球超声分散到0.01mol/L的硝酸溶液中，在搅拌情况下，按微球质量的0.05％加入聚乙二醇-4000，然后按微球质量的2倍加入柠檬酸，搅拌30分钟以上，用去离子水离心沉积和超声分散循环的清洗方式，去除所得微球的反应残余物，即得到吸附颗粒；
(4)按固液比mg/L计为1:4，在步骤(2)所得澄清液中加入步骤(3)所得吸附颗粒，超声波震荡60分钟后，经固液分离得到清液；
(5)浓缩：用8000K的卷式膜浓缩机浓缩，按需要的活性确定浓缩倍数，即可得到浓缩液；
(6)灭菌：用0.45u孔径的膜过滤机把细菌过滤掉，得到无菌浓缩液(细菌的分子量都在0.6u以上)；
(7)干燥：用冷冻真空干燥机把无菌的浓缩液冻干即得干燥的抗坏血酸氧化酶。
实施例3
(1)将青皮南瓜洗净后削皮，以瓜皮为原料，加入瓜皮质量3％的食盐，再按固液质量比为1:2加水混合后粉碎，得到粉碎液；
(2)将步骤(1)所得粉碎液经固液分离，所得分离液用醋酸调节pH值至5.0，再用板框过滤得到澄清液；
(3)按水：乙醇：纳米级硫酸铜：氨水的体积比为60：10：45：10，将氨水、乙醇、水和纳米级硫酸铜混合后，在室温下搅拌16小时，再加入硝酸溶液调节pH值为6，并继续搅拌120分钟，经离心清洗后，即得到表面改性的微球；将所得表面改性的微球超声分散到0.01mol/L的硝酸溶液中，在搅拌情况下，按微球质量的1％加入聚乙二醇-4000，然后按微球质量的50倍加入柠檬酸，搅拌90分钟以上，用去离子水离心沉积和超声分散循环的清洗方式，去除所得微球的反应残余物，即得到吸附颗粒；
(4)按固液比mg/L计为1:10，在步骤(2)所得澄清液中加入步骤(3)所得吸附颗粒，搅拌120分钟后，经固液分离得到清液；
(5)浓缩：用10000K的卷式膜浓缩机浓缩，按需要的活性确定浓缩倍数，即可得到浓缩液；
(6)灭菌：用0.45u孔径的膜过滤机把细菌过滤掉，得到无菌浓缩液(细菌的分子量都在0.6u以上)；
(7)干燥：用冷冻真空干燥机把无菌的浓缩液冻干即得干燥的抗坏血酸氧化酶。
对比例1：同实施例1，仅省略步骤(2)。
对比例2：同实施例1，仅省略步骤(3)和(4)。
对比例3：同实施例1，仅省略步骤(6)。
收率 纯度 叶绿素去除率 灭菌率
对比例1 62％ 95％ 88％ 91％
对比例2 77％ 93％ 84％ 97％
对比例3 81％ 98％ 95％ 92％
实施例1 85％ 99.3％ 97％ 99.1％
实施例2 88％ 99.5％ 98％ 99.0％
实施例3 86％ 99.6％ 97％ 99.2％

Claims (3)

1.一种南瓜抗坏血酸氧化酶的提取纯化方法，其特征在于经过下列各步骤：
(1)将青皮南瓜洗净后削皮，以瓜皮为原料，加入瓜皮质量1～3％的食盐，再按固液质量比为1：2加水混合后粉碎，得到粉碎液；
(2)将步骤(1)所得粉碎液经固液分离，所得分离液用醋酸调节pH值至5.0，再用板框过滤得到澄清液；
(3)按水：乙醇：纳米级硫酸铜：氨水的体积比为40～60：2～10：25～45：2～10，将氨水、乙醇、水和纳米级硫酸铜混合后，在室温下搅拌10～16小时，再加入硝酸溶液调节pH值为4～6，并继续搅拌70～120分钟，经离心清洗后，即得到表面改性的微球；将所得表面改性的微球超声分散到0.01mol/L的硝酸溶液中，在搅拌情况下，按微球质量的0.05～1％加入聚乙二醇-4000，然后按微球质量的2～50倍加入柠檬酸，搅拌30～90分钟，用去离子水离心沉积和超声分散循环的清洗方式，去除所得微球的反应残余物，即得到吸附颗粒；
(4)按固液比mg/L计为1：4～10，在步骤(2)所得澄清液中加入步骤(3)所得吸附颗粒，搅拌60～120分钟后，经固液分离得到清液；
(5)浓缩：用8000K～10000K的卷式膜浓缩机浓缩，按需要的活性确定浓缩倍数，即可得到浓缩液；
(6)灭菌：用0.45u孔径的膜过滤机把细菌过滤掉，得到无菌浓缩液；
(7)干燥：用冷冻真空干燥机把无菌的浓缩液冻干即得干燥的抗坏血酸氧化酶。
2.根据权利要求1所述的南瓜抗坏血酸氧化酶的提取纯化方法，其特征在于：所述步骤(3)的聚乙二醇-4000和柠檬酸为市购分析纯产品。
3.根据权利要求1或2所述的南瓜抗坏血酸氧化酶的提取纯化方法，其特征在于：所述步骤(4)的搅拌由超声波震荡操作替代。
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南瓜抗坏血酸氧化酶的提取纯化及其在甜橙原汁脱氧贮藏中的应用研究;何建军;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20020615(第1期);B024-106页 *

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