CN107107058A - 高清晰度微液滴打印机 - Google Patents
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Abstract
提供用于递送离散实体至基质的方法，所述离散实体包括，例如，细胞、介质或试剂。在某些方面中，所述方法包括处理和/或分析所述实体或其生物组分的质量。在一些实施方式中，所述方法可用于产生微环境的阵列和/或用于组织或结构的二维和三维打印。还提供了用于实践主题方法的系统和装置。
Description
交叉参考
本申请要求2015年2月4日提交的美国临时申请号62/112,068和2014年10月22日提交的美国临时申请号62/067,314的优先权，其全文通过引用纳入本文并用于所有目的。
政府支持
本发明得到政府支持，在国立卫生研究院授予的基金号1R21HG007233-02、1DP2AR068129-01和1R01EB019453-01，国防部授予的基金号HR0011-12-C-0065、N66001-12-C-4211和HR0011-12-C-0066，以及国家科学基金授予的基金号DBI-1253293的资助下完成。政府对本发明拥有一定的权利。
绪论
液滴微流体的开发为针对单一细胞和小试剂体积的高通量处理和分析提供了强有力的工具集。然而，一般对单行(single file)流动通过微流体装置的子区域的液滴进行测量和液滴处理，因此，限制了对延长时间段进行测量或对特定液滴进行靶向试剂添加的能力。
发明概述
提供了将离散实体递送至基质的方法，所述离散实体包括，例如，细胞、介质和/或包封于其中的试剂。在某些方面中，所述方法包括处理和/或分析离散实体或包封于其中的生物材料的质量。在一些实施方式中，所述方法可用于产生微环境的阵列和/或用于组织或结构的二维和三维打印。还提供了用于实践主题方法的系统和装置。
本发明提供将离散实体递送至基质的方法，例如，通过：使多个离散实体在载流中流动通过微流体装置，其中，所述离散实体不溶于所述载流和/或不与所述载流混溶；通过递送孔口，将所述载流和所述多个离散实体中的一个或多个导向至所述基质；和，使所述多个离散实体中的一个或多个附着至所述基质。
本发明还提供打印一个或多个细胞层的方法，例如，通过：将细胞包封在液滴中，所述液滴包含水性流体，以提供含有细胞的液滴；使包含所述含有细胞的液滴的多个液滴在载流中流动通过微流体装置，其中所述载流不与所述水性流体混溶；通过递送孔口，将所述载流和多个所述含有细胞的液滴导向至基质；和，使多个所述含有细胞的液滴附着至所述基质，以提供含有细胞的液滴的第一层，其中所述基质在第一表面上包含流体层，其可与所述载流混溶但不与所述水性流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的流体层之后，多个所述含有细胞的液滴附着至所述基质的第一表面。
本发明还提供打印和检测一个或多个细胞的方法，例如，通过：将细胞包封在液滴中，所述液滴包含水性流体，以提供含有细胞的液滴；使包含所述含有细胞的液滴的多个液滴在载流中流动通过微流体装置，其中所述载流不与所述水性流体混溶；通过递送孔口，将所述载流和多个所述含有细胞的液滴导向至所述基质；使多个所述含有细胞的液滴附着至所述基质，其中所述基质在第一表面上包括流体层，其可与所述载流混溶但不与所述水性流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的流体层之后，多个所述含有细胞的液滴附着至所述基质的第一表面；和，检测附着的含有细胞的液滴中的一个或多个细胞、附着的含有细胞的液滴中的一个或多个细胞的组分，或附着的含有细胞的液滴中的一个或多个细胞的产物。
本发明还提供打印三维结构的方法，例如，通过：使离散实体在载流中流动通过微流体装置，其中所述离散实体不溶于所述载流和/或不与所述载流混溶；和，通过递送孔口，将所述载流和第一组(first plurality of)离散实体导向至基质，以在其上提供第一层；通过所述递送孔口，将所述载流和第二组(second plurality of)离散实体导向至第一层，以在其上提供第二层；和，一个或多个其它导向步骤，其中，通过所述递送孔口，将多个所述离散实体导向至紧接的上一层，以在其上提供后续的层，其中，提供多层、三维结构。
本发明还提供从递送孔口递送液滴的方法，例如，通过：使多个液滴在载流中流动通过微流体装置，其中，所述微流体装置包括分选器；检测所述多个液滴中的一个或多个，以提供一个或多个经检测的液滴；通过所述分选器，从所述多个液滴分选所述一个或多个经检测的液滴；和，将所述载流和所述一个或多个经检测的液滴导向通过所述递送孔口。
本发明还提供使液滴附着至基质的方法，例如，通过：通过孔口，将液滴在第一载流中从微流体装置递送至基质表面；使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；和，通过力，使所述液滴附着至所述基质表面。
本发明还提供使附着的液滴在基质上移动的方法，例如，通过：通过孔口，将液滴在第一载流中从微流体装置递送至基质表面；使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；和，调节所述力，从而使所述液滴从其附着的位置移动至另一个位置，和/或，施加第二力，其单独或与该经调节的力联合足以使所述液滴从其附着的位置移动至另一个位置。
本发明还提供添加试剂至液滴的方法，例如，通过：通过孔口，将第一液滴在第一载流中从微流体装置递送至基质表面；使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；将第二液滴递送至与附着至所述基质表面的第一液滴相同的位置，或邻近或靠近所述基质表面上的第一液滴的位置；和，使第一液滴与第二液滴聚结，从而，合并第一液滴和第二液滴的内容物。
本发明还提供添加试剂至液滴的方法，例如，通过：通过第一孔口，将液滴在第一载流中从微流体装置递送至基质表面；使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；将与试剂来源流体连接的第二孔口插入所述液滴；和，通过第二孔口，将一种或多种试剂注入所述液滴。
本发明还提供回收附着的液滴的全部或部分的方法，例如，通过：通过孔口，将液滴在第一载流中从微流体装置递送至基质表面；使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；和，回收附着的液滴的全部或部分。
本发明还提供处理附着的液滴的方法，例如，通过：通过孔口，将液滴在第一载流中从微流体装置递送至基质表面；使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；和，调节所述液滴的直接环境，由此调节所述液滴的内容物。
本发明还提供处理附着的液滴的方法，通过：通过孔口，将液滴在第一载流中从微流体装置递送至基质表面；使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；至少部分固化(solidify)附着的液滴；从所述基质表面移去第二载流，其中，在附着的液滴至少部分固化之前，第二载流与附着的液滴的内容物不混溶；用可混溶的流体替代被移去的第二载流；和，调节所述可混溶的流体的化学组成，由此调节附着的液滴。
本发明还提供对附着的液滴中的细胞穿孔(porating)的方法，例如，通过：通过孔口，将液滴在第一载流中从微流体装置递送至基质表面，其中所述液滴包括细胞；使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；和，对所述液滴中的所述细胞穿孔。
本发明还提供分析基质上的液滴的方法，例如，通过：通过孔口，将液滴在第一载流中从微流体装置递送至基质表面；使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；和，检测附着的液滴的一种或多种组分。
本发明还提供将离散实体递送至基质的方法，例如，通过：使多个第一离散实体在第一载流中流动通过第一微流体装置，其中所述第一离散实体在第一载流中不溶解和/或不混溶，并且其中，所述第一微流体装置包括第一递送孔口；通过第一递送孔口，将第一载流和所述多个第一离散实体中的一个或多个导向至所述基质；使多个第二离散实体在第二载流中流动通过第二微流体装置，其中所述第二离散实体在第二载流中不溶解和/或不混溶，并且其中，所述第二微流体装置包括第二递送孔口；通过第二递送孔口，将第二载流和所述多个第二离散实体中的一个或多个导向至所述基质；和，使所述多个第一离散实体中的一个或多个和所述多个第二离散实体中的一个或多个附着至所述基质。
本发明还提供将离散实体递送至基质的方法，例如，通过：使多个离散实体于载流中流动通过微流体装置，其中所述离散实体不溶于所述载流和/或不与所述载流混溶，并且其中，所述微流体装置包括多个递送孔口；通过所述多个递送孔口中的第一递送孔口，将所述载流和所述多个离散实体中的第一一个或多个导向至所述基质；通过所述多个递送孔口中的第二递送孔口，将所述载流和所述多个离散实体中的第二一个或多个导向至所述基质；和，使多个第一离散实体中的第一一个或多个，和所述多个离散实体中的第二一个或多个附着至所述基质。
本发明还提供分析液滴的方法，例如，通过：使多个液滴在载流中流动通过微流体装置，将独特标识物分子包封进入或纳入所述多个液滴，从而所述多个液滴中的各液滴包括不同的独特标识物分子；通过孔口，将所述多个液滴在第一载流中从微流体装置递送至基质表面；使所述多个液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；通过力，使所述多个液滴附着至所述基质表面；对于各附着的多个液滴，回收附着的液滴的全部或部分和各液滴的独特标识物；联合所述独特标识物，分析回收的液滴或回收的其部分，其中，基于所述独特标识物的存在，将所述分析的结果鉴定为特定于源自特定液滴的材料。
