CN107226820B - 一种具有抗肿瘤作用的毛菌素j及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抗肿瘤作用的毛菌素J的制备方法及其用途,该毛菌素J的制备方法包括如下步骤:将Chaetomium sp.YX‑1菌种培养处理后接种到液体培养基中发酵处理,取发酵液依次过滤、菌丝提取、滤液萃取处理,菌丝提取和滤液萃取物合并得到总提取物,总提取物经硅胶柱层析,利用二氯甲烷/甲醇洗脱,对洗脱后含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征吸收峰部分在LC‑MS分析追踪下经ODS柱层析以及Sephadex LH‑20凝胶柱色谱分离,对含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征峰部分,经过半制备液相纯化得到化合物毛菌素J。本发明制备的化合物Chaetocochin J对5株人源肿瘤细胞的增殖有显著的抑制作用,效果优于阳性对照药物顺铂,具有预期发展成为抗肿瘤药物的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及一种具有抗肿瘤作用的毛菌素J及其制备方法与用途。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康的主要的疾病之一,随着环境恶化加剧等因素的影响,全球恶性肿瘤患病人数抑制呈现增加趋势。2016年CA Cancer J Clin发表的统计数据表明,基于2009-2011年间72个地方人群的癌症登记处数据,中国2015年将会有4292000例癌症新发病例,2814000例癌症死亡。癌症的预防与治疗将是一项非常艰巨的任务。
天然产物一直是药物的重要来源,目前临床使用的药物大多数来源于天然产物结构的改造与优化,部分药物直接来源于天然产物。据统计,从1981年到2010年的三十年之间,直接或间接来源于天然产物的药物平均占到每年上市药物的30-40%之间;2010年,天然产物相关来源的药物比例达到了空前的50%。
植物内生真菌次生代谢产物种类丰富,具有结构新颖、生物活性显著的特点,越来越多具有显著活性的次生代谢产物被从中发现,使得植物内生真菌成为了新颖活性药用化合物的重要来源之一。因此,从内生真菌次生代谢产物中寻找新颖的化合物成为抗肿瘤活性先导化合物发现的重要途径。
发明内容
为克服现有技术的不足,本发明的目的就是要提供一种具有抗肿瘤作用的毛菌素J及其制备方法与用途。本发明制备的毛菌素J对5株人源肿瘤细胞(白血病HL-60、肺癌A-549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7、结肠癌SW480)的增殖有显著的抑制作用,效果优于阳性对照药物顺铂,具有预期发展成为抗肿瘤药物的潜力。
为实现上述目的,本发明所提供的一种具有抗肿瘤作用的毛菌素J,该毛菌素J的结构式如下式(I)所示。
本发明还提供了一种制备所述具有抗肿瘤作用的毛菌素J的方法,包括如下步骤:将Chaetomium sp.YX-1菌种(其中,Chaetomium sp.YX-1菌种于2017年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地点为中国武汉大学,其微生物保藏编号为:CCTCC NO:M2017028)培养处理后接种到液体培养基中发酵处理,取发酵液依次过滤、菌丝提取、滤液萃取处理,合并菌丝提取物和滤液萃取物得总提取物,取总提取物经硅胶柱层析利用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱,对洗脱后含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征吸收峰部分在LC-MS分析追踪下经ODS柱层析以及Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离,对含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征峰部分,经过半制备液相纯化得到结构式为I的化合物毛菌素J。
进一步地,所述液体培养基按质量百分数计包括酵母提取物0.2-0.5%、蛋白胨0.2-0.5%、葡萄糖0.6-1%,余量为水。
进一步地,所述培养处理具体为将Chaetomium sp.YX-1菌种接种于PDA培养基上3-7天后,切成0.5cm×0.5cm的碎片;所述发酵处理的温度为22-32℃,发酵时间为15-45天。
进一步地,所述提取处理为采用质量百分数为90%的甲醇对发酵液过滤后的菌丝回流提取1-3次,得到菌丝提取物;所述滤液萃取处理为采用与发酵液过滤后的滤液等体积的乙酸乙酯萃取1-5次后,经减压回收乙酸乙酯溶剂后得到滤液萃取物。
进一步地,所述硅胶柱层析利用二氯甲烷/甲醇(CHCl2/MeOH)进行洗脱,洗脱比例为50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1。
进一步地,所述ODS柱层析利用石油醚/乙酸乙酯(PE-EtOAc)进行洗脱,洗脱比例为50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1。
