CN107115357A - 一种小牛血去蛋白提取物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，该方法包括血液前处理、高速离心处理、无机陶瓷膜过滤处理等步骤，其提取物能更好的除去大分子物质，富聚小分子活性物质，且在提取物中添加维生素C，其能增强提取物的稳定性，氨基酸和小分子肽不易聚合成高分子肽，制得的小牛血去蛋白提取物质量稳定，药效更佳。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是涉及一种小牛血去蛋白提取物的制备方法。
技术背景
小牛血去蛋白提取物(protein-free calf blood extract)是小牛血去蛋白提取物注射液的主要原料。小牛血去蛋白提取物是1-6个月的幼牛血经过除蛋白后得到的小分子生物活性物质，其主要成分为氨基酸、小肽、核酸及其它含氮化合物。小牛血去蛋白提取物可显著提高网状内皮系统活力，提高酶活性，加速细胞的氧化磷酸化反应和ATP的合成，激活细胞呼吸，促进新陈代谢，加快组织再生。该药物对脑神经损伤、脑卒中及脑梗塞等疾病有积极的治疗效果,同时还具有眼角膜修复、增强记忆力等作用，在临床上应用广泛。
但小牛血去蛋白提取物溶液其主要成分氨基酸和小肽在自然状态下可互相聚合组成大分子量的肽，而肽又可聚合成高分子肽，以聚合物形式析出或以高分子肽形式存在于溶液中，使药品产生抗原性并降低了药品的生物活性，这就是小牛血去蛋白提取物溶液引起临床过敏反应增加的主要原因，随着保存时间的延长，不良反应发生率也随即增加，并且在临床用药时是将小牛血去蛋白提取物溶液溶于糖、盐水中使用，这样不但增加了药品被污染的几率，影响药品使用的安全性。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，该方法包括血液处理、高速离心处理、无机陶瓷膜过滤处理等步骤制备而成，其提取物能更好的除去大分子物质，富聚小分子活性物质，且在提取物中添加维生素C，其能增强提取物的稳定性，氨基酸和小分子肽不易聚合成高分子肽，制得的小牛血去蛋白提取物质量稳定，药效得到了提高。
具体地，一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)小牛血液处理液：取小牛血液加入1倍量含1-3％稀氯化钠水溶液搅拌混合均匀，快速升温至80-90℃后，放入冷冻箱中冷冻至-1℃，冷冻10-20min，备用。
(2)离心处理：将步骤(1)处理后的小牛血液，倒入离心机中进行离心，转速为2000r-3000r/min，离心2-6min，待离心结束后，经离心的血液静置1-2h，取上清液，备用。
(3)无机陶瓷膜过滤：将上述上清液，放入冷冻箱中，进行冷冻处理，待温度降至-1℃后，上无机陶瓷膜过滤器过滤，滤液，减压浓缩至1/2滤液，得到小牛血去蛋白提取液。
(4)在步骤(3)中制得的小牛血去蛋白提取液中，加入维生素C,使提取液中维生素C质量百分数为1-3％，即得到本发明所述的小牛血去蛋白提取物。
上述所述的步骤(1)是取小牛血液加入1倍量含2％稀氯化钠水溶液搅拌混合均匀，快速升温至85℃后，放入冷冻箱中冷冻至-1℃，冷冻15min，备用。
上述所述的步骤(2)将步骤(1)处理后的小牛血液，倒入离心机中进行离心，转速为2500r/min，离心4min，待离心结束后，经离心的血液静置1.5h，取上清液，备用。
上述所述的步骤(3)所述的无机陶瓷膜过滤为孔径2-50nm的陶瓷膜，优选孔径为20-30nm，更优选孔径为25nm。
上述所述的步骤(4)是在步骤(3)中制得的小牛血去蛋白提取液中，加入维生素C,调节提取液中维生素C质量百分数为1-3％，即得到本发明所述的小牛血去蛋白提取物。
本发明的有益效果：
本发明提供的小牛血去蛋白提取物的制备方法，其通过快速升温再进行冷冻处理，其能更好的促使大分子物质变性，利于后续离心处理，除去大分子蛋白，例外本发明采用了无机陶瓷膜过滤技术，并利用蛋白质溶解度低的特性，采用冷液过滤，其提取的小牛血去蛋白活性高，药效更为显著，例外，本发明在提取液中加入一定量的维生素C，其能提高提取物溶液的稳定性，使临床用药更为安全。
本发明为了进一步对本发明的有益效果进行阐述，还列举了如下的试验，旨在说明本发明的技术效果，但绝不对本发明的保护范围作任何限定。
1、小牛血去蛋白提取物提取工艺筛选：
提取过程中，影响提取物质量的因素主要为：血液前处理、过滤方式，因此试验以高分子物质作为考察指标，进行提取工艺研究，其试验结果如下1-3：
表1：不同的血液前处理对提取物质量的影响
上述实验表明：本发明采用小牛血液加入1倍量含1-3％稀氯化钠水溶液搅拌混合均匀，快速升温至80-90℃后，放入冷冻箱中冷冻至-1℃，冷冻10-20min，的血液前处理方式，得到的提取物大分子物质含量最低，其中热处理温度为80-90℃最佳。
表2：不同过滤方式对小牛血去白蛋提取物质量的影响
上述试验数据表明：本发明采用冷液上无机陶瓷膜过滤器的方式，其提取物含大分子物质量最小，质量安全。
表3：不同稳定剂对提取物加速稳定性的考察
注：加速稳定性试验条件为：温度为32℃，相对湿度为86％。
