CN107167506A - 一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法 - Google Patents

一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法 Download PDF

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陈洋
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Abstract

本发明公开了一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法，其方法为：步骤一、空心碳球的制备；步骤二、羧基功能化的空心碳球纳米材料的制备；步骤三、固定化分选酶空心碳球纳米复合材料的制备；步骤四、将固定化分选酶介孔空心碳球纳米复合材料、石墨、液体石蜡按1mg:4mg:1.6mL的比例混合研磨均匀，制成碳糊电极，浸入金黄色葡萄球菌菌液中检测，检测方法为差分脉冲伏安法，条件为：起始点位0.2V，最高点位1.3V。有益效果：本发明采用固定化分选酶A制成碳糊电极能够实现金黄色葡萄球菌的快速且准确的检测。该电化学检测技术检测金葡菌较现有的金葡菌检测方法具有无需标记、快速、操作简单方便等优点，具有良好的应用前景。

Description

一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法
技术领域
本发明涉及一种检测葡萄球菌的电化学方法，特别涉及一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法。
背景技术
目前，金黄色葡萄球菌隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，是革兰氏阳性菌的代表,是人类的一种重要病原菌，能够引起许多严重感染。金黄色葡萄球菌是环境中一种普遍存在的微生物，它也是引起医院和社区发生获得性感染的主要病原体，不仅可以袭击并寄生于我们人类的皮肤和粘膜上，还可以入侵我们的腋窝、伤口，严重危害着人类健康与安全。在空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中均可找到金黄色葡萄球菌，因此食品受其污染的机会很多，一旦食用被污染的食品，极容易引起腹泻或食物中毒，严重者会导致死亡。据美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌,在我国食物中毒事件中，每年由金黄色葡萄球菌引起也屡见不鲜。
金黄色葡萄球菌之所以能够进入人体，是因为金黄色葡萄球菌的表面蛋白A(Spa)能与免疫球蛋白的Fc部分相连，在这一过程中，分选酶A(SrtA)负责将表面蛋白催化锚定到菌株细胞壁上，起到关键作用。SrtA是一种膜结合的半胱氨酸转肽酶，参与表面蛋白锚定到细胞壁上的两个连续催化，SrtA将含有C-末端分选信号LPXTG基序的表面蛋白上的苏氨酸(T)与甘氨酸(G)之间的肽键切断，该酶的活性中心Cys184的巯基与蛋白上苏氨酸带有的羧基之间共价结合形成硫酯键。这个硫酯酰胺酶中间体和细胞壁合成前体lipidⅡ中5个氨基酸交联桥上的氨基之间形成酰胺键，使得表面蛋白共价连接到细胞壁的肽聚糖上。
目前，国标中对金葡菌的检测方法包括平板计数法和ELISA法。平板计数法虽然具有高度灵敏性、成本较低，但操作复杂且耗费时间长，不容易满足食品中病原体快速检测的需要。ELISA方法主要利用的是与金黄色葡萄球菌产生的毒素之间的抗原-抗体免疫反应，可以有效避免杂质干扰，操作简单，具有灵敏度高和特异性高、所耗时间相对较短等优点，但此种方法的操作技巧性强，关键点的控制对结果影响大。除国标方法外，常用的金葡菌的检测方法还包括聚合酶链式反应(PCR)、核酸探针技术、环介导等温扩增技术(LAMP)等，这些方法近年来研究也较为成熟，相比于国标法这些方法迅速，但需要大型仪器成本较高，且试验中影响因素较多，检出限高，一般为105～106CFU/ml。因此快速、高灵敏、高特异性的菌检测技术研究意义重大。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有检测金黄色葡萄球菌技术的不足而提供的一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法。