进一步地,所述Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离利用体积比为1:1的二氯甲烷/甲醇(CHCl2/MeOH)进行等度洗脱。
进一步地,所述半制备液相纯化采用的流动相为质量比为75:25的甲醇和水,液相流速为2.0mL/min。
进一步地,所述具有抗肿瘤作用的毛菌素J的方法,具体包括如下步骤:
1)将Chaetomium sp.YX-1菌种接种于PDA培养基上3-7天后切成0.5cm×0.5cm的碎片,再接种到液体培养基中,在温度为22-32℃的条件下发酵15-45天,取得发酵液;
2)将步骤1)所得的发酵液过滤后,采用质量百分数为90%的甲醇对发酵液过滤后的菌丝回流提取1-3次得到菌丝提取物,采用与发酵液过滤后的滤液等体积的乙酸乙酯萃取1-5次,经减压回收乙酸乙酯溶剂后得到滤液萃取物,合并菌丝提取物和滤液萃取物得到总提取物;
3)将步骤2)所得的总提取物经硅胶柱层析,利用二氯甲烷/甲醇(CHCl2/MeOH)进行洗脱,洗脱比例为50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1,洗脱液经过薄层色谱检识后合并得到3~5个支部分,各支部分经过LC-MS分析,仅其中一个支部分含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征峰;
4)将步骤3)含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征峰的一个支部分在LC-MS分析追踪下经ODS柱层析,利用石油醚/乙酸乙酯(PE-EtOAc)进行洗脱,洗脱比例为50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1,洗脱液经过薄层色谱检识后合并得到5~7个支部分,各支部分经过LC-MS分析,仅其中一个支部分含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征峰;
5)选取步骤4)含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征峰的一个支部分在LC-MS分析追踪下经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离,利用体积比为1:1的二氯甲烷/甲醇(CHCl2/MeOH)进行等度洗脱,洗脱液经过薄层色谱检识后合并得到2~3个支部分,各支部分经过LC-MS分析,仅其中一个支部分含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征峰;
6)将步骤5)含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征吸收峰的一个支部分经过半制备液相纯化得到结构式为I的化合物毛菌素J。
本发明所述具有抗肿瘤作用的毛菌素J的用途,在制备用于治疗白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌药物中的应用。
与现有技术相比,本发明的优点:
其一,本发明采用的菌株Chaetomium sp.YX-1的培养条件容易控制且可重复发酵,可通过发酵途径有效富集得到足够的量化合物毛菌素J(Chaetocochin J),从而解决了由于化合物毛菌素J结构复杂,难以人工合成的问题。
其二,本发明化合物毛菌素J的制备方法中依次采用菌丝提取、滤液萃取、硅胶柱层析、ODS柱层析以及Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离成功制备了化合物毛菌素J,设备要求简单易行,纯化步骤简洁高效。
其三,本发明制备的化合物毛菌素J对5株人源肿瘤细胞(白血病HL-60、肺癌A-549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7、结肠癌SW480)的增殖有显著的抑制作用,效果优于阳性对照药物顺铂,具有预期发展成为抗肿瘤药物的潜力。
其四,本发明制备的化合物毛菌素J细胞水平抗肿瘤作用优于阳性对照顺铂,应用于抗肿瘤药物制备中具有,具有潜在的经济效益。
附图说明
图1为实施例1所制备的毛菌素J的高分辨液质色谱图;
图2为实施例1所制备的毛菌素J的高分辨液质质谱图;
图3为实施例1所制备的毛菌素J的紫外光谱图;
图4为实施例1所制备的毛菌素J的红外光谱图;
图5为实施例1所制备的毛菌素J的核磁1H NMR;
图6为实施例1所制备的毛菌素J的核磁13C NMR谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明:
本说明书未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
实施例1:毛菌素J的制备方法:
将Chaetomium sp.YX-1(毛壳霉YX-1)菌种接种于PDA培养基上3天后切成0.5cm×0.5cm的碎片,接种到液体培养基中(酵母提取物3g,蛋白胨3g,葡萄糖8g加水1000mL,高温高压灭菌后冷却至室温)22℃培养15天,取得发酵液。将发酵液过滤,菌丝体采用质量百分数为90%的甲醇回流提取3次,滤液经与滤液体积的乙酸乙酯萃取5次,甲醇和乙酸乙酯提取液经减压回收溶剂后合并得到总提取物。总提取物经硅胶柱层析,利用二氯甲烷/甲醇(CHCl2/MeOH)进行洗脱,洗脱比例为50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1各200mL,洗脱液经过薄层色谱检识后合并得到三个部分(Fr.1–Fr.3)。经过LC-MS分析发现Fr.2部分含有多硫代二酮哌嗪类化合物。选取Fr.2部分在LC-MS分析追踪下经ODS柱层析利用石油醚/乙酸乙酯(PE-EtOAc)进行洗脱,洗脱比例为50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1各100mL,得到5个部分(Fr.2.1-Fr.2.5)。各支部分经过LC-MS分析,仅其中Fr.2.3部分含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征吸收峰;
选取Fr.2.3部分在LC-MS分析追踪下经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离利用体积比为1:1的二氯甲烷/甲醇(CHCl2/MeOH)进行等度洗脱,得到2个部分(Fr.2.3.1-Fr.2.3.2),各支部分经过LC-MS分析,仅其中Fr.2.3.2部分含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征吸收峰;选取Fr.2.3.2再经过半制备液相纯化(流动相为MeOH/H2O,75:25,液相流速为2.0mL/min)得到了化合物毛菌素J(Chaetocochin J)。
实施例2:毛菌素J的制备方法:
将Chaetomium sp.YX-1(毛壳霉YX-1)菌种接种于PDA培养基上7天后切成0.5cm×0.5cm的碎片,接种到液体培养基中(酵母提取物3g,蛋白胨3g,葡萄糖8g加水1000mL,高温高压灭菌后冷却至室温)32℃培养45天,取得发酵液。将发酵液过滤,菌丝体采用质量百分数为90%的甲醇回流提取1次,滤液经与滤液体积的乙酸乙酯萃取1次,甲醇和乙酸乙酯提取液经减压回收溶剂后合并得到总提取物。总提取物经硅胶柱层析,利用二氯甲烷/甲醇(CHCl2/MeOH)进行洗脱,洗脱比例为50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1各200mL,洗脱液经过薄层色谱检识后合并得到5个部分(Fr.1–Fr.5)。经过LC-MS分析发现Fr.2部分含有多硫代二酮哌嗪类化合物。
选取Fr.2部分在LC-MS分析追踪下经ODS柱层析利用石油醚/乙酸乙酯(PE-EtOAc)进行洗脱,洗脱比例为50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1各100mL,得到7个部分(Fr.2.1-Fr.2.7)。各支部分经过LC-MS分析,仅其中Fr.2.3部分含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征峰;
选取Fr.2.3部分在LC-MS分析追踪下经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离利用体积比为1:1的二氯甲烷/甲醇(CHCl2/MeOH)进行等度洗脱,得到3个部分(Fr.2.3.1-Fr.2.3.3),各支部分经过LC-MS分析,仅其中Fr.2.3.2部分含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征峰;选取Fr.2.3.2再经过半制备液相纯化(流动相为MeOH/H2O,75:25,流速为2.0mL/min)得到了化合物毛菌素J(Chaetocochin J)。
实施例3:毛菌素J的制备方法:
将Chaetomium sp.YX-1(毛壳霉YX-1)菌种接种于PDA培养基上5天后切成0.5cm×0.5cm的碎片,接种到液体培养基中(酵母提取物2g,蛋白胨5g,葡萄糖1g加水1000mL,高温高压灭菌后冷却至室温)32℃培养30天,取得发酵液。将发酵液过滤,菌丝体采用质量百分数为90%的甲醇回流提取2次,滤液经与滤液体积的乙酸乙酯萃取3次,甲醇和乙酸乙酯提取液经减压回收溶剂后合并得到总提取物。总提取物经硅胶柱层析,利用二氯甲烷/甲醇(CHCl2/MeOH)进行洗脱,洗脱比例为50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1各200mL,洗脱液经过薄层色谱检识后合并得到4个部分(Fr.1–Fr.4)。经过LC-MS分析发现Fr.2部分含有多硫代二酮哌嗪类化合物。
选取Fr.2部分在LC-MS分析追踪下经ODS柱层析利用石油醚/乙酸乙酯(PE-EtOAc)进行洗脱,洗脱比例为50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1各100mL,得到6个部分(Fr.2.1-Fr.2.6)。各支部分经过LC-MS分析,仅其中Fr.2.3部分含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征峰;
选取Fr.2.3部分在LC-MS分析追踪下经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离利用体积比为1:1的二氯甲烷/甲醇(CHCl2/MeOH)进行等度洗脱,得到2个部分(Fr.2.3.1-Fr.2.3.2),各支部分经过LC-MS分析,仅其中Fr.2.3.2部分含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征峰;选取Fr.2.3.2再经过半制备液相纯化(流动相为MeOH/H2O,75:25,流速为2.0mL/min)得到了化合物毛菌素J(Chaetocochin J)。
