CN107242138A - 一种横断雅致兜兰组培快繁及栽培的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种横断雅致兜兰的组培快繁及栽培的方法，通过蒴果采集及保存→消毒→原球茎诱导→增殖及分化培养→壮苗及生根培养→炼苗移栽→移栽大棚种植→病虫害防治等步骤，高效快速地繁育种苗。本发明建立的组培快繁技术体系，整个过程无需投入过多的基础设施，一颗授粉成功300天的蒴果经18个月可获得完整植株2000‑3000株，使用特定的培养基，种子萌发率达80%以上，投入成本低，操作简单，易于掌握，成功率高，实现了横断雅致兜兰的人工大量繁育，对濒危植物资源的再生和可持续利用及种质资源的保护都具有重要的意义。

Description

一种横断雅致兜兰组培快繁及栽培的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种横断雅致兜兰的组培快繁及栽培的方法。
背景技术
兜兰(Paphiopedilum)又称为拖鞋兰，仙履兰等，全世界目前被发现的种类约有88个种，我国有28个种。由于兜兰具有独特的花型、花色艳丽，花期长而具有极高的观赏价值，是国际花卉市场上十分流行的高档花卉。近年来由于人类活动的增加、生境片断化、过度采挖及放牧等导致兜兰的野生种群及个体数量急速下降，兜兰已成为世界上最濒危的植物物种之一，所有野生种类均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》。横断雅致兜兰(Paphiopedilum Hengduan Grace Helen)是在英国皇家园艺协会(RHS)登录的杂交种，花型独特，花色纯净艳丽且花期长，易栽培，在国际市场上广受兜兰玩家的欢迎。横断雅致兜兰同大多数兰花一样，种子无胚乳，种子细小，在自然界只能靠共生真菌提供的营养萌发生长，自然条件下很难繁殖，萌发率极低。兜兰的传统繁殖方式为分株繁殖，繁殖系数低、速度慢，难以满足产业化生产的要求，用组织培养的方法进行快繁是重要的保护及开发手段。另外合理栽培调控雅致兜兰的花期，为市场或应用需求按时提供鲜花产品，大大提高经济效益。
基于上述分析，一种投入成本低，操作简单，易于掌握，成功率高，整个过程无需投入过多的基础设施，一颗蒴果经过18个月可获得完整植株2000-3000株，种子诱导萌发率达到80%以上，能将横断雅致兜兰实现人工大量繁育的组培快繁及栽培的方法是目前行业内急需的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用横断雅致兜兰种子进行组培快繁及栽培的方法，该方法具有操作简单，操作性强，调控效果显著，易于大规模生产推广。
为实现上述目的本发明提供的技术方案如下：
一种横断雅致兜兰种子进行组培快繁及栽培的方法包括如下步骤：
（1）蒴果采集：采集自然或人工成功授粉300天的雅致兜兰蒴果，对其进行消毒；
（2）原球茎诱导：将消毒后的蒴果置于灭菌滤纸上吸干水分, 用灭菌解剖刀纵向切开蒴果, 抖出种子，将种子接种到灭菌的原球茎诱导培养基上，将培养瓶放置于20±2℃的暗环境里培养4-6周后，再转入光培养4-6周后，获得转绿且有叶原基出现的原球茎；
（3）原球茎增殖及分化培养：将上述原球茎转入增殖继代培养基中，经90-150天培养后分化为完整、健壮的无根苗；
（4）壮苗及生根培养：将健壮的无根苗转入生根壮苗培养基上，经150-180天培养后长成具有2-3条粗壮肉质根、高4~6cm的小苗，再转入生根壮苗培养基中继代一次，培养145-155d后获得高8-10cm具有4-6条粗壮肉质根的健壮植株；
（5）炼苗移栽：将培养瓶置于温室大棚炼苗1-2周后，取出生根苗，洗净根部培养基，0.1%甲基托布津或高锰酸钾溶液浸泡0.5h，800倍多菌灵溶液浸泡0.5h，种植于栽种基质中；其中大棚温度15-30℃，白天相对湿度50-80%，夜间相对湿度70-80%；
（6）大棚种植及病虫害防治：大棚种植以每年4-5月进行移栽种植最佳，栽种4-6周后，喷施叶肥或使用缓释肥，喷施药剂预防虫害，大棚种植1~2年后达到开花尺寸。
本发明还提供了一种蒴果的保存方法：采集自然或人工成功授粉300天的雅致兜兰蒴果，将花蒂剔除后对表面进行清洗，随后用75%酒精擦拭干净，置于干净滤纸上，剥开果实抖出种子，将种子置于密封的玻璃试管内于4℃环境下可保存2周，或于-20℃环境下可保存超过1年。