本发明还提供进行定量PCR的方法，例如，通过：将核酸的异质群体分隔成包含水性流体的多个液滴；将定量的PCR试剂包封进入或纳入所述多个液滴；使所述多个液滴在载流中流动通过微流体装置，其中所述载流不与所述水性流体混溶；通过递送孔口，将所述载流和多个液滴导向至基质；使所述多个液滴附着至所述基质，其中所述基质在第一表面上包括流体层，其可与所述载流混溶但不与所述水性流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的所述流体层之后，所述多个液滴附着至所述基质的第一表面；在足以供于核酸扩增的条件下，孵育附着的多个液滴；和，随时间推移检测核酸扩增。
本发明还提供对单细胞核酸测序的方法，例如，通过：将异质的多个细胞分隔成包含水性流体的多个液滴，从而各液滴包括不多于一个细胞；使所述多个液滴经历足以使其中所含的细胞裂解并释放细胞核酸的条件；将独特核酸标识物分子包封进入或纳入所述多个液滴，从而所述多个液滴的各液滴包括不同的独特核酸标识物分子；将所述独特核酸标识物分子连接至所述多个液滴中的一个或多个细胞核酸或连接至其扩增产物；使所述多个液滴在第一载流中流动通过微流体装置；通过孔口，将所述多个液滴在第一载流中从所述微流体装置递送至基质表面；使所述多个液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；通过力，使所述多个液滴附着至所述基质表面；对于各附着的多个液滴，回收附着的液滴的全部或部分，包括细胞核酸和各液滴的独特核酸标识物；连同所述独特标识物分子一起，对来自回收的液滴或回收的其部分的核酸测序，其中，如果核酸分子的序列读出中存在所述独特标识物分子的序列，则将所述核酸分子鉴定为源自特定细胞。
本发明还提供在基质上合成聚合物的方法，例如，通过：使包含第一液滴流体的第一液滴在载流中流动通过微流体装置，其中所述第一液滴包括第一聚合物或第一单体；通过递送孔口，将所述载流和第一液滴导向至所述基质；使第一液滴附着至所述基质，其中所述基质在第一表面上包括流体层，其可与所述载流混溶但不与第一液滴流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的所述流体层之后，第一液滴附着至所述基质的第一表面的预定位置处；使第二液滴在所述载流中流动通过所述微流体装置，其中所述第二液滴包括第二聚合物或第二单体；通过所述递送孔口，将所述载流和第二液滴导向至第一液滴附着的预定位置处；在足以使第一和第二液滴的内容物接触并且使第一聚合物或第一单体与第二聚合物或单体形成共价键的条件下，孵育第一和第二液滴，由此产生合成的聚合物。
本发明还提供分析基质上的液滴的方法，例如，通过：将包含多个文库成员的分子文库分隔成包含水性流体的多个液滴；通过孔口，将所述多个液滴在第一载流中从微流体装置递送至基质表面；使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；和，在附着的液滴中，与所述文库成员进行一个或多个反应；检测附着的液滴中的所述一个或多个反应的结果和/或回收附着的液滴的全部或部分用于进一步分析。
本发明还提供打印微阵列的方法，例如，通过：通过孔口，将多个液滴在第一载流中从微流体装置递送至基质表面，其中各所述多个液滴包括分子；使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；通过力，使所述液滴在预定位置处附着于所述基质表面；在适于使附着的液滴所含的分子化学键合至所述基质表面的条件下，孵育所述基质，由此提供结合基质的分子的阵列。
本发明还提供进行原位测序的方法，例如，通过：使多个液滴在载流中流动通过微流体装置，将独特核酸标识物分子包封进入或纳入所述多个液滴，从而所述多个液滴的各液滴包括不同的独特核酸标识物分子的一个或多个拷贝；通过孔口，将所述多个液滴在第一载流中动微流体装置递送至组织基质的表面；将所述多个液滴在第二载流中于所述组织基质的表面上定位；通过力，使所述多个液滴附着至所述组织基质的表面；在足以使来自各个附着的液滴的独特核酸标识物分子与该附着的液滴附近的组织基质中所含的核酸结合的条件下，孵育所述组织基质；对所述独特核酸标识物分子以及它们结合的核酸进行测序；和，利用所述独特核酸标识物分子，对与特定液滴附着的位置相对应的位置处的组织基质中所含的核酸进行鉴定和/或定量。
本发明还提供处理细胞或胚胎的方法，例如，通过：使多个液滴在载流中流动通过微流体装置，其中所述多个液滴的各液滴包括水性流体和受精的卵细胞或胚胎，并且其中，所述载流不与所述水性流体混溶；通过递送孔口，将所述载流和所述多个液滴导向至基质；使所述多个液滴附着至所述基质，其中所述基质在其表面上包括流体层，其可与所述载流混溶但不与所述水性流体混溶，并且其中，在引入所述基质的表面上的流体层之后，所述多个液滴附着至所述基质的表面；检测附着的多个液滴中的一个或多个胚胎的发育；和，从附着的液滴中选择并回收胚胎。
本发明还提供处理细胞或胚胎的方法，例如，通过：使多个液滴在载流中流动通过微流体装置，其中所述多个液滴的各液滴包括水性流体和未受精的卵细胞，并且其中，所述载流不与所述水性流体混溶；通过递送孔口，将所述载流和所述多个液滴导向至基质；使所述多个液滴中的一个或多个所述卵细胞受精；使所述多个液滴附着至所述基质，其中所述基质在其表面上包括流体层，其可与所述载流混溶但不与所述水性流体混溶，并且其中，在引入所述基质的表面上的流体层之后，所述多个液滴附着至所述基质的表面；检测附着的液滴中的胚胎的发育；和，从附着的液滴选择并回收特定胚胎。
本发明还提供可用于实施本文所述的方法的系统和装置。例如，本发明提供液滴打印机，其包括，例如：微流体装置，其包括一个或多个液滴制造器和一个或多个流道，其中所述一个或多个流道流体连通至所述一个或多个液滴制造器，并且经设置以从那里接收一个或多个液滴；递送孔口，其流体连通至所述一个或多个流道中的一个或多个；和，自动化的系统，所述系统与所述递送孔口整合，其中所述自动化的系统(a)在处理过程中将所述递送孔口选择性地定位至基质附近或(b)在处理过程中将所述基质选择性地定位至所述递送孔口附近，从而液滴可从所述递送孔口喷出并沉积在所述基质上。
本发明还提供系统，所述系统包括，例如，液滴打印机，其包括基质表面，所述基质表面用于接收由所述液滴打印机的递送孔口沉积的一个或多个液滴；和，如下一个或多个：(a)温度控制模块，其操作性地连接至所述液滴打印机，(b)检测器具，其操作性地连接至所述液滴打印机，(c)孵育器，其操作性地连接至所述液滴打印机，和(d)测序仪，其操作性地连接至所述液滴打印机；和，传送器，其经设置以将所述基质从第一液滴接收位置传送至(a)-(d)中的一个或多个。
本发明还提供基质，其可采用本文所述的方法、装置和系统来提供，例如，如下基质，其包括：基质表面，其包含不混溶的相流；和，液滴的有序阵列，其位于所述不混溶的相流中，其中所述液滴附着至所述基质表面，并且其中，所述液滴的有序阵列包含至少10,000个单独液滴。
本发明还提供电极阵列系统，例如，如下电极阵列系统，其包括：单独可控的电极的阵列，其嵌入基质材料中；电源；和，控制器，其中所述控制器经设置以选择性地允许或不允许所述电源和所述阵列中的各单独可控的电极之间的导电连接，由此分别提供活化电极(active electrode)和去活化电极(inactive electrode)，并且其中，当所述离散实体沉积在各活化电极附近时，所述活化电极能够使所述离散实体附着至所述活化电极附近的基质材料的表面。
附图简要说明
结合附图，通过以下详述更好地理解本发明。附图部分包括如下的附图：
图1提供本发明的微流体系统和方法的简化说明。
图2描述主题装置和相关的方法的一个实施方式，包括分选离散实体的方法。分图1-3中具体说明了再注射(reinjection)接合处、分选接合处和通过制造阳性或阴性分选的分选过程的实施方式。
图3提供本发明的一种类型的微流体系统和相关方法的简化示意图。说明的应用是将包含细胞的离散实体递送至基质。
图4说明主题装置和方法的多个方面，包括设计具有电极几何形状的基质，所述电极几何形状经设置以使所述基质的表面上具有高电场梯度，产生将液滴拉向所述基质表面的介电电泳力。显示将水性液滴沉积在基质表面上的示例性装置。在与所述表面接触后，施加电场使将水性液滴与基质表面分离不混溶的载流(例如，油)的薄膜失稳，致使所述液滴润湿该表面。一旦润湿，液滴以与施加的介电电泳力相关联的方式进一步展平。高电场梯度通过几何形状产生，其中带电的特征部(charged feature)以小距离分隔。这可通过用AC信号激发一个特征部并且使相对-特征部(counter-feature)接地来产生。如果相对-特征部不接地，仍可产生高电场梯度，因为相对-特征部中的电磁屏蔽(电荷重组)使其以类似接地通道的方式作用。
图5说明主题装置和方法的多个方面，包括图案化的基质，其具有离散实体可附着的空缺的位置，以及附着有离散实体的填充的位置。
图6，分图A-C，说明通过施加力(例如，介电电泳力)使微流体装置中产生的离散实体(例如，液滴)附着至基质的一个实施方式。分图A显示从微流体喷嘴射出的液滴。分图B显示在隔离电极特征部的间隙处捕获的液滴。分图C说明由施加介电电泳力所致的捕获的液滴的拉伸。
图7，分图A-D，说明可采用本发明的方法、装置和系统实现的孔板和突出的阵列密度的方面。分图A：标准384孔板。分图B：可采用主题方法产生的“孔”板。分图C：其上具有具有四个相邻附着的液滴的基质的侧视图和顶视图。分图D：显示例如采用超微量(Picodrop)液滴打印的主题方法如何能够增加标准孔板足迹中的阵列密度。