实施例4:对实施例1所制备的如式(1)所示化合物毛菌素J(Chaetocochin J)结构鉴定。所得的Chaetocochin J为白色粉末,对实施例1所得Chaetocochin J化合物进行HR-MS、UV、IR、NMR测试分析,从而确定该化合物的结构。
如图1和图2所示为实施例1所制备的Chaetocochin J的高分辨液质色谱图和高分辨液质质谱图,从图2中可以看出,可见质荷比为711.1180的[M+H+]峰,说明分子式为C31H30N6O6S4。
如图3实施例1所制备的Chaetocochin J的紫外光谱图,从图2中可见UV(CH2Cl2)λmax(logε)228(4.30),296(3.47)nm,为吲哚环的特征吸收,说明结构中有吲哚环片段。
如图4为实施例1所制备的Chaetocochin J的红外光谱图,从图3中可见IR(KBr)νmax 3373,2956,2926,1725,1674,1646,1610,1455,1366,1255,1065、743cm-1;其中1725,1674,1646,1610cm-1为结构中哌嗪环羰基的特征吸收峰,1455cm-1为吲哚环的特征吸收峰,说明结构中有苯环以及羰基等基团。
如图5和图6分别为实施例1所制备的Chaetocochin J的核磁1H NMR和核磁13C NMR谱图,表(1)为核磁1H NMR和核磁13C NMR数据。从表(1)中可见1H NMR(DMSO-d6,600MHz)和13C NMR(DMSO-d6,150MHz);HRESIMS m/z 733.1180,[M+H]+(calcd for C31H31N6O6S4,711.1182)。CD(c 1.31×10-3M in CH2Cl2)λmax(Δε)302(+0.54),291(-0.38),241(+20.74);
表(1).Chaetocochin J的核磁1H NMR和核磁13C NMR数据
a 600MHz for 1H and 150MHz for 13C.
实施例5:采用实施例1所制备的Chaetocochin J对5株人源癌细胞增殖的抑制活性(白血病HL-60、肺癌A-549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7、结肠癌SW480)。
实验方法如下:
1、接种细胞:用含10%胎牛血清的培养液(DMEM或者RMPI1640)配成单个细胞悬液,以每孔3000-15000个细胞接种到96孔板,每孔体积100μl,贴壁细胞提前12-24小时接种培养。
2、加入待测化合物溶液:Chaetocochin J用DMSO(二甲基亚砜)溶解,Chaetocochin J以40μM、8μM、1.6μM、0.32μM、0.064μM浓度复筛,每孔终体积200μl,每种处理均设3个复孔。
3、显色:37摄氏度培养48小时后,贴壁细胞弃孔内培养液,每孔加MTS溶液20μl和培养液100μl;悬浮细胞弃100μl培养上清液,每孔加20μl的MTS溶液;设3个空白复孔(MTS溶液20μl和培养液100μl的混合液),继续孵育2-4小时,使反应充分进行后测定光吸收值。
4、比色:选择492nm波长,多功能酶标仪(MULTISKAN FC)读取各孔光吸收值,记录结果,数据处理后以浓度为横坐标,细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线,应用两点法(Reed and Muench法)计算化合物的IC50值。
5、阳性对照化合物:每次实验均设顺铂(DDP)和紫杉醇(Taxol)两个阳性化合物,以浓度为横坐标,细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线,应用两点法(Reed and Muench法)计算化合物的IC50值。Chaetocochin J对5株肿瘤细胞的IC50值(μM)表(2)所示。
表(2).Chaetocochin J对5种肿瘤细胞的IC50值
白血病HL-60 | 肺癌A-549 | 肝癌SMMC-7721 | 乳腺癌MCF-7 | 结肠癌SW480 | |
毛菌素J | 0.64 | 3.05 | 0.84 | 0.88 | 0.41 |
顺铂 | 2.77 | 19.08 | 10.62 | 23.64 | 10.15 |
紫杉醇 | <0.008 | <0.008 | <0.008 | <0.008 | <0.008 |
实验结论:从表(2)中可以看出,Chaetocochin J对5株人源癌细胞(白血病HL-60、肺癌A-549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7、结肠癌SW480)的增殖有显著的抑制作用,效果优于阳性对照药物顺铂,具有开发成为抗肿瘤药物的潜力。
