CN107158360A - 一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物及其制备方法，成份及其重量份为：鲟鱼软骨II型胶原蛋白80~95份、鲟鱼软骨硫酸软骨素1~10份、氨基葡萄糖5~15份和酪蛋白钙0.1~1份。有益效果为：本发明的制备的基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物具有较高的关节修复功效，可作为关节肿疼、骨质疏松等病人的医用食品，也可以作为关节功能弱化的老年人的日常保健产品。
Description
技术领域
本发明涉及保健品及药品技术领域，具体是一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物及其制备方法。
背景技术
鲟鱼（Sturgeon）是指鲟形目的鱼类，具有很高的经济价值。目前，全世界鲟鱼种类有27种，我国有8种。近几十年来，由于环境污染及过度捕捞等人为因素的原因，致使有些鲟鱼种类濒临灭绝。为了挽救这些濒危物种，世界各国在鲟鱼繁殖、放流、养殖等方面做了大量的工作。迄今为止，我国从国外引进了俄罗斯鲟、欧洲鳇、小体鲟、匙吻鲟等十几个品种作为研究或者是人工养殖。我国鲟鱼养殖的主要品有产于黑龙江的史氏鲟、达氏鲟，产于长江的中华鲟和从国外引进的俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、小鲟等，其中史氏鲟和达氏鲟及其杂交种具有生长迅速、能耐低温、遗传可塑性强、肉感好等特点而倍受人们的喜爱。
鲟鱼具有很高的经济价值和药用价值，是古今中外人们喜爱的水产品。鲟鱼除背部骨板外，通体均为软骨，软骨在鲟鱼各组织中占有较大的比重，该部位具有明显的抗癌和补钙作用，素有“鲨鱼翅、鲟鱼骨，食之明目壮阳，延年益寿”之说。现有研究表明：鲟鱼软骨中富含蛋白、多糖、多肽等活性因子，可用于多种疾病的治疗。
膝关节骨性关节炎是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病，又称增生性膝关节炎、老年性膝关节炎。它是一种慢性关节疾病，它的主要改变是膝关节软骨面的退行性变和继发性的骨质增生。主要表现是关节疼痛和活动不灵活，X线表现关节间隙变窄，软骨下骨质致密，骨小梁断裂，有硬化和囊性变。关节边缘有唇样增生。后期骨端变形，关节面凹凸不平。关节内软骨剥落，骨质碎裂进入关节，形成关节内游离体。最近的调研数据显示，全球风湿病患者约有4 亿人，是医学领域中最为庞大的一个疾病族群。在中国，风湿性关节炎、类风湿性关节炎患者占人口总数的 18％，发病率高达 20％。换句话说，在中国，有 2 亿多人不同程度地患有风湿性关节炎或类风湿性关节炎，其中有 8000 万重症患者。其中，50岁以上人群约 50％患有风湿病，60 岁以上人群的骨关节炎发病率达78.5%，70岁以上人群有 90% 出现膝关节软骨退化、关节疼痛和关节炎，我国潮湿地区的发病率更高达 40％。现在市面上有很多治疗关节炎的药物，这些药物会有副作用，且不能根治，只能缓解。因此，需要一款无副作用且效果明显的关节修复组合物。
现有技术如授权公告号为CN102626225B的中国发明专利，公开了一种具有增加骨密度和保护关节功能的保健食品及其制备方法，提供了一种由氨基葡萄糖、钙剂和鱼油组成的具有增加骨密度和保护关节双重功效的保健食品设计方案。该保健食品能较好的促进骨质的吸收，增加骨密度，促进骨折愈合，延缓骨质疏松，但其对骨关节的修复能力较差，对软组织的重建和恢复的作用效果较差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能有效消除关节肿痛，延缓骨质疏松，促进关节滑液的生成，加速软组织的重建和恢复的基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物及其制备方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物成份及其重量份为：鲟鱼软骨II型胶原蛋白80~95份，鲟鱼软骨硫酸软骨素1~10份，氨基葡萄糖5~15份，酪蛋白钙 0.1~1份。