图8提供本发明的系统的示意图。液滴微流体打印头，包括用出口喷嘴改良的紧凑型微流体液滴分选器，悬置于倒置显微镜的平台上方。流动通过分选器的液滴被荧光标记，并且由耦合至外部检测光学器件的激光器在装置中被检测到。当需检测到所需液滴时，其被主动分选至喷嘴并引导至目标表面。恒定的载流(例如，油)背景流使该液滴与介电电泳阱(dielectrophoretic trap)紧密接触。将在其表面中具有双极(biopolar)电极图案化的定制基质置于显微镜的xy平台上，并作为供于液滴沉积的目标。具有高电场梯度的该基质上的特定区域，通过使液滴朝向这些区域移动并润湿到这些区域上，作为供于液滴的介电电泳阱。在该实例中，打印头的喷嘴保持固定，而基质水平平移(translate)。
图9提供来自液滴打印示例的图像。打印头和介电电泳阱的网络是可见的，并且处于图像的平面中。沿着该图像顶部可见打印至该表面的一系列液滴。
图10，分图A-C，提供(a)根据本发明实施方式的液滴分选器的示意图，其中，检测到且选择性地移位(displace)的黑色液滴被具有减小的通道高度的有间隙的分隔物(gapped divider)分离。(b)仍然来自22kHz分选的高速影片。采用常规硬壁分隔物，未完全移位的液滴被分解(c)，而施加的更大的介电电泳力将液滴拉开(d)。比例尺是50μm。
图11，分图A-E，提供(a)根据本发明实施方式的微流体装置的示意图，其中方框区域中的阴影通道指示其它图中的放大区域。如下部位的显微镜图像：(b)来自单层再注射器(reinjector)的不规则分隔的、再注射的液滴，和(c)来自用于分选的实际双层再注射器的规则分隔的液滴。(d)再注射器之前的液滴滤器。(e)连接出口(exit outlet)的平衡通道。比例尺在(a)中是500μm，在(b-e)中是50μm。
图12，分图A-D，提供(a)分选过程中的时间序列，显示PMT检测的荧光信号(蓝色)以及施加至电极的电压(红色)。插图显示相同分选过程中的较长时间序列的傅里叶变换的频率成分，以及先前报告的分选速率的范围。同样来自相同分选的、预分选的液滴(6.4％明亮的)、阳性液滴(99.3％明亮的)，和阴性液滴(0.2％明亮的)的荧光显微镜图像。比例尺是100μm。
发明详述
提供了用于将离散实体递送至基质的方法，所述离散实体包括，例如，细胞、介质和/或包封于其中的试剂。在某些方面中，所述方法包括处理和/或分析离散实体或包封于其中的生物材料的质量。在一些实施方式中，所述方法可用于产生微环境的阵列和/或用于组织或结构的二维和三维打印。还提供了用于实践主题方法的系统和装置。
主题方法和装置可用于相当多的应用，例如增加打印(例如，微液滴打印)和涉及(例如，孔板分析)的测定的精确性和/或效率。可根据本发明进行的测定可与检测癌症或其它疾病，监测疾病进展，分析细胞的DNA或RNA含量，以及其中希望检测和/或定量离散实体的特定组分的多种其它应用相关联。
在进一步描述本发明之前，应理解，本发明不限于所述的具体实施方式，因为它们可能变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方式，不用来构成限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。
提供数值范围时，也应视作具体公开了该范围的上限和下限之间以下限单位十分之一为间隔的各中间数值，除非上下文另有明确说明。本发明还包括设定范围内任何设定数值或中间数值和该设定范围内任何其它设定数值或中间数值之间的各较小范围。所述范围可独立地包含或排除这些较小范围的上限、下限，本发明也包括这些较小范围不包含限值、包含任一或两个限值的各范围，以设定范围内任何限值的明确排除为准。设定范围包含一个或两个限值时，本发明也包括排除所述限值之一个或两个的范围。
除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然也可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但在此描述一些可能的和示例性的方法和材料。本文提及的所有及任何出版物均通过引用纳入本文，与所引用出版物相关联来公开和描述这些方法和/或材料。应理解，出现抵触时，用本发明公开内容代替任何本文所纳出版物的公开内容。
必须注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一个液滴”包括多个这种液滴，提及“所述离散实体”包括一个或多个离散实体等等。
还应注意到，权利要求书可撰写成排除任何要素，例如，任何任选要素。同样，这种说明旨在作为排除性术语，如“只有”、“仅仅”等的使用与权利要求要素的引用相关联，或使用“负”限制的前提基础。
提供本文讨论的出版物仅针对其在本申请提交日之前的公开。此外，所提供的出版日期可能与实际公开日期不同，这可能需要单独确认。如果本文中任何术语的定义或用法与本文中引用的申请文本或参考文献中的术语的定义或用法相冲突，则以本申请中所用的为准。
正如本领域技术人员在阅读本公开后所能显见的，本文描述和说明的每个单独的实施方式具有离散的组成和特征部，这些组成和特征部可方便地分离或与任何其余多个实施方式的特征部结合而不偏离本发明的范围和精神。任意提及的方法可以所提及的事件顺序进行或以逻辑上可行的任意其它序列进行。
方法
如上文汇总，本文公开的主题的方面包括递送离散实体(例如液滴)至一个或多个基质的方法，且在一些实施方式中，使所述离散实体附着至其上的方法。本发明的方面包括打印一个或多个介质或细胞层以及检测施加至基质的组分的一种或多种质量的方法。例如，一些实施方式包括对位于基质上的细胞，例如正常细胞(即，非肿瘤细胞)，或肿瘤细胞进行检测、定量和/或基因分型的方法。
在一些实施方式中，主题方法包括使一个或多个离散实体在载流(例如其中所述离散实体不溶解和/或不混溶的载流)中流动通过微流体装置。所述方法还可包括，通过微流体装置的部分，例如递送孔口，将所述载流和所述离散实体中的一个或多个导向至基质和/或使所述一个或多个离散实体附着至基质。离散实体可附着至基质，例如，通过一种或多种力，例如电力(例如，介电电泳力)、重力和/或磁力。
所用的或联合主题方法、装置和/或系统产生的离散实体可以是球状的，或它们可具有任何其它合适的形状，例如，卵形或椭圆形状。本文所述的离散实体可包括液相和/或固相材料。在一些实施方式中，本发明的离散实体包括凝胶材料。在一些实施方式中，主题离散实体具有如下尺寸(例如，直径)：或约1.0μm-1000μm(含端值)，例如1.0μm-750μm、1.0μm-500μm、1.0μm-100μm、1.0μm-10μm，或1.0μm-5μm(含端值)。在一些实施方式中，本文所述的离散实体具有如下尺寸(例如，直径)：或约1.0μm-5μm、5μm-10μm、10μm-100μm、100μm-500μm、500μm-750μm，或750μm-1000μm(含端值)。此外，在一些实施方式中，本文所述的离散实体具有如下范围的体积：约1fL-1nL(含端值)，例如1fL-100pL、1fL-10pL、1fL-1pL、1fL-100fL，或1fL-10fL(含端值)。在一些实施方式中，本文所述的离散实体具有如下体积：1fL-10fL、10fL-100fL、100fL-1pL、1pL-10pL、10pL-100pL或100pL-1nL(含端值)。此外，本文所述的离散实体可具有一定尺寸和/或形状，从而它们可在微流体装置之中、之上或由其产生，和/或从微流体装置流出或由微流体装置施加。
在一些实施方式中，本文所述的离散实体是液滴。术语“滴(drop)”、“液滴(droplet)”和“微液滴”在本文中可互换使用，指小型、一般是球状结构，包含至少第一流相，例如，水相(例如，水)，囿于与第一流相不混溶的第二流相(例如，油)。在一些实施方式中，本发明的液滴可包含第一流相，例如，油，囿于第二不混溶的流相，例如水相流(例如，水)。在一些实施方式中，第二流相将是不混溶相载流。因此，本发明的液滴可以油包水乳剂或水包油乳剂形式提供。液滴可如本文关于离散实体所述具有一定尺寸和/或一定形状。例如，本发明的液滴的直径范围一般在1μm-1000μm(含端值)。本发明的液滴可用于包封细胞、核酸(例如，DNA)、酶、试剂，和多种其它组分。术语液滴可用于指在微流体装置之中、之上或由其产生的液滴，和/或从微流体装置流出或由微流体装置施加的液滴。
本文中所用的术语“载流”指这样的流体：其经设置或选择以包含一个或多个离散实体(例如，液滴)，如本文所述。载流可包括一种或多种物质且可具有一种或多种性质，例如，粘性，以使其能够流动通过微流体装置或其部分，例如递送孔口。在一些实施方式中，载流包括，例如：油或水，并且可以在液相或气相中。合适的载流于下文详细描述。
图1提供了本发明的一种类型的微流体系统和方法的非限制性的简化示意图。示于图1的具体的实施方式显示了离散实体(液滴通过示例方式说明)向基质的递送。在一个所述方法中，离散实体101(例如，液滴)采用装置(例如，微流体装置100)和载流102制备，以产生包括该离散实体的混合的乳剂。本领域已知多种合适的液滴制造器，其可用于制备混合的乳剂，例如，描述于PCT公开号WO 2014/028378的液滴制造器，所述文献通过引用其全文的方式纳入本文并用于所有目的。在一些实施方式中，离散实体具有多于一种类型，例如，多于一种组成和/或大小，例如第一类型，例如，包含一个或多个感兴趣的细胞的类型，和第二类型，例如，不包含一个或多个感兴趣的细胞的类型。在一些实施方式中，离散实体可包含一个或多个珠，例如磁珠和/或传导性珠。