应当理解的是,以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种具有抗肿瘤作用的毛菌素J的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:将Chaetomium sp.YX-1菌种培养处理后接种到液体培养基中发酵处理,取发酵液依次过滤、菌丝提取、滤液萃取处理,合并菌丝提取物和滤液萃取物得总提取物,取总提取物经硅胶柱层析,利用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱,对洗脱后含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征吸收峰部分在LC-MS分析追踪下依次经ODS柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离,对含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征吸收峰部分,经过半制备液相纯化得到结构式为I的化合物毛菌素J;
所述毛菌素J的结构式I如下式所示:
所述Chaetomium sp.YX-1菌种于2017年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地点为中国武汉大学,其微生物保藏编号为:CCTCC NO:M 2017028;
所述液体培养基按质量百分数计包括酵母提取物0.2-0.5%、蛋白胨0.2-0.5%、葡萄糖0.6-1%,余量为水;
所述培养处理具体为将Chaetomium sp.YX-1菌种接种于PDA培养基上3-7天后,切成0.5cm×0.5cm的碎片;所述发酵处理的温度为22-32℃,发酵时间为15-45天。
2.根据权利要求1所述具有抗肿瘤作用的毛菌素J的制备方法,其特征在于,所述菌丝提取处理为采用质量百分数为90%的甲醇对发酵液过滤后的菌丝回流提取1-3次,得到菌丝提取物;所述滤液萃取处理为采用与发酵液过滤后的滤液等体积的乙酸乙酯萃取1-5次后,经减压回收乙酸乙酯溶剂后得到滤液萃取物。
3.根据权利要求1所述具有抗肿瘤作用的毛菌素J的制备方法,其特征在于,所述硅胶柱层析利用二氯甲烷/甲醇进行洗脱,洗脱比例为50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1。
4.根据权利要求1所述具有抗肿瘤作用的毛菌素J的制备方法,其特征在于,所述ODS柱层析利用石油醚/乙酸乙酯进行洗脱,洗脱比例为50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1和1:1;所述Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离利用体积比为1:1的二氯甲烷/甲醇进行等度洗脱。
5.根据权利要求1所述具有抗肿瘤作用的毛菌素J的制备方法,其特征在于,所述半制备液相色谱纯化采用的流动相为体积比为75:25的甲醇和水,液相流速为2.0mL/min。
6.根据权利要求1所述具有抗肿瘤作用的毛菌素J的制备方法,其特征在于,具体包括如下步骤:
1)将Chaetomium sp.YX-1菌种接种于PDA培养基上3-7天后切成0.5cm×0.5cm的碎片,再接种到液体培养基中,在温度为22-32℃的条件下发酵15-45天,取得发酵液;
2)将步骤1)所得的发酵液过滤后,采用质量百分数为90%的甲醇对发酵液过滤后的菌丝回流提取1-3次得到菌丝提取物,采用与发酵液过滤后的滤液等体积的乙酸乙酯萃取1-5次,经减压回收乙酸乙酯溶剂后得到滤液萃取物,合并菌丝提取物和滤液萃取物得到总提取物;
3)将步骤2)所得的总提取物经硅胶柱层析,利用二氯甲烷/甲醇进行洗脱,洗脱液经过薄层色谱检识后合并得到3-5个部分,各支部分经过LC-MS分析,仅其中一个部分含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征峰;
4)将步骤3)含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征峰的一个支部分在LC-MS分析追踪下经ODS柱层析,利用石油醚/乙酸乙酯进行洗脱,洗脱液经过薄层色谱检识后合并得到5~7个支部分,各支部分经过LC-MS分析,仅其中一个支部分含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征峰;
5)选取步骤4)含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征吸收峰的一个支部分在LC-MS分析追踪下经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离,利用二氯甲烷/甲醇进行等度洗脱,洗脱液经过薄层色谱检识后合并得到2~3个支部分,各支部分经过LC-MS分析,仅其中一个支部分含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征峰;
6)将步骤5)含有多硫代二酮哌嗪类化合物特征峰的一个支部分经过半制备液相纯化得到结构式为I的化合物毛菌素J。
7.一种具有抗肿瘤作用的毛菌素J的用途,该具有抗肿瘤作用的毛菌素J由权利要求1所述具有抗肿瘤作用的毛菌素J的制备方法制备而成,其特征在于,在制备用于治疗白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌药物中的应用。
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