进一步的，所述步骤（1）中的消毒方法为：将蒴果经蒸馏水洗后，在超净工作台上先使用10%的次氯酸钠或10%安替佛民溶液消毒20 min，再使用70%酒精表面消毒30s，再以0.2%氯化汞溶液消毒15min，最后用无菌水冲洗5次，灭菌滤纸吸干果实表面的水分；所述次氯酸钠溶液现用现配。
进一步的，步骤（2）中每升原球茎诱导培养基含有如下质量的成分：
蔗糖 20.5712g
KNO3，AR 0.9500g
NH4NO3，AR 0.8250g
KH2PO4 0.0850g
MgSO4·7H2O 0.1850g
无水CaCl2 0.1660g
Na2EDTA 0.0372g
FeSO4·7H2O 0.0279g
横断微量元素 0.0185g
横断维生素 0.1140g
2(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) 1.0000g
Pepton（蛋白胨）, BR 2.0000g
Citric acid（柠檬酸） 0.0213g。
进一步的，步骤（3）中每升增殖继代培养基含有如下质量的成分：
Saccharose（蔗糖） 20.0000g
Agar（是否应为Agar琼脂） 5.0000g
Potato powder（马铃薯粉） 5.0000g
KNO3，AR 0.2000g
KH2PO4 0.2000g
MgSO4·7H2O 0.2000g
KCl 0.1000g
(NH4)3-Citrate（柠檬酸铵） 0.0190g
横断微量元素 0.0185g
横断维生素 0.1200g
Caseinhydrolysate（水解酪蛋白） 0.3000g
Ca(NO3)2·4H2O 0.4000g
KOH 0.0360g。
进一步的，步骤（4）中每升生根壮苗培养基含有如下质量的成分：
Sugar（糖） 19.7121g
Agar（琼脂） 4.5000g
KNO3 0.9500g
NH4NO3 0.8250g
KH2PO4 0.0850g
MgSO4·7H2O 0.1850g
CaSO4·2H2O 0.5000g
FeNaEDTA（乙二胺四乙酸铁（Ⅲ）钠） 0.0400g
横断维生素 0.1140g
2(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) 1.0000g
蛋白胨 2.0000g
CaCl2 0.1660g
KOH 0.1470g。
进一步的，所述横断微量元素由如下重量份配比的组分组成：
MnSO4·H2O， 0.0057000份
H3BO3， 0.0000560份
CuSO4·5H2O， 0.0000624份
MoO3 0.0000160份
ZnSO4·7H2O 0.0003310份。
进一步的，所述横断维生素由以下质量百分比的组分组成：
Vitamin B1 9.3333%
Vitamin B3 6.1667%
Vitamin B5 7.0833%
Vitamin B6 0.8333%
Vitamin H 0.0833%
Vitamin M 0.4167%
L-Glycin（L-甘氨酸） 5.6667%
Myo-Inositol（肌醇） 70.4167%。
进一步的，步骤(5)所述栽种基质由以下重量份配比的组分组成：珍珠岩1份、碎钙化石或白云石粉0.5份、松树皮2份、火山石2份。
进一步的，步骤(6)中所述的叶肥为含氮量0.5g/L的氮肥，缓释肥为2-3型的缓控肥，2型的为包膜缓释肥，3型的为添加脲酶抑制剂和硝化抑制剂的缓释肥；虫害的防治喷施50％杀螟松乳油1000～1500倍液或50％西维因可湿性粉剂500～1000倍液药剂；所述开花尺寸为具有5-6片8-10cm长叶的植株。
本发明的有益效果在于：
1、本发明选择横断雅致兜兰成熟蒴果的种子作为接种材料，使用特定的培养基，使种子诱导萌发率达到80%以上，一颗蒴果可获得完整植株2000-3000株左右。
2、本发明整个过程无需投入过多的基础设施，投入成本低，操作简单，易于掌握。
3、实现了横断雅致兜兰的人工大量繁育，具有重要的现实意义和经济效益，对植物资源的再生和可持续利用及种质资源的保护都具有重要的意义。
具体实施方式
实施例
（1）地址：其中蒴果种子组培快繁为横断山生物技术有限公司成都双流基地，大棚种植地址为海拔3200米的横断山黄龙基地及海拔498m的横断山生物技术有限公司成都双流基地。
（2）时间：蒴果组培开始时间为2010年9月1-2010年11月，移栽种植时间为2012年5月1-2015年9月，开花观测时间为2014年2月-2016年10月。