上述试验表明：本发明采用小牛血去蛋白提取物中添加维生素C，作为稳定剂，其经3个月的加速温度性试验，其产品稳定性明显优于吐温组和不添加任何稳定剂组。
上述试验表明，本发明筛选得到的小牛血去蛋白提取物制备方法，其操作简单，制得的提取物含大分子物质低，质量稳定性好，能克服现有提取物中氨基酸和小肽在自然状态下可互相聚合组成大分子量的肽，使药品产生抗原性并降低了药品的生物活性，用药风险等缺陷。
具体实施方式：
实施例1：小牛血去蛋白提取物的制备
(1)取小牛血液加入1倍量含1％稀氯化钠水溶液搅拌混合均匀，快速升温至80℃后，放入冷冻箱中冷冻至-1℃，冷冻10-20min，备用。
(2)将步骤(1)处理后的小牛血液，倒入离心机中进行离心，转速为2000rr/min，离心2-6min，待离心结束后，经离心的血液静置1h，取上清液，备用。
(3)将上述上清液，放入冷冻箱中，进行冷冻处理，待温度降至-1℃后，上无机陶瓷膜过滤器过滤，滤液，减压浓缩至1/2滤液，得到小牛血去蛋白提取液。
(4)在步骤(3)中制得的小牛血去蛋白提取液中，加入维生素C,调节提取液中维生素C质量百分数为1％，即得到本发明所述的小牛血去蛋白提取物。
实施例2：小牛血去蛋白提取物的制备
(1)小牛血液处理液：取小牛血液加入1倍量含2％稀氯化钠水溶液搅拌混合均匀，快速升温至85℃后，放入冷冻箱中冷冻至-1℃，冷冻15min，备用。
(2)离心处理：将步骤(1)处理后的小牛血液，倒入离心机中进行离心，转速为2500r/min，离心4min，待离心结束后，经离心的血液静置1.5h，取上清液，备用。
(3)无机陶瓷膜过滤：将上述上清液，放入冷冻箱中，进行冷冻处理，待温度降至-1℃后，上无机陶瓷膜过滤器过滤，滤液，减压浓缩至1/2滤液，得到小牛血去蛋白提取液。
(4)在步骤(3)中制得的小牛血去蛋白提取液中，加入维生素C,使提取液中维生素C质量百分数为2％，即得到本发明所述的小牛血去蛋白提取物。
实施例3：小牛血去蛋白提取物的制备
(1)小牛血液处理液：取小牛血液加入1倍量含3％稀氯化钠水溶液搅拌混合均匀，快速升温至90℃后，放入冷冻箱中冷冻至-1℃，冷冻20min，备用。
(2)离心处理：将步骤(1)处理后的小牛血液，倒入离心机中进行离心，转速为3000r/min，离心2-6min，待离心结束后，经离心的血液静置2h，取上清液，备用。
(3)无机陶瓷膜过滤：将上述上清液，放入冷冻箱中，进行冷冻处理，待温度降至-1℃后，上无机陶瓷膜过滤器过滤，滤液，减压浓缩至1/2滤液，得到小牛血去蛋白提取液。
(4)在步骤(3)中制得的小牛血去蛋白提取液中，加入维生素C,使提取液中维生素C质量百分数为3％，即得到本发明所述的小牛血去蛋白提取物。
Claims (7)
1.一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)小牛血液处理液：取小牛血液加入1倍量含1-3％稀氯化钠水溶液搅拌混合均匀，快速升温至80-90℃后，放入冷冻箱中冷冻至-1℃，冷冻10-20min，备用。
(2)离心处理：将步骤(1)处理后的小牛血液，倒入离心机中进行离心，转速为2000r-3000r/min，离心2-6min，待离心结束后，经离心的血液静置1-2h，取上清液，备用。
(3)无机陶瓷膜过滤：将上述上清液，放入冷冻箱中，进行冷冻处理，待温度降至-1℃后，上无机陶瓷膜过滤器过滤，滤液，减压浓缩至1/2滤液，得到小牛血去蛋白提取液。
(4)在步骤(3)中制得的小牛血去蛋白提取液中，加入维生素C,使提取液中维生素C质量百分数为1-3％，即得到本发明所述的小牛血去蛋白提取物。
2.根据权利要求1所述的小牛血去蛋白提取物的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)是取小牛血液加入1倍量含2％稀氯化钠水溶液搅拌混合均匀，快速升温至85℃后，放入冷冻箱中冷冻至-1℃，冷冻15min，备用。
3.根据权利要求1所述的小牛血去蛋白提取物的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)是将步骤(1)处理后的小牛血液，倒入离心机中进行离心，转速为2500r/min，离心4min，待离心结束后，经离心的血液静置1.5h，取上清液，备用。
4.根据权利要求1所述的小牛血去蛋白提取物的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)无机陶瓷膜过滤膜为孔径2-50nm的陶瓷膜。
5.根据权利要求1所述的小牛血去蛋白提取物的制备方法，其特征在于：所述的无机陶瓷膜过滤膜为孔径20-30nm的陶瓷膜。
6.根据权利要求1所述的小牛血去蛋白提取物的制备方法，其特征在于：所述的无机陶瓷膜过滤膜为孔径25nm的陶瓷膜。
7.根据权利要求1所述的小牛血去蛋白提取物的制备方法，其特征在于：所述的步骤(4)是在步骤(3)中制得的小牛血去蛋白提取液中，加入维生素C,调节提取液中维生素C质量百分数为2％，即得到本发明所述的小牛血去蛋白提取物。
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