在所述方法的一些实施方式中，采用微流体装置，其包括经设置以从流体流形成液滴的一个或多个液滴制造器。合适的液滴制造器包括可选择性地活化的液滴制造器，并且所述方法可包括通过所述液滴制造器的选择性活化来形成一个或多个离散实体。所述方法还可包括采用液滴制造器形成离散实体，其中所述离散实体包括在组成上不同的一个或多个实体。
一旦制备，混合的乳剂可被移动，例如，移动和/或流动至微流体装置100的另一部分，例如分选器103。离散实体101的子集可采用分选器103分离。分选器103可经设置以检测和/或分离离散实体，例如，存在于载流中的、具有不同的类型，例如，不同的组成和/或大小，例如第一类型，例如，包含一个或多个感兴趣的细胞的类型，和第二类型，例如，不包含一个或多个感兴趣的细胞的类型的离散实体。如此，分选器103可提供一个或多个分选的离散实体106(例如，包括感兴趣的细胞和/或核酸的一个或多个离散实体)，并且通过第一通道104将它们导向喷嘴(包括递送孔口107)，用于递送至基质108。分选器103还可提供一个或多个分选的离散实体112(例如，不包括感兴趣的细胞和/或核酸的一个或多个离散实体)，并通过第二通道105将它们导向至废液出口。
在一些实施方式中，未被分选用于通过递送孔口递送的离散实体，通过，例如，被再注射进入分选器103上游的载流，被再循环和/或回收。本文公开的方法的不同实施方式包括重复地再循环未被选择用于通过所述分选器的具体通路的递送孔口的递送的离散实体。根据主题实施方式，分选在下文进一步详细描述。并且，在多种实施方式中，在分选之前和/或通过分选器103进行的整个分选过程中和/或通过微流体装置的部分(例如，递送孔口)的一个或多个实体的整个导向过程中，和/或使实体附着至基质的整个过程中，一个或多个离散实体，例如，存在于混合的乳剂中的全部离散实体，保持包含于(例如，包封于)载流(例如，疏水溶液(例如，油)，或亲水溶液(例如，水性溶液))中。
如上所述，在一些实施方式中，分选的感兴趣的离散实体(例如，离散实体106)(例如，包含一个或多个感兴趣的细胞的离散实体)的子集可通过微流体装置100的递送孔口107导向至基质108。在所述方法的一些实施方式中，微流体装置100，或其部分，例如，递送孔口107，接触基质，例如，基质108，或其部分，向其递送离散实体。在其它实施方式中，微流体装置100，或其部分，例如，递送孔口107，通过如下方式递送离散实体至基质，例如，基质108，或其部分：将离散实体在载流，例如，载流102中分配至所述基质的表面附近，例如进入所述基质的表面上的流体(例如，基质流体110)，该流体可与所述载流混溶但不与离散实体混溶。
本文所述的递送孔口，例如，本文所述的微流体喷嘴的递送孔口，将一般具有与待被递送通过其中的液滴的尺寸类似的尺寸。因此，在一些实施方式中，本文所述的递送孔口具有如下直径：约1μm-约1000μm(含端值)，例如，约10μm-约300μm(含端值)。在一些实施方式中，本文所述的递送孔口具有如下直径：约1μm-约10μm、约10μm-约100μm、约100μm-约500μm，或约500μm-约1000μm(含端值)。
喷嘴可被模制作为本文所述的微流体分选器的部分，或可以是与本文所述的微流体分选器匹配的分开的部分。适用于喷嘴的材料可包括，例如，聚合物管道、小孔皮下注射管道，和改性的玻璃毛细管。
主题系统、装置和方法的一个实施方式现参考图2描述，其说明了包括具有分选接合处的微流体装置的微流体系统。如图2所述，采用微流体装置来施加和分选混合的乳剂，以将选择离散实体(例如，液滴)，递送至递送孔口，例如，打印头的递送孔口。微流体装置使用环绕(moat)盐溶液(以产生用于介电电泳偏转的场梯度并限制可能会造成不希望的液滴合并的杂散场(stray field))、隔离油，和电极盐溶液，以促进分选。描述的微流体装置提供接合处，其包括再注射接合处和分选接合处，所述再注射接合处用于提供待分选的包含离散实体的乳剂，所述分选接合处包括用于分选(例如，通过制造离散实体的阳性和阴性分选)的分选器。分选可通过如下方式完成，例如，通过电极施加电场，所述电极例如，液体电极包括，例如，电极盐溶液。
在某些实施方式中，液体电极包括填充有导电液体(例如盐水或缓冲液)并且位于其中需要电场的微流体装置中的位置处的液体电极通道。在具体实施方式中，液体电极采用电源供应器或高压放大器供电。在一些实施方式中，液体电极通道包括入口，从而可将导电液体添加至该液体电极通道。可将所述导电液体添加至所述液体电极通道，例如，通过将填充有该液体的管连接至所述入口并施加压强。在具体实施方式中，液体电极通道还包括出口端口，供于从所述通道释放导电液体。
示于图2的微流体装置还包括通向一个或多个打印头和通向废液容器或通道的多个出口。
如上所述，一些实施方式，例如结合图1描述的那些，包括使一个或多个离散实体101附着至基质108。基质108包括表面，例如，表面109，在其上可提供或沉积流体层，例如，基质流体110，例如，油。合适的基质流体可包括，例如，其中离散实体不溶解和/或不混溶的一种或多种液体，例如水和/或油，这取决于离散实体的性质。基质流体可以是与载流相同类型的流体，例如，与载流具有相同组成的流体，例如，包括水和/或油的流体，或可以是与载流不同类型的流体，例如，包括水和/或油的流体。
在一些实施方式中，本文公开的方法可包括：通过改变离散实体的浮力和/或对所述离散实体的一种或多种组分(例如，珠)施加一种或多种力，使一个或多个离散实体移动通过装置和/或使一个或多个离散实体附着至基质和/或从所述基质移去所述离散实体。所述方法的一些实施方式还包括：例如通过调节，例如通过移去使所述实体附着至所述基质一种或多种力进行调节，从基质释放一个或多个离散实体，例如，附着的离散实体。在一些情况中，通过移去使离散实体附着至基质的电场来从基质移去所述离散实体。
为了便于上述处理，在一些实施方式中，本发明提供基质，其包括单独可控的电极的阵列。所述基质可经设置使该阵列中的单个电极可被选择性地活化与去活化，例如，通过对于所选电极施加或移去电压或电流。由此，通过由电极施加的力附着的特定离散实体可被选择性地从基质表面释放，而未被选择的离散实体通过所述力的施加保持附着。所述阵列的电极可嵌入基质材料(例如，合适的聚合物材料)，例如，处于离散实体借助所述力的施加附着的基质的表面之下。本领域已知多种合适的传导性材料，其可与本文公开的电极阵列联用，包括不同金属。本文先前描述的液体电极也可用于本申请。
现描述用于使离散实体附着至基质的方法和装置。通过施加力(例如，介电电泳力)使微流体装置中产生的离散实体(例如，液滴601)附着至基质602的一个实施方式示于图6，分图A-C。图6，分图A，显示从微流体装置的微流体喷嘴603的递送孔口射出并在附加至基质602之前的液滴601。嵌入的电极特征部604是图案化的且处于基质602的表面之下。图6，分图B，显示在隔离电极特征部604的间隙处捕获的液滴。分图C说明由施加介电电泳力所致的捕获的液滴的拉伸。例如，基质602相对于喷嘴603的定位通过计算机控制的机械平台来实现。或者或此外，喷嘴603可作为打印头(例如，计算机控制的打印头)的部分提供，其可相对于基质602移动。
主题方法还包括将试剂添加至离散实体的方法，所述离散实体例如液滴，例如，附着至基质的液滴。所述方法可包括使第一离散实体在第一载流中递送和/或附着至基质或其部分(例如，基质表面)。所述方法还可包括将一个或多个其它离散实体，例如，第二液滴，例如离散实体，在第二载流中和/或包括一种或多种试剂，递送至基质上的位置，该位置是与第一离散实体相同的位置或邻近或靠近第一离散实体的位置。随后可聚结第一和后续施加的离散实体，从而合并第一和后续离散实体的内容物，包括，例如，一种或多种试剂。在一些实施方式中，聚结是自发的，且在其它实施方式中，聚结离散实体包括施加力，例如电动力，至所述离散实体中的一个或多个。例如，施加电场至紧邻的两个或更多个液滴可诱导油-水界面处的动力不稳定性，这导致液滴合并以降低油-水系统的表面能。第一和第二载流，如上所述，可以是相同类型的流体或不同类型的流体。
本发明的一些实施方式还包括添加一种或多种试剂和/或组分(例如一个或多个珠)至一个或多个离散实体(例如，液滴)的方法，所述方法通过如下方式进行：通过装置的第一孔口，将一个或多个离散实体在第一载流中递送至基质的表面。所述方法还可包括：将所述离散实体中的一个或多个在第二载流(例如，与第一载流具有相同或不同的类型的载流)中定位在基质表面上和/或通过力使所述离散实体附着至所述基质。根据主题方法，可随后将装置的孔口，例如操作性地连接(例如，流体连接)至试剂来源的孔口插入附着的离散实体中的一个或多个。插入后，所述孔口可用于将一种或多种试剂注射进入一个或多个离散实体。
所述方法的一些实施方式可包括：调节离散实体的环境，并由此调节所述离散实体的内容物，例如，通过添加和/或移去液滴的内容物。所述调节可包括调节一个或多个离散实体的环境的温度、pH、压强、化学组成，和/或辐射水平。所述调节还可具有一个或多个离散实体的直接环境，例如其中提供所述离散实体的乳剂和/或微流体装置中的一个或多个空间，例如导管、通道，或容器。可经调节的离散实体的直接环境还可包括其中提供所述离散实体的流体体积，例如流体流。还可将一个或多个离散实体储存于经调节的环境。
本发明的方法还可包括回收已附着至基质的一个或多个离散实体的全部或部分。例如，可例如通过提取从液滴回收一种或多种材料，例如一种或多种溶剂和/或试剂。所述回收可通过使一个或多个附着的离散实体与装置的部分接触来进行，所述装置的部分例如连接至抽吸装置的微流体孔口，所述抽吸装置用于从一个或多个附着的离散实体吸取一种或多种材料，例如一种或多种溶剂和/或试剂。可将微流体孔口插入离散实体和/或置于离散实体附近，例如，置于距离离散实体一定距离处，所述距离具有离散实体的数量级或更小，用于从所述实体进行回收。所述从离散实体回收的方法的一些实施方式还可包括，例如，通过增加一个或多个离散实体的浮力，从基质表面剪切，例如，剥离，离散实体。离散实体的浮力可通过增加离散实体的体积来增加，例如，通过将水性流体或非水性流体注入所述离散实体。