（3）材料：采自自然成熟或人工授粉后(300d)雅致兜兰成熟蒴果。
具体如下：
（1）将雅致兜兰成熟蒴果经蒸馏水洗后，在超净工作台上先使用10%的次氯酸钠（现用现配）消毒20 min，再使用70%酒精表面消毒30s，再以0.2%氯化汞溶液消毒15min，最后用无菌水冲洗5次，灭菌滤纸吸干果实表面的水分；也可以将蒴果采用如下方法保存：采集雅致兜兰成熟蒴果，将花蒂剔除后对表面进行清洗，随后用75%酒精擦拭干净，置于干净滤纸上，剥开果实抖出种子，将种子置于密封的玻璃试管内于4℃环境下可保存2周，或于-20℃环境下可保存超过1年；
（2）原球茎诱导：将消毒后的蒴果置于灭菌滤纸上吸干水分, 用灭菌解剖刀纵向切开蒴果, 抖出种子，将种子接种到灭菌的原球茎诱导培养基上，将培养瓶放置于20±2℃的暗环境里培养5周后，再转入光培养5周后，获得转绿且有叶原基出现的原球茎；光培养条件为：光照强度：12000-22000lux，光照时间为12h·d-1；原球茎诱导培养基组成见表1：
表1原球茎诱导培养基（g/L）
（3）原球茎增殖及分化培养：将上述原球茎转入增殖继代培养基中，经90-150天培养后分化为完整、健壮的无根苗；增殖继代培养基组成见表2：
表2增殖继代培养基（g/L）
其中，其中横断微量元素、横断维生素组成见表1。
（4）壮苗及生根培养：将健壮的无根苗转入生根壮苗培养基上，经150-180天培养后可长成具有2-3条粗壮肉质根、高5cm左右的小苗，再转入生根壮苗培养基中继代一次，培养150d左右后获得高8-10cm具有4条粗壮肉质根的健壮植株；生根壮苗培养基组成见表3：
表3生根壮苗培养基（g/L）
（5）炼苗移栽：将培养瓶置于温室大棚炼苗1-2周后，取出生根苗，洗净根部培养基，0.1%甲基托布津溶液浸泡0.5h，800倍多菌灵溶液浸泡0.5h，种植于栽种基质中；按重量份配比计，栽种基质由珍珠岩1份、碎钙化石或白云石粉0.5份、松树皮2份、火山石2份组成。室温大棚培养，大棚保持通风、控温，20-30℃，白天相对湿度50-80%，夜间相对湿度70-80%。
（6）大棚种植及病虫害防治：大棚种植4月15日移栽，栽种4周后，开始长叶。每隔2月喷施一次叶肥，也可使用缓释肥，期间注意防治鼻涕虫、蜗牛类、卷叶蛾类虫害。栽种1-2年后可达到开花尺寸，开花尺寸为具有5-6片8-10cm长叶的植株。2014-2015每批次取200株，分别于2014年4月，6月，8月三批次栽培于海拔498m处的双流基地2-3月后可开花，于2015年3月，9月分两批次移栽于海拔3200m的黄龙基地，2-3月后可开花，开花比例皆可达70-80%。叶肥为含氮量0.5g/L的氮肥，缓释肥为2-3型的缓控肥，2型的为包膜缓释肥，3型的为添加脲酶抑制剂和硝化抑制剂的缓释肥；虫害的防治喷施50％杀螟松乳油1000～1500倍液或50％西维因可湿性粉剂500～1000倍液药剂。

Claims (9)

1.一种横断雅致兜兰的组培快繁及栽培的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）蒴果采集：采集自然或人工成功授粉300天的雅致兜兰蒴果，对其进行消毒；
（2）原球茎诱导：将消毒后的蒴果置于灭菌滤纸上吸干水分, 用灭菌解剖刀纵向切开蒴果, 抖出种子，将种子接种到灭菌的原球茎诱导培养基上，将培养瓶放置于20±2℃的暗环境里培养4-6周后，再转入光培养4-6周后，获得转绿且有叶原基出现的原球茎；光培养条件为：光照强度：12000-22000lux，光照时间为12h·d-1；
（3）原球茎增殖及分化培养：将上述原球茎转入增殖继代培养基中，经90-150天培养后分化为完整、健壮的无根苗；
（4）壮苗及生根培养：将健壮的无根苗转入生根壮苗培养基上，经150-180天培养后长成具有2-3条粗壮肉质根、高4~6cm的小苗，再转入生根壮苗培养基中继代一次，培养145-155d后获得高8-10cm具有4-6条粗壮肉质根的健壮植株；
（5）炼苗移栽：将培养瓶置于温室大棚炼苗1-2周后，取出生根苗，洗净根部培养基，0.1%甲基托布津或高锰酸钾溶液浸泡0.5h，800倍多菌灵溶液浸泡0.5h，种植于栽种基质中；其中大棚温度15-30℃，白天相对湿度50-80%，夜间相对湿度70-80%；