本发明提供的检测金黄色葡萄球菌的电化学方法，其方法如下所述：
步骤一、空心碳球的制备：将无水乙醇、蒸馏水、25％的氨水以体积比为7:1:0.3的比例混合均匀，搅拌加入与蒸馏水体积比为0.346:1的正硅酸丙酯，静止15min后加入与蒸馏水质量比为0.04:1的间二苯酚以及与蒸馏水体积比0.056:1的37％甲醛，在室温下水浴搅拌24h；25℃13000rpm离心分离10min，得到沉淀；分别用去离子水、无水乙醇过滤并反复洗涤沉淀，干燥；在氮气中700℃高温碳化处理5h，升温速度为2.5℃/min；最后将煅烧产物在5％氢氟酸溶液中浸泡、过滤、洗涤、干燥，即得到空心碳球纳米材料；
步骤二、羧基功能化的空心碳球纳米材料的制备：将1.75mol/L过硫酸铵和2mol/L硫酸按体积比1:1配制混合溶液，将步骤一中制得的空心碳球纳米材料加入前述的过硫酸铵和硫酸混合溶液中进行混合，按照每10mg空心碳球纳米材料加入1mL过硫酸铵和硫酸混合溶液的比例关系进行混合，40℃下水浴搅拌24h，洗涤、干燥，制得羧基功能化人空心碳球纳米材料；
步骤三、固定化分选酶空心碳球纳米复合材料的制备：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和三羟甲基氨基甲烷与盐酸、氯化钠、氯化钙混合配制的缓冲液按照1mg:1.2mg：6mL的比例配制成混合液，在室温下超声分散1h，向其中加入与三羟甲基氨基甲烷和盐酸、氯化钠、氯化钙混合配制的缓冲液体积比1：30的2mg/mL的分选酶A，在16℃条件下150rpm振荡培养6h，离心洗涤获取沉淀，即为固定化分选酶空心碳球纳米复合材料；
步骤四、将固定化分选酶介孔空心碳球纳米复合材料、石墨、液体石蜡按1mg:4mg:1.6mL的比例混合研磨均匀，制成碳糊电极，浸入金黄色葡萄球菌菌液中检测，检测方法为差分脉冲伏安法，条件为：起始点位0.2V，最高点位1.3V。
本发明的有益效果：
本发明采用的羧基功能化空心碳球纳米材料具有空心结构，比表面积大等优点；固定化分选酶A制成碳糊电极能够实现金黄色葡萄球菌的快速且准确的检测。与现有技术相比无需标记、快速、操作简单方便等优点。利用分选酶A能够识别革兰氏阳性菌表面蛋白的特点，将分选酶A从金黄色葡萄球菌菌液中提取、纯化，采用共价结合的方法将其固定到羧基功能化的介孔空心碳球纳米材料表面，制成碳糊电极，利用三电极检测系统检测金黄色葡萄球菌，并采用差分脉冲伏安法检测电信号发生变化，从而感应金黄色葡萄球菌。该电化学检测技术检测金葡菌较现有的金葡菌检测方法具有无需标记、快速、操作简单方便等优点，具有良好的应用前景。
附图说明
图1、2为本发明制得的空心碳球材料的扫描电镜示意图。
图3为本发明制得的空心碳球材料的透射电镜示意图。
图4为本发明制得的羧基功能化的空心碳球纳米材料的红外光谱图。
图5为本发明制得的固定化分选酶纳米复合材料的红外光谱图。
图6为本发明制得的空心碳球材料的X射线衍射图谱。
图7为本发明制得的羧基功能化的空心碳球纳米材料的X射线衍射图谱。
图8为本发明制得的空心碳球材料的拉曼光谱。
图9为本发明制得的羧基功能化的空心碳球纳米材料的拉曼光谱。
图10为本发明制得的羧基功能化的介孔碳材料的X射线光电子能谱图。
图11为本发明制得的固定化分选酶纳米复合材料的X射线光电子能谱图。
图12为本发明制得的裸碳糊电极在5.0mM铁氰化钾(含0.10M氯化钾)
溶液中的循环伏安图：扫描速度：100mV s-1。
图13为本发明制得的固定化分选酶空心碳球纳米复合材料电极在5.0mM铁
氰化钾(含0.10M氯化钾)溶液中的循环伏安图：扫描速度：100mV s-1。
图14为本发明制得的固定化分选酶空心碳球纳米复合材料电极对不同浓度
金黄色葡萄菌溶液的峰电流曲线。
图15为本发明固定化分选酶空心碳球纳米复合材料电极检测金黄色葡萄球菌的标准曲线图。
具体实施方式
请参阅图1至图15所示：
实施例1：