在一些实施方式中，所述方法可包括，在离散实体内的位置处浓集存在于离散实体中的一种或多种组分，例如，珠。随后可选择性地移去，例如，通过从所述离散实体抽吸来移去所述浓集的组分或者离散实体的不含所述组分的部分。从离散实体移去的一种或多种组分随后可通过(例如)递送孔口传送进入一个或多个分离的容器。
在不同的方面中，与本文公开的方法联用的基质包括填充有一种或多种传导性(例如，导电性)液体或固体材料(例如，电极材料)的一个或多个通道。在一些实施方式中，所述基质还可包括位于所述通道和所述载流之间的绝缘片层。在一些实施方式中，一个或多个通道经设置，例如，经图案化，以在向所述一个或多个通道施加电压后产生基质部分(例如绝缘片层)上方的电场。在一些实施方式中，所述电压和所产生的电场或其方面，例如，介电电泳力，足以使一个或多个离散实体附着至所述基质。在一些实施方式中，基质，或其部分，包括具有净电荷的一个或多个电极，所述净电荷相对于附着至所述基质的一个或多个离散实体(例如，液滴)的极性而言具有相反极性，例如，阴性或阳性。
如图1所示，在一些实施方式中，基质的表面包括一个或多个电极111。在多种实施方式中，一个或多个电极预形成于基质或其部分(例如，基质表面)上。在多种实施方式中，基质可固定在平台上和/或邻近(例如，接触)平台，所述平台例如可移动的平台，例如可以X-Y和/或Z方向移动的平台。在一些实施方式中，平台是可以朝向和/或离开微流体装置或其部分(例如，递送孔口107)的方向移动。并且，在一些实施方式中，微流体装置或其部分(例如，递送孔口107)可以朝向和/或或离开装置的另一部分(例如，平台)和/或基质的方向移动。平台和/或微流体装置或其部分(例如，递送孔口)可以恒定的移动量或增量移动，所述增量为一个或多个离散实体的直径或半径的级别，例如，5个或更少，10个或更少，50个或更少，或100个或更少离散实体。平台和/或微流体装置或其部分，可以一个或多个方向，例如，X和/或Y和/或Z方向，以具有一定距离的一个或多个增量移动，所述距离例如，1μm-1000μm(含端值)，例如1.0μm-750μm、10μm-500μm、1μm-50μm，或1μm-10μm(含端值)。在一些实施方式中，所述装置可以以恒定的移动量或一个或多个增量移动，所述增量是对应于基质上可附着离散实体的位置的级别，例如孔板(包括本文所述的任何孔板)上的孔。
在一些实施方式中，所述方法包括，通过润湿，例如，电润湿，使一个或多个离散实体101附着至基质108，或其部分，例如，表面109。在一些实施方式中，润湿包括移动，例如，使一个或多个离散实体106从递送孔口107，通过基质流体110，流动至基质的基质表面109。在一些实施方式中，基质的可润湿性足以例如通过润湿力使一个或多个离散实体连接至所述基质。在一些实施方式中，所述方法包括改变，例如，增加或减少，基质的可润湿性，从而足以通过润湿力使离散实体附着至所述基质。所述方法的不同方面还可包括：施加外源电磁辐射，所述电磁辐射的量足以使离散实体附着至基质上的特定位置。
在一些实施方式中，主题方法包括使一个或多个通道(例如，基质的通道或其方面)图案化，以提供网格图案(grid pattern)中的多个带电的电极特征部。所述排布示于，例如，图4，其描述基质401，包括电极特征部402和403。还显示包括递送孔口406的喷嘴。采用介电电泳使液滴附着至网格图案，其允许向悬浮于非传导性介质中的不带电的传导性液滴施加力。例如，在一个实施方式中，未附着的液滴408受到净力朝向具有最高电场梯度的所述基质的表面上的区域，带有相反电荷的特征部402和403之间的间隙405。一旦液滴到达基质表面，使所述液滴稳定的表面活性剂层被破坏，从而液滴润湿区域405。因为几何形状突然变化，最高电场梯度在带电的特征部402和403之间的边界处和间隙405处出现。润湿区域405的液滴受到朝向402和403的横向力，这造成液滴的展平和伸长，其与施加的电场成比例。带电的特征部402和403，不必需具有恒定和相反极性。例如，405中的高电场梯度可通过采用高电压AC信号(1.5kV，30kHZ)使特征部402带电同时使特征部403接地来产生。只要特征部403是合适的导体，未接地的特征部403将因对402施加的AC信号而经历电荷重组，并将提供与使该特征部接地相类似的功能。该效应称为电磁屏蔽。示于图4的图案化的基质可采用标准微流体技术制造。例如，模制的PDMS装置可以微流体通道面朝上放置且结合至薄聚合物薄膜。穿孔后，该通道可填充有盐水溶液并附连至电源供应器，其中一个通道网络成为特征部402，而其它通道网络成为特征部403。
如图1中说明，使一个或多个离散实体，例如，离散实体101，附着至基质，例如，基质108，或其部分，例如，表面109，可包括通过力，例如重力、电和/或磁力，使离散实体连接至所述基质，例如，基质108。如此，在一些实施方式中，递送孔口，例如，递送孔口107，位于基质108上方。在一些实施方式中，所述方法包括对位于基质(例如，基质108)内或上的电极(例如，电极111)施加电电压和/或电流。使一个或多个离散实体，例如，离散实体101，附着至基质，例如，基质108，或其部分，还可包括通过界面张力使所述实体附着至所述基质。
附着的方法还示于图5，其中，通过微流体装置的孔口，例如，递送孔口503，将离散实体502递送至图案化的基质501。图5还说明基质501上的空缺的位置504，例如，可通过力，例如介电电泳力，使离散实体在此处附着至所述基质。
本文公开的方法的实施方式，例如本文中参考图1公开的方法，还可包括储存一个或多个离散实体，例如，一个或多个离散实体106的一个或多个步骤，所述离散实体附着至基质，例如，基质108，或其部分，例如，表面109。储存所述离散实体的方法可包括，将一个或多个附着的实体在受控的环境条件下，例如，在固定的温度和/或压强下，保持一段储存期。在一些实施方式中，施加和/或保持一种或多种力以使一个或多个附着的实体在整个储存期中保持在附着状态。
在所述方法的一些实施方式中，一个或多个微流体装置整合有自动化的系统，其选择性地使微流体装置的一个或多个部分，例如，一个或多个递送孔口，相对于基质或其部分(例如，基质表面)定位。因此，在一些实施方式中，所述方法包括，采用自动化的系统，将一个或多个递送孔口相对于基质或基质的部分选择性地定位，例如，定位在具体的位置处，以选择性地将一个或多个离散实体递送至所述基质上或附近的一个或多个位置或其部分(例如，基质表面)。公开的自动化的系统可包括，一个或多个控制单元，例如，包括中央处理单元的控制单元，以控制施加离散实体至基质的一个或多个方面，例如一个或多个递送孔口的物理定位和/或离散实体分配的时机。自动化的系统可经设置以使一个或多个递送孔口相对于固定的基质定位(例如，独立地定位)，或使基质相对于一个或多个固定的递送孔口定位。主题方法的方面可包括将多个离散实体的第一成员递送至基质或其部分(例如，基质表面)上或附近的第一位置，将所述多个离散实体的第二成员递送至所述基质上或附近的第一位置或第二位置。
主题方法还可包括，调节，例如，改变，一种或多种力的一个或多个方面，例如，通过调节一个或多个载体溶液中的离散实体的电场和/或浮力，由此将一个或多个离散实体(例如，液滴)，从基质上的第一附着位置移动至另一个位置。所述方法还可包括施加一个或多个其它力，例如，第二力，该力足以将一个或多个离散实体从第一附着位置移动至基质上的第二位置和/或使一个或多个离散实体附着在第二位置处。所述方法的方面还可包括，施加流体的横向流(cross flow)和/或外源电磁辐射，其足以使离散实体从第一位置，例如，基质上的第一附着位置，移动至基质上的第二位置。
主题方法的实施方式还可包括，进行一个或多个测定，例如，一个或多个生物学测定，例如本文所述的，在递送离散实体至基质或其部分(例如，基质表面)之前和/或之后，在所述离散实体中的一个或多个之上和/或之内进行的任何测定。在一些实施方式中，所述基质可包括孔板或其部分。在本文中广泛使用的术语“孔板”指具有一个或多个孔，例如，其中的断痕(divot)或隔室的板，例如微量滴定板。然而，本文中所用的术语“孔板”还可指离散实体(例如，液滴)的图案化的阵列，如本文所述，其中离散实体附着至基质表面。在此类实施方式中，基质表面可包括传统的孔，例如断痕或隔室，但也可以是平表面。
标准测定采用具有例如384孔规格的孔板，例如示于图7，分图A的孔板。然而，可制备和/或用于主题方法和装置的孔板，例如，包括离散实体的有序阵列的孔板，可包括具有，例如，20,000-500,000(含端值)个孔，例如50,000-150,000(含端值)，例如80,000-120,000(含端值)，例如100,000个孔的孔板。所述孔板，其可具有与图7分图A的相同尺寸足迹(footprint)，例如，通过图7分图B说明(例如，128mm x 85mm足迹)。在所述孔板中，各孔可具有如下范围的面积，例如，0.01mm2-1mm2(含端值)，例如0.05mm2-0.5mm2，例如约0.10mm2。此外，图7的分图C说明示于图7的分图B的孔板的部分的放大的顶视图和侧视图。图7的分图C具体说明了其上附着有水性液滴的基质上的油层。
此外，图7的分图D提供的图显示主题方法，例如采用Picodrop打印，如何能够采用标准孔板足迹增加阵列密度。因此，本文所述的方法允许标准孔板足迹中的显著增加的阵列密度，允许显著增加测定和/或实验的数量的性能。例如，所述方法允许以显著高于按标准方法在设定量的时间内和/或采用设定量的空间所能实现的性能，对多个样品进行测定。