（6）大棚种植及病虫害防治：大棚种植以每年4-5月进行移栽种植最佳，栽种4-6周后，喷施叶肥或使用缓释肥，喷施药剂预防虫害，大棚种植1~2年后达到开花尺寸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蒴果采用以下方法保存：采集自然或人工成功授粉300天的雅致兜兰蒴果，将花蒂剔除后对表面进行清洗，随后用75%酒精擦拭干净，置于干净滤纸上，剥开果实抖出种子，将种子置于密封的玻璃试管内于4℃或-20℃环境下保存。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的消毒方法为：将蒴果经蒸馏水洗后，在超净工作台上先使用10%的次氯酸钠或10%安替佛民溶液消毒20 min，再使用70%酒精表面消毒30s，再以0.2%氯化汞溶液消毒15min，最后用无菌水冲洗5次，灭菌滤纸吸干果实表面的水分；所述次氯酸钠溶液现用现配。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中每升原球茎诱导培养基含有如下质量的成分：
蔗糖 20.5712g
KNO3，AR 0.9500g
NH4NO3，AR 0.8250g
KH2PO4 0.0850g
MgSO4·7H2O 0.1850g
无水CaCl2 0.1660g
Na2EDTA 0.0372g
FeSO4·7H2O 0.0279g
横断微量元素 0.0185g
横断维生素 0.1140g
2(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) 1.0000g
Pepton, BR 2.0000g
Citric acid 0.0213g。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中每升增殖继代培养基含有如下质量的成分：
Saccharose 20.0000g
Agar 5.0000g
Potato powder 5.0000g
KNO3，AR 0.2000g
KH2PO4 0.2000g
MgSO4·7H2O 0.2000g
KCl 0.1000g
(NH4)3-Citrate 0.0190g
横断微量元素 0.0185g
横断维生素 0.1200g
Caseinhydrolysate 0.3000g
Ca(NO3)2·4H2O 0.4000g
KOH 0.0360g。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中每升生根壮苗培养基含有如下质量的成分：
Sugar 19.7121g
Agar 4.5000g
KNO3 0.9500g
NH4NO3 0.8250g
KH2PO4 0.0850g
MgSO4·7H2O 0.1850g
CaSO4·2H2O 0.5000g
FeNaEDTA 0.0400g
横断维生素 0.1140g
2(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) 1.0000g
蛋白胨 2.0000g
CaCl2 0.1660g
KOH 0.1470g。
7.根据权利要求5或6或7所述的方法，其特征在于：
所述横断微量元素由如下重量份配比的组分组成：
MnSO4·H2O 0.0057000份
H3BO3 0.0000560份
CuSO4·5H2O 0.0000624份
MoO3 0.0000160份
ZnSO4·7H2O 0.0003310份；
所述横断维生素由以下质量百分比的组分组成：
Vitamin B1 9.3333%
Vitamin B3 6.1667%
Vitamin B5 7.0833%
Vitamin B6 0.8333%
Vitamin H 0.0833%
Vitamin M 0.4167%
L-Glycin 5.6667%
Myo-Inositol 70.4167%。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述栽种基质由以下重量份配比的组分组成：珍珠岩1份、碎钙化石或白云石粉0.5份、松树皮2份、火山石2份。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中所述的叶肥为含氮量0.5g/L的氮肥，缓释肥为2-3型的缓控肥，2型的为包膜缓释肥，3型的为添加脲酶抑制剂和硝化抑制剂的缓释肥；虫害的防治喷施50％杀螟松乳油1000～1500倍液或50％西维因可湿性粉剂500～1000倍液药剂；所述开花尺寸为具有5-6片8-10cm长叶的植株。
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