将70mL乙醇和10mL蒸馏水混合均匀，搅拌加入3mL 25％的氨水，3.46mL12mmol正硅酸丙酯，静止15min后加入0.4g间二苯酚和0.56mL 37％甲醛，在室温下水浴搅拌24h；25℃13000rpm离心分离10min，得到沉淀；分别用去离子水、无水乙醇过滤并反复洗涤沉淀，干燥；在氮气气氛中700℃高温碳化处理5h，升温速度为2.5℃/min；最后将煅烧产物在5％HF溶液中浸泡、过滤、洗涤、干燥，即得空心碳球纳米材料。
将300mg空心碳球纳米材料浸入到15mL 1.75mol/L的过硫酸铵溶液和15mL2mol/L的硫酸溶液中，40℃下水浴搅拌24h，洗涤、干燥，制得羧基功能化的空心碳球纳米材料。
将5mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和6mg N-羟基琥珀酰亚胺加入30mL pH为8的缓冲液中，再加入30mg羧基功能化的空心碳球纳米材料，在室温下超声分散1h，向其中加入1mL 2mg/mL的分选酶A，在16℃条件下150rpm振荡培养6h，离心洗涤获取沉淀，即为固定化分选酶空心碳球纳米复合材料。
取0.015g固定化分选酶介孔空心碳纳米复合材料，0.060g石墨，与24uL的液体石蜡研磨均匀，制成碳糊电极，没入金黄色葡萄球菌菌液中检测。检测方法为差分脉冲伏安法，条件为：起始点位0.2V，最高点位1.3V。
经上述方法测的结果没有明显的且规律的峰电流值。
实施例2
将70mL乙醇和10mL蒸馏水混合均匀，搅拌加入3mL25％的氨水，3.46mL12mmolTPOS，静止15min后加入0.4g间二苯酚和0.56mL 37％甲醛，在室温下水浴搅拌24h；25℃13000rpm离心分离10min，得到沉淀；分别用去离子水、无水乙醇过滤并反复洗涤沉淀，干燥；在氮气气氛中700℃高温碳化处理5h，升温速度为2.5℃/min；最后将煅烧产物在5％HF溶液中浸泡、过滤、洗涤、干燥，即得空心碳球材料。
将300mg MHCS纳米材料浸入到15mL 1.75mol/L的过硫酸铵溶液和15mL2mol/L的硫酸溶液中，40℃下水浴搅拌24h，洗涤、干燥，制得羧基功能化的空心碳球纳米材料。
将5mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和6mg N-羟基琥珀酰亚胺加入30mL pH为8缓冲液中，再加入30mg羧基功能化的空心碳球纳米材料，在室温下超声分散1h，向其中加入1mL 2mg/mL的分选酶A，在25℃条件下150rpm振荡培养6h，离心洗涤获取沉淀，即为固定化分选酶空心碳球纳米复合材料。
取0.015g固定化分选酶介孔空心碳纳米复合材料，0.060g石墨，与24uL的液体石蜡研磨均匀，制成碳糊电极，没入金黄色葡萄球菌菌液中检测。检测方法为差分脉冲伏安法，条件为：起始点位0.2V，最高点位1.3V。
经上述方法测的结果有明显的且规律的峰电流值。
实施例3
将70mL乙醇和10mL蒸馏水混合均匀，搅拌加入3mL25％的氨水，3.46mL12mmolTPOS，静止15min后加入0.4g间二苯酚和0.56mL 37％甲醛，在室温下水浴搅拌24h；25℃13000rpm离心分离10min，得到沉淀；分别用去离子水、无水乙醇过滤并反复洗涤沉淀，干燥；在氮气氛中700℃高温碳化处理5h，升温速度为2.5℃/min；最后将煅烧产物在5％HF溶液中浸泡、过滤、洗涤、干燥，即得空心碳球材料。
将300mg空心碳球纳米材料浸入到15mL 1.75mol/L的过硫酸铵溶液和15mL2mol/L的硫酸溶液中，40℃下水浴搅拌24h，洗涤、干燥，制得羧基功能化的空心碳球纳米材料。
将5mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和6mg N-羟基琥珀酰亚胺加入30mL pH为8缓冲液中，再加入30mg功能化的空心碳球纳米材料，在室温下超声分散1h，向其中加入1mL 2mg/mL的分选酶A，在37℃条件下150rpm振荡培养6h，离心洗涤获取沉淀，即为固定化分选酶空心碳球纳米复合材料。
取0.015g固定化分选酶介孔空心碳纳米复合材料，0.060g石墨，与24uL的液体石蜡研磨均匀，制成碳糊电极，浸入金黄色葡萄球菌菌液中检测。检测方法为差分脉冲伏安法，条件为：起始点位0.2V，最高点位1.3V。
经上述方法测的结果没有明显的且规律的峰电流值。