本文公开的方法的方面还可包括，在递送一个或多个实体至基质或其部分(例如，基质表面)之前和/或之后，控制(例如，保持)一个或多个离散实体的温度。例如，在一些实施方式中，一个或多个离散实体在递送至基质或其部分(例如，基质表面)之前和/或之后经热循环。
主题方法还可包括，通过采用装置，例如在图1中一般描述的装置，打印结构，例如，三维结构。在一些实施方式中，所述方法包括将第一层和/或第二层和/或一个或多个其它层，例如，3-1000层(含端值)，例如10-500或50-100层的离散实体(例如，液滴)导向至基质或其部分(例如，基质表面)。在一些情况中，基质，或其部分(例如，基质表面)，在其上包括水性流体层，其可与载流混溶但不与离散实体中的流体混溶，并且其中，所述液滴在它们被引入水性流体层之后附着至基质的表面，例如，基质表面。在多种实施方式中，离散实体包括一种或多种固体和/或凝胶材料，例如一种或多种聚合物。本文公开的方法的方面还可包括，起始和/或维持反应，例如，光聚合反应，这造成离散实体和/或离散实体的载流固化，例如，在所述离散实体被施加的基质上固化。
示例性实施方式
本发明的示例性、非限制性实施方式提供如下。尽管这些是关于液滴、液滴“打印”和相关的装置和系统进行描述，但应理解，所述实施方式也可等同地应用于非液滴离散实体的打印。
在本发明的一个实施方式中，采用微流体打印头，将包括具有不同组成的液滴的乳剂“打印”至基质，例如，如本文所述。液滴采用微流体或非微流体技术，例如分别采用流动聚焦或膜乳化，提前制备。预形成的液滴随后被引入打印头并按需根据它们的荧光进行分选。液滴溶液用不同的溶液染色，然后包封成液滴，从而，当被注入打印头时，可采用检测技术例如流动液滴学(flow dropometry)来鉴定各液滴的类型，并且计算机可利用该信息来确定分选哪些液滴。
这允许精确分配溶液至基质。一旦由打印头分配，液滴便利用力(例如，由基质表面下制造的电极产生的介电电泳力)附着至所述基质。基质上方的油层允许液滴始终保留在载流中，也即是说，液滴在生成后处于载流中，通过载流流动贯穿打印头，随后分配进入载体-流体被覆的基质。这使液滴始终保持包封，并且保护免于蒸发。除了介电电泳以外，也可施加其它力来附着液滴。例如，可施加电动力，其中所述基质可带有与液滴相反的电荷，从而产生电吸引。可在液滴通过微流体打印头时利用包含与液滴接触的带电的流体(例如，本文所述的盐水电极)的通道来使液滴带电。可采用的其它力是，例如，重力，其中所述液滴的密度大于载流的密度，这使它们沉入在基质上图案化的孔，或者，如果密度小于载流的话，浮入颠倒的孔。可以类似方式利用磁力。也可利用润湿和化学力，从而液滴在接触基质之后润湿表面并借助表面张力粘附至其上。
除了合适设计的包括标记有可区分各类型的检测组分的不同类型的液滴的“乳剂油墨”以外，在控制的时间将特定液滴导向至基质的“按需分选”微流体装置，以及经构建以将液滴保持在特定位置的基质，在采用按需分选装置在分配喷嘴下使基质定位自动化的系统协助提供高速靶向的液滴分配。这可采用(例如)电控显微镜平台以定位喷嘴下的基质，以及计算机以检测并按需分选与基质配准(in registry with)的液滴，来实现。
本质上，液滴分配器是高度微型化且极高通量液体处理机器人，因此，其对于进行多种应用，特别是生物学测定，是有价值的。例如，包含试剂、细胞和其它组分的液滴可被分配至基质，经历改变的环境条件，例如供于孵育加热，并随时间推移进行监测以检测反应活性。由监测系统产生的结果可与分配平台整合在一起，例如，以通过基于反应进程添加其它试剂来改变特定液滴中的条件。
在本发明的一些实施方式中，所述系统可用于“打印”细胞和组织。在此类实施方式中，细胞或组织构建模块首先被包封进液滴，所述液滴标记有检测组分以及必要的生物试剂，例如基质胶或胶原。所得乳剂油墨(其可包含不同类型的细胞、细胞聚集体，或不含细胞的生物试剂)随后可通过打印头按需分选并分配至所述基质，它们借助力附着在那里。为了将细胞定位在阵列上，阱可以其间具有间隔的方式定位。为了打印组织，细胞优选沉积得充分接近，从而允许邻近的液滴聚结，以及其中所含的细胞彼此相互作用。这可用于，例如，打印“红色”细胞，接着是“绿色”细胞，接着是“蓝色”细胞。这些步骤可重复以使细胞在所需图案中排成一行。其它行随后可邻近第一行打印以打印细胞平层(flatlayer)。其它层随后可被打印在第一层上方，以产生3D多层“组织”。正确选择或工程改造细胞时，一旦组织被打印，细胞即可彼此相互作用以进一步修饰结构。可添加其它液滴以调节结构发展，例如生物试剂或药物。
在类似的实施方式中，可将确定类型的细胞聚集体定位在阵列上的分离液滴中。例如，阵列上的第一位置可分配有细胞的特定组合，例如红色，随后绿色，随后蓝色细胞。这些细胞将通过液滴添加而被分配进入相同液滴，其中它们随后能够相互作用以发挥功能。这可在阵列上的其它点重复，以构建多重相同聚集体或不同的、确定的聚集体。这可用于，例如，构建由数万个细胞组成的基础组织结构，或用于研究不同的细胞类型之间的相互作用，例如细菌和哺乳动物细胞，或微生物与感染病毒。还可向液滴添加药物和其它化学和生物化合物，例如，以研究如何调节生物体之间的相互作用。
在一些实施方式中，所述系统可用于分析细胞。在一些所述实施方式中，细胞在阵列上的液滴中分离，并且按需添加其它材料。所述材料可刺激细胞生长，表达确定的途径相关的蛋白质，或纳入可感染所述细胞的微生物或病毒。采用检测技术，例如光学检测、荧光，拉曼(Raman)显微镜检，或保护液滴及其中的细胞的其它光谱技术，能够随时间推移监测液滴。例如，这可用于检测目标途径的特定反应变化或时间依赖性表达。采用其它技术，包括破坏性的技术，如质谱、PCR或测序，采用或不采用分子条形码，能够检测分子信息。
在一些实施方式中，可在阵列化的液滴中进行无细胞实验。例如，可将无细胞提取物例如转录和翻译机器，与其它组分一起，包封在液滴中，所述其它组分包括细胞(必要时)。这些随后可在阵列上孵育并随时间推移进行监测，如上所述，以追踪反应进程。这可用于，例如，在无细胞提取物中筛选途径的活性，和，用于研究途径活性如何通过改变条件，例如施加热或存在不同的诱导剂、抑制剂等，来调节。
合成生物筛选：本文所述的方法可用于进行合成生物应用的筛选，例如，筛选经工程改造以表达产生分子的生物途径的细胞或无细胞提取物。通过分离阵列上液滴中的途径，并利用方法如显微镜检、光谱或质谱来追踪分子的生成，能够测试不同的途径序列的所需活性。
质谱活化的分选：在另一个实施方式中，所述系统可用于利用质谱读出来分选液滴或细胞。例如，可将包含不同的材料或细胞的液滴分配至阵列。随后可取各液滴的部分作为样品并引入质谱，以分析其内容物。基于所获信息，可回收全部或部分的液滴用于其它应用。
采用材料的3D打印：在本文公开的方法的另一个实施方式中，包含固体、液体，或可固化的材料的离散材料可被打印至基质，以产生平面或“3D”结构。例如，固体粒子可采用多种工艺产生，例如乳剂聚合或基于液滴的模板法，其中所述材料被乳化成液滴，而液体随后被固化以将液体液滴转化成类似尺寸的固体粒子。包含这些固体粒子的“油墨”可通过如下方式产生：将不同类型的多重粒子与可通过光学方式确定的不同的标记物混合在一起。随后，可将基于粒子的油墨引入打印头并按需分选至基质，由此将固体粒子以所需图案沉积至基质。捕获力如静电或磁力还可用于将粒子定位于确定位置处。可沉积第一层粒子，之后，可添加其它层，以产生3D结构，其中各粒子在该结构中的组成是精确确定的。一旦被沉积，可采用多种方法来将粒子键合至一起例如，例如，采用化学键合技术或烧结粒子。在稍有不同的实施方式中，前述的“3D打印机”可打印液体液滴，其可在分配之后被固化，例如，通过化学交联、聚合或凝胶化。被打印的材料可包含亲水的或疏水的液体、金属，和塑料，其中按需选择载流和力以允许获得按需控制的分选，并将材料分配至所述基质。
按需分选：在微流体和其它应用中，通常希望按需产生具有确定的类型的液滴。出于该目的，一种方法是采用由膜阀控制的微流体液滴生成器。当阀关闭时，分散的相不流动且无液滴产生。当其打开时，其流动且产生液滴。该方法可以像该阀打开和关闭那样快地按需产生液滴，其通常不快于100Hz。此外，液滴全部由相同流体形成；以允许按需从多重流体、多重装置生成液滴，其各自与其自身的流体，可接合在一起；这对于多于多于少数(handful of)流体的情况而言是存在挑战的。所述挑战可通过本发明的实施方式来克服，其中液滴通过按需从先前存在的乳剂分选它们来按需产生。不同的所需流体的液滴首先分开乳化，然后合并成单一的混合乳剂。它们带标记，以允许它们通过光学检测(例如流式细胞术)彼此区分。该合并的乳剂随后被注入微流体分选器，其扫描液滴并将它们进一步分选进入两个通道，分配通道和废液通道。从分配通道的角度来看，该系统包括按需喷墨技术(droplet on demand technique)，因为，通过将液滴进一步转移按需分配通道，液滴按需从所述通道射出。被送入废液的乳液可通过分选器回收再利用，以节约试剂。该按需喷墨技术的价值在于，其速度受限于液滴可被分选的速率。采用在分选出口之间纳入有间隙的分隔物的新的分选几何构造(如下文更详细地描述)，能够以>30kHz分选液滴，这比现有按需喷墨技术所能实现的快大于两个数量级。此外，合并的乳液可包含许多不同类型的液滴，不仅仅是数十种液滴但也可以是数百或数千种液滴。这将会产生液滴序列的空前复杂性，这联合所述打印技术对于允许控制分配和将不同的试剂合并于各基质位置而言是重要的。