作为优选，氨基葡萄糖为硫酸氨基葡萄糖或盐酸氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖。
一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物的制备方法为：
1）脱脂：鲟鱼软骨组织捣碎机中破碎，按料液比1:10～25（w/v）加入NaOH溶液（0.08~0.14mol/L），于2~5℃下搅拌18～36 h（NaOH溶液每4～8 h更换一次），15 000～20 000 rpm离心20～30 min，收集沉淀物并洗至中性，按料液比1:10～25（w/v）加入正丁醇溶液（15%）浸泡36～54 h除去残留的脂肪；
2）脱钙：按料液比1:10～20（w/v）向固体物中加入EDTA-2Na溶液（0.42~0.49 mol/L，pH为7.0~8.0）浸泡18～30 h（EDTA-2Na溶液每3～6 h更换一次），脱钙；最后软骨固体物用蒸馏水洗至中性、干燥；
3）提取：在步骤2最后得到的软骨中按料液比1: 10～25（w/v）置于乙酸溶液（0.46~0.54 mol/L）中，搅拌提取18～36 h，经15 000～20 000rpm离心15～30 min，收集沉淀物；按料液比1: 10～25 (w/v)向沉淀物中加入乙酸溶液（0.46~0.54 mol/L），按照软骨重量的2.5～3.0%加入猪胃蛋白酶（≥3800U/g），于2~5℃下搅拌提取48～72 h，15 000～20000rpm离心20～30 min，取上清液；
4）透析：将步骤3最后得到的上清液装入透析袋，并放入Tris-HCl磷酸缓冲液（0.046~0.053 mol/L，pH为7.2~7.8）中，并在缓冲液中添加NaCl至溶液最终浓度为2.6～3.0 mol/L，透析24～36 h至析出絮状物沉淀，15 000～20 000 rpm离心15～30 min得沉淀物。将得到的沉淀用乙酸溶液（0.46~0.54 mol/L）复溶后蒸馏水透析36～54 h，透析液冷冻干燥得鲟鱼软骨II型胶原蛋白；
5）超声波辅助酶解处理：在步骤3最后得到的沉淀物中加入Tris-HCl缓冲液（0.046~0.053 mol/L，pH为7.8~8.5），加入软骨重量的0.3～1.0%的胰蛋白酶，在300～500 w超声波辅助作用下，45～55℃水解2～4 h，将反应后提取液置于90℃水浴10～15 min，15 000～20000rpm离心15～30 min，上清液；
6）透析：将步骤5最后得到的上清液浓缩并装入透析袋，用蒸馏水透析36～54 h，透析液按体积加入1.0～1.5倍（v/v）90~98%的乙醇溶液，再逐渐加入NaOH至其浓度为0.5～1.0mol/L，于2~5℃下静置12～16 h，离心得白色沉淀；白色沉淀转移至透析袋，用蒸馏水透析8～12 h，透析液干燥处理，得鲟鱼软骨硫酸软骨素；
7）成品：按配方量混合鲟鱼软骨II型胶原蛋白、鲟鱼软骨硫酸软骨素、氨基葡萄糖和酪蛋白钙，制成制剂，得到一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明能促进软骨细胞的生成，能大量催生和补充关节滑液，润滑关节软骨面，减少磨损，增加关节部位的灵活度；2）本发明能有效促进胶原基质的生成，刺激结缔组织细胞再生，进而加速软组织的重建和恢复；3）本发明具有抑制微血管衍生的因子，还可增加抗体的产生，提高免疫能力，具有消炎和止痛的功效，可以减轻疼痛，改善运动能力；4）本发明可以抑制软骨降解酶的活性，从而起到预防和治疗关节退行性变的作用；5）本发明分子量小，人体对本发明的吸收利用率高，可有效增加骨密度，延缓骨质疏松；6）本发明安全无毒，无副作用，并充分利用鲟鱼软骨资源，变废为宝。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物成份及其重量份为：鲟鱼软骨II型胶原蛋白80~95份，鲟鱼软骨硫酸软骨素1~10份，氨基葡萄糖5~15份，酪蛋白钙 0.1~1份。
氨基葡萄糖为硫酸氨基葡萄糖或盐酸氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖。