Claims (1)

1.一种检测金黄色葡萄球菌的电化学方法，其特征在于：其方法如下所述：
步骤一、空心碳球的制备：将无水乙醇、蒸馏水、25％的氨水以体积比为7:1:0.3的比例混合均匀，搅拌加入与蒸馏水体积比为0.346:1的正硅酸丙酯，静止15min后加入与蒸馏水质量比为0.04:1的间二苯酚以及与蒸馏水体积比0.056:1的37％甲醛，在室温下水浴搅拌24h；25℃13000rpm离心分离10min，得到沉淀；分别用去离子水、无水乙醇过滤并反复洗涤沉淀，干燥；在氮气气氛中700℃高温碳化处理5h，升温速度为2.5℃/min；最后将煅烧产物在5％氢氟酸溶液中浸泡、过滤、洗涤、干燥，即得到空心碳球纳米材料；
步骤二、羧基功能化的空心碳球纳米材料的制备：将1.75mol/L过硫酸铵和2mol/L硫酸按体积比1:1配制混合溶液，将步骤一中制得的空心碳球纳米材料加入前述的过硫酸铵和硫酸混合溶液中进行混合，按照每10mg空心碳球纳米材料加入1mL过硫酸铵和硫酸混合溶液的比例关系进行混合，40℃下水浴搅拌24h，洗涤、干燥，制得羧基功能化空心碳球纳米材料；
步骤三、固定化分选酶空心碳球纳米复合材料的制备：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和三羟甲基氨基甲烷与盐酸、氯化钠、氯化钙混合配制的缓冲液按照1mg:1.2mg：6mL的比例配制成混合液，在室温下超声分散1h，向其中加入与三羟甲基氨基甲烷和盐酸、氯化钠、氯化钙混合配制的缓冲液体积比1：30的2mg/mL的分选酶A，在16℃条件下150rpm振荡培养6h，离心洗涤获取沉淀，即为固定化分选酶空心碳球纳米复合材料；
步骤四、将固定化分选酶介孔空心碳纳米复合材料、石墨、液体石蜡按1mg:4mg:1.6mL的比例混合研磨均匀，制成碳糊电极，浸入金黄色葡萄球菌菌液中检测，检测方法为差分脉冲伏安法，条件为：起始点位0.2V，最高点位1.3V。
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