按需分选装置提供控制，其促进分配确定的也低序列，但捕获基质允许在多个特定位置处捕捉那些液滴，从而可在其上进行一个或多个感兴趣的测定。有多种基质可经构建以用于捕获液滴。一种所述基质采用介电电泳以捕获/圈留(trap)液滴。为了产生介电电泳阱(dielectrophoretic trap)，可制造基质以包含电极，以产生必需的电场。这可通过使介电质片层下的电极图案化来实现；所述电极可被供以阳性和阴性电荷，以产生具有空间梯度的大电场；当液滴在基质上方以及所述场区域中分配时，介电电泳力将使它们被吸引至基质，并附着。电极可采用常规制造技术被图案化，例如金属溅射或片层上沉积，或通过制造可面朝上(face-side-up)键合至片层底侧的微流体通道，从而所述通道在片层下方，并且与片层上方的流体不流体连通。随后，所述通道可被填充有传导性介质，例如焊接物(solder)或电解质溶液，从而带电以产生用于捕获介电电泳液滴的所需电场。通过调节微流体通道的形状、宽度和高度，可使电极结构，由此控制施加至片层上方的液滴的场。
使液滴附着：在一些实施方式中，希望通过施加力使液体或固体实体附着至所述基质的表面。所述力中可用的一种是介电电泳，其中利用介电质基质之下的电极的图案化阵列来产生电场，其通过介电电泳的形式吸引或排斥实体，在所需位置处捕获它们。
还可利用非介电电泳电动力。在此类实施方式中，实体可在它们流动通过打印头之前、过程中或之后带有，例如，正电荷。随后可使基质带有相反电荷，在实体和基质之间产生使它们互相粘附的电吸引。还可调节实体和基质的极性，以产生排斥力，这允许，例如，从基质射出液滴。电极可用于这些目的。例如，基质可均匀带电以具有一个极性，从而，相反极性的液滴将粘至所述基质。提供的介电质使电极与液滴分离，这两者之间将无电荷流动，并且将保留所述力；或者，如果允许这两者发生电接触，则随后电荷将流动，移去该力，但允许(例如)液滴润湿电极并通过界面张力附着。
在另一个实施方式中，电极可以是图案化的，从而各阱具有有相同或不同的极性和电荷的单一或多重电极。例如，这可用以产生适于粘附单一液滴的介电电泳阱。各电极可以是可寻址的，并且可将阱的大阵列制造进入基质，允许各液滴按需开启或关闭。例如，这可用于，调节相对于附近的其它阱而言液滴待附着之处的阱的场强度，将液滴捕捉至特定阱。阱还可被关闭，以选择性地释放液滴。
不同的附着力也是可能的，例如可润湿性和界面张力。在此类实施方式中，基质可以是图案化的，具有在亲水和疏水之间交替的区域。例如，基质可以是天然疏水的，但被足够大以容纳具有亲水可润湿性的一个或多个液滴的小岛图案化。可润湿性图案化可采用如下方式完成，例如空间经调节的基于光的聚合物接枝或聚电解质层的流动图案化。一旦液滴与亲水的贴片(patch)接触，它们可自发地润湿或它们可被诱导以润湿，例如如果存在表面活性剂，通过施加小的、瞬时的或长久的电场。一旦润湿至所述基质，液滴可保持一些时间段。
利用界面张力的捕获液滴的方法可采用图案化的特征部来完成。例如，可在基质中造孔，并调节其尺寸和/或形状，从而液滴在其中嵌合，并且因与载流的浮力或密度差异而定位在孔中。液滴还可分配在具有狭窄开口的凹陷特征部中或分配在具有狭窄间隙的桩之间。因它们的界面张力和优先保留球状的特性，所述液滴可在原位保持。
其它种类的电磁阱可采用(例如)激光镊产生。采用导向在基质上的控制的位置处的激光器的阵列，分配在激光器附近的液滴可受到将它们从所述激光器吸引或排斥至所述激光器的力，在此产生可用于定位所述液滴的一系列的阱。磁性液滴或粒子可利用采用磁力或电磁力来附着，例如，利用铁磁流体、永久磁铁、顺磁性、或通过使电流流过基质下的图案化的电极而产生的电磁性。
液滴位置的调节：一旦液滴被分配至所述基质，可以改变液滴在基质上的位置。这可通过如下方式完成，例如通过磁性方式，通过调节磁性场，通过电的方式或通过介电电泳的方式，通过调节电场，通过介电质上的电润湿，或通过用激光器改变光学阱的位置，以及等等类似的力。也可使环绕在液滴周围的载流(例如，油)流动，从而向附着至基质的液滴施加剪切，造成它们在一些情况中以流动方向移动。如果液滴密度与载流不同，还可通过改变基质在重力场中的取向，利用浮力来移动液滴。
添加试剂至液滴：在一些实施方式中，可能希望分配多重液滴或离散实体至基质阵列上的单一位置。这对于，例如，添加不同的试剂至在不同且确定的时间定位的液滴而言是有价值的。这可通过如下方式完成，例如分配第一液滴至阵列，随后分配第二液滴至与第一液滴相同的位置。在某些实施方式中，例如当采用电场来捕获液滴时，通过基质产生的电场足以诱导液滴合并，由此合并它们的内容物。液滴的内容物可通过液滴中的扩散或对流(convective flow)来混合，所述对流通过如下方式产生，例如，载流在液滴表面上方的对流或阱移动时液滴的移动。在其它示例中，液滴将自发地合并，例如当不采用表面活性剂时。在其它示例中，可通过通过利用激光或定位的加热来诱导合并。可将其它液滴添加至相同位置以添加一个、两个、三个或更多个液滴至相同位置。采用液滴或分选按需技术，可精确地控制添加的液滴以及它们添加的顺序。在另一个实施方式中，可将喷嘴或毛细管引入附着的液滴以注射所需试剂。
回收液滴或从其中回收材料：在某些应用中，希望回收全部或部分的附着的液滴。这可通过如下方式完成，例如，通过将喷嘴带至附着的液滴附近，然后将流体吸引进入喷嘴，由此吸引液滴进入喷嘴。或者，喷嘴可用于产生载流的局部流，其可用于通过克服附着力来从表面驱散液滴。如果喷嘴形状设计得合适，并且流体流适当，还能够以与基于微毛细管的液滴生成法类似的机理回收液滴的部分。或者或此外，通过添加其它液体至液滴以增加它们的浮力，可从基质移去液滴；一旦浮力大于附着力，液滴将从基质脱离并漂走。如果液滴比载体重，可通过颠倒基质来获得类似的结果。在其中所述阱可选择性地开启或关闭的实施方式中，液滴还可通过如下方式回收：断开力，并利用浮力或流动以将它们从基质上移开并将它们回收进入收集容器。
液滴中材料的浓集：在一些实施方式中，希望浓集液滴中的试剂或其它材料。这可采用可用于浓集试剂的技术来完成，例如，将珠置于液滴中，其可将液滴中的某些组分结合，随后移去珠或移去液滴的不包含所述珠的部分以实现浓度的增大。
液滴的二级处理：采用本文所述的任何方法回收的液滴的部分或全部随后可通过使它们从阵列流动进入二级容器而被分配进入所述容器。例如，利用截面法(sectionmethod)，个体液滴或液滴部分可从液滴阵列回收，并且这些部分通过管流动进入孔板上的孔，它们在那里被分配。这可通过一次一个液滴地完成，各液滴被分配进入分开的孔，并由此保留液滴彼此的分离。一旦处于孔中，可对液滴进行其它处理，例如繁衍包含在其中的细胞或进行生物反应，例如ELISA，PCR等。还可对回收的实体进行采用技术如显微镜检、光谱法，和质谱法的分子分析。
处理附着的液滴：附着的液滴可采用多种技术被处理以调节它们的环境。例如，在一些实施方式中，可调节液滴的化学、温度或压强环境以例如，通过热循环液滴来进行PCR。还可重置载流来调节液滴的化学性质并且将材料运输进出液滴。例如，具有表面活性剂的载体相可经历微胞运输，这允许化合物被运输进或出液滴而不将液滴合并在一起。例如，这可用于，采用对油具有亲和性的染料(例如尼罗红)，通过用尼罗红使载体饱和并使其流过液滴一段时间，对化合物染色(例如，基于油的化合物)。在一些实施方式中，一旦液滴附着，表面活性剂可不再必需，因为液滴不需要接触；阱可按需隔开以实现该目的。在该情况中，可通过用不含表面活性剂的油代替所述油来减少微胞运输。这对于增强其它情况下会因微胞运输而漏出的化合物在液滴中的包含而言可具有价值。类似地，液滴可采用对于该步骤最优化的载体相来分散，随后，该载体用具有其它的希望的性质的不同的载体替代，所述性质例如，增强或减小试剂进出液滴的分配(partitioning)的能力。这些种类的环境处理可用于制备用于，例如在低温下，长期储存的液滴，以保存它们内部的试剂。
或者或此外，基质可经制造以具有半透膜，其允许来自基质下(或基质上，这取决于基质相对于液滴的取向)的液滴的化学连通。通过调节膜之下的流体，可采用化学分区来调节液滴的内容物同时仍保留液滴完整。例如，这可用于通过如下方式来改变液滴的缓冲性质，用第一缓冲液(例如，包含离子)分配液滴，随后利用膜，使液滴与具有不同的离子的另一缓冲液化学连通，这允许液滴中的离子被来自新缓冲液溶液中的那些替代。通过控制膜的透过性，经调节的化合物类型可以是受控的，基于，例如，它们的尺寸、疏水性、电荷或化学性质。
分析附着的液滴：在本发明的一些应用中，希望分析附着的液滴的内容物。例如，该对于监测可检测的标志物的变化而言是有价值的，所述可检测的标志物例如，来自(例如)PCR扩增的荧光信号或用于ELISA的酶基质的荧光产物。在这些情况中，可以与采用读板仪分析孔板体积类似的方式分析液滴。它们可随时间推移被监测，以收集这些信号如何随时间推移而变化的信息。这可用于，例如，随时间变化产生产物峰浓度的筛选途径，其中所述峰高度和宽度对于该途径的最优化而言均是重要的参数，或对液滴中的核酸或细胞进行定量PCR。
可采用多种测量形式，例如明视场、荧光，和吸光度技术。还可应用光谱技术，例如拉曼光谱、NMR和质谱。还可采用分离技术，例如毛细管电泳，通过与通过(例如)喷嘴或毛细管的液滴接触来进行。通过回收全部或部分的液滴，所述材料还可经历破坏性或非破坏性技术，例如质谱法和化学分析。重要地，因为材料回收过程中的喷嘴位置是已知的，从这些和其它测定法回收的信号和信息可被回溯至阵列上的特定液滴，这允许时间分辨的信息与有力的分子分析技术合并，例如对液滴部分中的材料进行测序。
平行的打印头：单一打印头在其能够将液滴分配至所述基质的速率方面受限。用于更快地分配液滴的一种技术是平行化的打印头。在该方法中，多重喷嘴可附连至单一液滴按需装置和/或分选器按需装置，从而，当液滴被触发时，其被分解成多个部分，各部分被分配至所述基质的不同的、确定的位置。这还可用于分配已知源自相同母液滴的多组液滴，并且因此以某些方式相关。归因于所述打印头的模块化性质，还可以将多个打印头一起组装成单一装置。例如，用于检测所述液滴的光纤光学器件的应用允许将检测光学器件定位至装置中的小区域，而分选或液滴按需装置本身的总尺寸不仅是数百微米。这允许多重装置在单一芯片上组装，从而将液滴分配出单一合并式喷嘴，或多重出口喷嘴。理论上，这应允许以借由与打印头上组装的装置的数量相等的因素而增加的速率进行打印。