一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物的制备方法为：
1）脱脂：鲟鱼软骨组织捣碎机中破碎，按料液比1:10～25（w/v）加入NaOH溶液（0.08~0.14mol/L），于2~5℃下搅拌18～36 h（NaOH溶液每4～8 h更换一次），15 000～20 000 rpm离心20～30 min，收集沉淀物并洗至中性，按料液比1:10～25（w/v）加入正丁醇溶液（15%）浸泡36～54 h除去残留的脂肪；
2）脱钙：按料液比1:10～20（w/v）向固体物中加入EDTA-2Na溶液（0.42~0.49 mol/L，pH为7.0~8.0）浸泡18～30 h（EDTA-2Na溶液每3～6 h更换一次），脱钙；最后软骨固体物用蒸馏水洗至中性、干燥；
3）提取：在步骤2最后得到的软骨中按料液比1: 10～25（w/v）置于乙酸溶液（0.46~0.54 mol/L）中，搅拌提取18～36 h，经15 000～20 000rpm离心15～30 min，收集沉淀物；按料液比1: 10～25 (w/v)向沉淀物中加入乙酸溶液（0.46~0.54 mol/L），按照软骨重量的2.5～3.0%加入猪胃蛋白酶（≥3800U/g），于2~5℃下搅拌提取48～72 h，15 000～20000rpm离心20～30 min，取上清液；
4）透析：将步骤3最后得到的上清液装入透析袋，并放入Tris-HCl磷酸缓冲液（0.046~0.053 mol/L，pH为7.2~7.8）中，并在缓冲液中添加NaCl至溶液最终浓度为2.6～3.0 mol/L，透析24～36 h至析出絮状物沉淀，15 000～20 000 rpm离心15～30 min得沉淀物。将得到的沉淀用乙酸溶液（0.46~0.54 mol/L）复溶后蒸馏水透析36～54 h，透析液冷冻干燥得鲟鱼软骨II型胶原蛋白；
5）超声波辅助酶解处理：在步骤3最后得到的沉淀物中加入Tris-HCl缓冲液（0.046~0.053 mol/L，pH为7.8~8.5），加入软骨重量的0.3～1.0%的胰蛋白酶，在300～500 w超声波辅助作用下，45～55℃水解2～4 h，将反应后提取液置于90℃水浴10～15 min，15 000～20000rpm离心15～30 min，上清液；
6）透析：将步骤5最后得到的上清液浓缩并装入透析袋，用蒸馏水透析36～54 h，透析液按体积加入1.0～1.5倍（v/v）90~98%的乙醇溶液，再逐渐加入NaOH至其浓度为0.5～1.0mol/L，于2~5℃下静置12～16 h，离心得白色沉淀；白色沉淀转移至透析袋，用蒸馏水透析8～12 h，透析液干燥处理，得鲟鱼软骨硫酸软骨素；
7）成品：按配方量混合鲟鱼软骨II型胶原蛋白、鲟鱼软骨硫酸软骨素、氨基葡萄糖和酪蛋白钙，制成制剂，得到一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物。
实施例2：
1）鲟鱼软骨II型胶原蛋白的制备：
①鲟鱼软骨组织捣碎机中破碎，按料液比1:15（w/v）加入NaOH溶液（0.1 mol/L），于4℃下搅拌30 h（NaOH溶液每5h更换一次），18 000rpm离心25 min，收集沉淀物并洗至中性，按料液比1:20（w/v）加入正丁醇溶液（15%）浸泡48 h除去残留的脂肪，1:15（w/v）向固体物中加入EDTA-2Na溶液（pH 7.4，0.5 mol/L）浸泡18 h（EDTA-2Na溶液每3 h更换一次），脱钙；最后软骨固体物用蒸馏洗至中性、干燥。
②将上述预处理的鲟鱼软骨按料液比1: 15（w/v）置于乙酸溶液（0.5 mol/L）中，搅拌提取30 h，经18 000rpm离心20 min，收集沉淀物；按料液比1:15 (w/v)向沉淀物中加入乙酸溶液（0.5 mol/L），按照软骨重量的2.5%加入猪胃蛋白酶（≥3800U/g），于4 ℃下搅拌提取64 h，15rpm离心20min，上清液装入透析袋放入Tris-HCl磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）中，添加NaCl至溶液最终浓度为2.8 mol/L，透析30 h至析出絮状物沉淀，20 000rpm离心25 min得沉淀物。将得到的沉淀用乙酸溶液（0.5 mol/L）复溶后蒸馏水透析48 h，透析液冷冻干燥得鲟鱼软骨II型胶原蛋白。
2）鲟鱼软骨硫酸软骨素的制备：
①超声波辅助酶解处理：取鲟鱼软骨II型胶原蛋白提取后的残留物加入到Tris-盐酸缓冲液（0.05mol/L，pH 7.8），加入软骨重量的0.5%的胰蛋白酶，在400 w超声波辅助作用下，50℃水解4 h，将反应后提取液置于90℃水浴10 min，20 000rpm离心20 min，得上清液；
②上清液浓缩至原1/3体积装入透析袋，用蒸馏水透析48 h，透析液按体积加入1.5倍（v/v）95%乙醇，再逐渐加入NaOH至其浓度为0.8 mol/L，于4 ℃下静置16 h，离心得白色沉淀；白色沉淀转移至透析袋，用蒸馏水透析12 h，透析液干燥处理，得鲟鱼软骨硫酸软骨素。
3）一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物及其制备方法如下：
①取鲟鱼软骨II型胶原蛋白850g，鲟鱼软骨硫酸软骨素50g，氨基葡萄糖100g，酪蛋白钙5g混合均匀，过100目筛；
② 将混合物粉末上胶囊填充机进行充填。制成0.3g/粒的胶囊。
③ 经包装、成品检验，得到产品。
实施例3：
1）鲟鱼软骨II型胶原蛋白的制备：
①鲟鱼软骨组织捣碎机中破碎，按料液比1:20（w/v）加入NaOH溶液（0.1 mol/L），于3℃下搅拌30 h（NaOH溶液每5h更换一次），18 000rpm离心25 min，收集沉淀物并洗至中性，按料液比1:20（w/v）加入正丁醇溶液（15%）浸泡48 h除去残留的脂肪，1:15（w/v）向固体物中加入EDTA-2Na溶液（pH 7.4，0.5 mol/L）浸泡18 h（EDTA-2Na溶液每3 h更换一次），脱钙；最后软骨固体物用蒸馏洗至中性、干燥。
②将上述预处理的鲟鱼软骨按料液比1: 20（w/v）置于乙酸溶液（0.5 mol/L）中，搅拌提取30 h，经18 000rpm离心20 min，收集沉淀物；按料液比1:15 (w/v)向沉淀物中加入乙酸溶液（0.5 mol/L），按照软骨重量的2.5%加入猪胃蛋白酶（≥3800U/g），于4 ℃下搅拌提取64 h，15rpm离心20min，上清液装入透析袋放入Tris-HCl磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）中，添加NaCl至溶液最终浓度为2.8 mol/L，透析30 h至析出絮状物沉淀，20000rpm离心25 min得沉淀物。将得到的沉淀用乙酸溶液（0.5 mol/L）复溶后蒸馏水透析48 h，透析液冷冻干燥得鲟鱼软骨II型胶原蛋白。
2）鲟鱼软骨硫酸软骨素的制备：
①超声波辅助酶解处理：取鲟鱼软骨II型胶原蛋白提取后的残留物加入到Tris-盐酸缓冲液（0.05mol/L，pH 7.8），加入软骨重量的0.7%的胰蛋白酶，在400 w超声波辅助作用下，50℃水解4 h，将反应后提取液置于90℃水浴13min，20000rpm离心20 min，得上清液；
②上清液浓缩至原1/3体积装入透析袋，用蒸馏水透析48 h，透析液按体积加入1.5倍（v/v）95%乙醇，再逐渐加入NaOH至其浓度为0.8 mol/L，于3℃下静置16 h，离心得白色沉淀；白色沉淀转移至透析袋，用蒸馏水透析12 h，透析液干燥处理，得鲟鱼软骨硫酸软骨素。
3）一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物及其制备方法如下：
①取鲟鱼软骨II型胶原蛋白850g、鲟鱼软骨硫酸软骨素50g、氨基葡萄糖100g、酪蛋白钙5g、白桦脂酸0.02g和人寡肽-10.01g混合均匀，过100目筛。上述配方能增加软骨细胞的活力，促进软骨细胞的生成，修补因长期磨损而变得畸形的软骨；同时能大量催生和补充关节滑液，减少关节之间的摩擦，对关节起到保护作用；白桦脂酸和人寡肽-1不仅能促进软骨细胞中胶原蛋白和粘多糖的合成，从而增加软骨细胞的活力，而且还能促进骨胶原蛋白的生成，增加骨密度；
② 将混合物粉末上胶囊填充机进行充填。制成0.3g/粒的胶囊。
③ 经包装、成品检验，得到产品。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物，其特征在于成份及其重量份为鲟鱼软骨II型胶原蛋白80~95份、鲟鱼软骨硫酸软骨素1~10份、氨基葡萄糖5~15份和酪蛋白钙0.1~1份。
2.一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物的制备方法，其特征在于以下步骤：
1）脱脂：将鲟鱼软骨组织破碎后加入NaOH溶液，搅拌，离心取沉淀，洗涤后加入正丁醇溶液，浸泡并过滤；
2）脱钙：向步骤1最后得到的固形物中加入EDTA-2Na溶液，浸泡，离心取沉淀后洗涤，干燥；
3）提取：在步骤2最后得到的软骨中加入乙酸溶液中，搅拌提取，离心取沉淀物，在沉淀物中加入乙酸溶液和猪胃蛋白酶，搅拌提取，离心取上清液；
4）透析：将步骤3最后得到的上清液装入透析袋，并放入Tris-HCl磷酸缓冲液中，并在缓冲液中加入NaCl，透析至析出絮状沉淀，离心取沉淀物，将所得沉淀用乙酸溶液复溶后蒸馏水透析，将透析液冷冻干燥得到鲟鱼软骨II型胶原蛋白；
5）超声波辅助酶解处理：在步骤3最后得到的沉淀物中加入Tris-HCl缓冲液和胰蛋白酶，在超声波辅助作用下水解，离心取上清液；
6）透析：将步骤5最后得到的上清液浓缩并装入透析袋，用蒸馏水透析，在透析液中加入乙醇，再逐渐加入NaOH，低温静置后离心取沉淀物，将沉淀转移至透析袋中，用蒸馏水透析，将透析液干燥得鲟鱼软骨硫酸软骨素；
7）成品：按配方量混合鲟鱼软骨II型胶原蛋白、鲟鱼软骨硫酸软骨素、氨基葡萄糖和酪蛋白钙，制成制剂，得到一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物。
3.根据权利要求2所述的一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤1中按料液比1:10～25w/v加入0.08~0.14mol/L的 NaOH溶液，于2~5℃条件下搅拌18～36 h，NaOH溶液每4～8 h更换一次。
4.根据权利要求2所述的一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤2中按料液比1：10~20w/v加入EDTA-2Na溶液，浸泡18~30h，EDTA-2Na溶液每3～6 h更换一次，EDTA-2Na溶液的浓度为0.42~0.49 mol/L，pH为7.0~8.0。
5.根据权利要求2所述的一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤3中均按料液比1:10~25w/v加入0.46~0.54 mol/L的乙酸溶液，加入的猪胃蛋白酶酶活度大于3800U/g，加入量为软骨重量的2.5～3.0%，于2~5℃条件下搅拌提取48～72 h。
6.根据权利要求2所述的一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤4中Tris-HCl磷酸缓冲液浓度为0.046~0.053 mol/L，pH为7.2~7.8，添加NaCl至溶液最终浓度为2.6～3.0 mol/L，透析24～36 h至析出絮状物沉淀。
7.根据权利要求2所述的一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤5中Tris-HCl缓冲液浓度为0.046~0.053 mol/L，pH为7.8~8.5，加入的胰蛋白酶为软骨重量的0.3～1.0%，超声波功率为300～500 W，45～55℃水解2～4 h。
8.根据权利要求2所述的一种基于鲟鱼软骨活性成分的关节修复组合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤6中蒸馏水透析36～54 h，透析液按体积加入1.0～1.5倍v/v90~98%的乙醇，再逐渐加入NaOH至其浓度为0.5～1.0mol/L，于2~5℃下静置12～16 h。
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