采用独特标识物对液滴加标签：在某些应用中，用独特标识物对打印的液滴的内容物加标签是有价值的。这允许多重液滴的内容物汇集在一起，同时保持对各实体的来源液滴的追踪。一个有关的示例是核酸标签化，或条形码化。在该方法中，例如，单一细胞可被定位在液滴中，裂解，然后用与各核酸来源于哪个液滴(进一步，来源于哪个细胞(在单细胞包封的情况中))相关的独特标识物对它们的核酸加标签。核酸随后可全部汇集并测序，并且利用标签根据单一液滴和细胞将它们分组。其中这将具有价值的其它示例将会是对病毒基因组的不同区段进行标签化，或对长DNA分子的部分进行扩增、片段化和标签化，这本质上允许从带标签的短读数产生长序列读出。
用于检测的多重光纤：为了分析液滴的荧光，必需提供激发光(例如，激光形式)并读取产生的发射光。在本发明的一些实施方式中，这可采用单一光纤来实现，所述单一光纤用于将激发光集中进入装置，并且收集以反方向发出的光。然而，该方法的缺点是，对于激发光引导而言理想的光学性质可能对于发射光捕捉而言并非如此。例如，为了激发窄束，具有窄头的光纤是优选的，但为了收集最大数量的发出的光子，具有大收集锥角的宽光纤是优选的。在这些情况中，可采用多重光纤。例如，窄光纤可用以提供浓缩的激发信号，而宽光纤可收集发出的荧光。
打印的液滴中的qPCR：在一些实施方式中，本文所述的方法、装置和/或系统可用于定量核酸。在该方法中，包含核酸的样品液滴被分配至所述基质。还将扩增必需的试剂添加至液滴，通过在分配之前将它们与样品液滴合并或通过将其它液滴分配至包含样品的液滴的位置来进行，其中其它液滴包括必需试剂和检测组分，其中检测组分标志着扩增。液滴随后在适于扩增和监测以读取检测组分的条件下孵育。这为各液滴提供检测组分的变化的速率，其可用于定量液滴中的核酸。除了定量DNA和RNA以外，该方法还可用于定量活的生物体(包括病毒和单一细胞)中的核酸。在此类实施方式中，适于高效细胞裂解的其它步骤，例如纳入裂解缓冲液，可利用液滴添加法来完成。
单细胞条形码化：在一些实施方式中，本文所述的方法、装置和/或系统可用于测序单一细胞。例如，单个细胞可被包封在液滴中并分配至本文所述的基质。随后，细胞可被裂解并经历分子生物过程以扩增它们的核酸和/或使它们的核酸带上条形码。来自全部液滴的材料随后可对于全部细胞汇集，并测序，并且采用所述条形码根据单一液滴或细胞分选序列。例如，这些方法可用于以大规模平行的形式对单一细胞中的基因组或转录物组测序。或者，在包封之前，细胞可与本身标记有关于抗体类型的标签的抗体结合。例如，各标记有与其抗体类型相关的标签的数十或数千种抗体的混合物可用于对细胞收集物染色。细胞随后可被分配并经历条形码化方案，其中，抗体上的标签进一步标记有与其来源液滴/细胞相关的标签/条形码。该方案类似于单细胞测序方案，不同之处在于，不是标记细胞内来源的核酸，而是标记通过抗体被细胞携带的核酸。所述方法可用于，例如，采用固定和透化方案，例如，检测活细胞或死细胞中的表面蛋白或内部蛋白。可对单个病毒、大分子复合物和蛋白质应用类似技术。
合成聚合物：递送具有确定组成的液滴至基质上的特定位置的能力对于聚合物合成而言是有价值的。例如，在一个实施方式中，第一液滴可被分配至包括第一单体或聚合物的基质表面。随后，第二液滴可被分配至相同或邻近的位置，其包括第二单体或聚合物。第一和第二液滴随后可在一定条件下孵育和/或暴露至一定条件，所述条件足以使第一和第二液滴的内容物接触并使第一聚合物或第一单体与第二聚合物或第二单体形成共价键，由此产生合成的聚合物。这些步骤可重复以增加聚合物的长度，并由此产生具有确定的序列的聚合物。在替代性的实施方式中，技术如吉布森组装法(Gibson Assembly)可用于核酸合成，其允许组装同时添加的多重组分，其中，重叠序列用于控制顺序，该顺序中片段被连接以合成具有确定的序列的聚合物。例如，这可用于构建用于合成生物应用的DNA构建体。
筛选文库：基于液滴的微流体技术对于筛选化合物、酶、细胞等的文库而言是有价值的，其中(或与其相联合)发生的反应通常无法受限。例如，在酶定向进化中，成功的酶反应的产物是通常会扩散离开酶催化剂的分子。如果具有不同催化力的多种酶存在于相同溶液中，则产物分子混合，阻止通过一种酶的作用产生的分子被鉴定为已通过该酶产生。为了使酶进化，重要的是能够选择群体中的最佳变体(或相对于该群体的其它成员具有所需酶活性的变体)，这要求用于通过产物浓度检测酶活性的方法。通过将各酶包封在不同的液滴中，能够通过检测各液滴中的产物浓度来独立地检测各变体的活性。这还可以打印的液滴形式进行。例如，各酶变体可被定位在阵列上的液滴中并分析活性，并且可通过回收包封液滴来获得高效酶(或具有所需酶活性的那些)。可进行类似筛选以通过评价其对于液滴中的细胞的作用来测试药物(例如，小分子药物)，或药物组合的疗效。或者，通过随时间推移观察液滴，还能够基于时间依赖性的测量结果，例如特定时间和/或特定时程的产物浓度的峰生成情况，来筛选。
打印微阵列：在一些实施方式中，本文所述的方法、装置和/或系统可用于在阵列上合成寡聚物以供于微阵列生成。例如，基质可用连接有核酸的部分功能化。随后，通过依次将特定核酸液滴分配至基质表面上的单个点，可使序列附连至基质。所述点的分辨率将取决于液滴可被打印的分辨率，其处于微米级-纳米级特征部的级别。
原位测序：在一些实施方式中，本文所述的方法、装置和/或系统可用于原位测序。在该方法中，目标是将序列信息与系统中核酸的空间位置相关联，例如，源自组织或肿瘤中的一个细胞的核酸。这可通过将包含关于该标签的位置的标签的液滴打印到所述组织上来实现。例如，组织的左上角可打印有标签，该标签与其处于左上角的标签坐标相关，其中不同的标签序列(例如包含核酸)可用于组织上的不同坐标。可允许标签扩散进入组织，并且随后可将组织切片切下并分解成小部分，例如单一细胞。该随后可被重复用于下一切片，采用与组织中的各部份的3D位置相关的标签序列。所述部分，一旦分解，即可随后经历上文所述的单细胞条形码化方法，其中，除了序列(例如基因组DNA和转录组RNA)以外，关于来源样品中的材料部分的位置的标签也被条形码化。这些材料随后可被测序，以提供生物系统中的核酸的序列，以及通过标签序列来提供该部分来源的位置。该实施方式将允许，例如，以与液滴打印分辨率相等的分辨率和切片厚度获得系统中各细胞的全长基因组、转录和蛋白质组学信息。
离散实体的类型
联合本文公开的方法制备和或使用的离散实体(例如，微液滴)的组成和性质可以是不同的。例如，在一些实施方式中，离散实体可包括一个细胞且不多于一个细胞。在其它实施方式中，离散实体可包括多个细胞，即，两个或更多个细胞。在一些方面中，本发明的离散实体可包括一个核酸或多个核酸。在一些实施方式中，如上所述，离散实体可包括一种或多种固体和/或凝胶材料，例如一种或多种聚合物。
在一些实施方式中，表面活性剂可用于使离散实体(例如，微液滴)稳定。因此，微液滴可涉及表面活性剂稳定化的乳剂。可采用允许在离散实体(例如，微液滴)进行所需反应的任何方便的表面活性剂。在其它方面中，离散实体(例如，微液滴)，不通过表面活性剂或粒子稳定化。
所用的表面活性剂取决于多种因素，例如用于所述乳剂的油相和水相(或其它合适的不混溶相，例如，任何合适的疏水和亲水的相)。例如，当采用碳氟化合物油中的水性液滴时，表面活性剂可具有亲水的嵌段(PEG-PPO)和疏水的氟化嵌段( FSH)。然而，如果油被转换成碳氢化合物油，例如，表面活性剂将换而被选择从而使其具有疏水的碳氢化合物嵌段，如表面活性剂ABILEM90。在表面活性剂的选择中，在表面活性剂的选择中可考虑的所需性质，可包括以下一个或多个：(1)表面活性剂具有低粘性；(2)表面活性剂与用于构建所述装置的聚合物不混溶，因此，其不使该装置溶胀；(3)生物相容性；(4)测定试剂不溶于表面活性剂；(5)表面活性剂显示有利的气体溶解性，从而其允许气体进与出；(6)表面活性剂的沸点高于用于PCR的温度(例如，95℃)；(7)乳剂稳定性；(8)表面活性剂使具有所需尺寸的液滴稳定；(9)表面活性剂溶于载体相且不溶于液滴相；(10)表面活性剂具有受限的荧光性质；和(11)表面活性剂在一定温度范围保持在载体相中可溶。
还可考虑其它表面活性剂，包括离子表面活性剂。其它添加剂还包含在油中，以使离散实体(例如，微液滴)稳定化，包括增加离散实体(例如，液滴)在高于35℃的温度的稳定性的聚合物。
本文所述的离散实体(例如，微液滴)可制备为乳剂，例如，制备为分散于不混溶相载流(例如，碳氟化合物油或碳氢化合物油)中的水相流或反之亦然。可选择微流体通道(或其上覆层)的性质，例如，亲水性或疏水性，从而与用于微流体工作流程中具体的点处的乳剂类型相容。
乳剂可采用如下文详细描述的微流体装置产生。微流体装置可形成由尺寸上极其均一的液滴组成的乳剂。微液滴生成过程可通过将两种不混溶的流体(例如油和水)泵送进入接合处来实现。接合处形状、流体性质(粘性、界面张力等)，和流速影响产生的微液滴的性质，但对于相对宽范围的性质而言，控制的、均一的尺寸的微液滴可采用如T接合法(T-junctions)和流动聚焦(flow focusing)的方法来产生。为了变化微液滴尺寸，不混溶的液体的流速可变化，因为对于某些性质范围的T接合法和流动聚焦法而言，微液滴尺寸取决于两种流体流速的总流速和比例。为了采用微流体方法产生乳剂，这两种流体通常被加载进入两个入口储器(注射器、压强管)，随后按需施压以产生所需流速(采用注射泵、压强调节器、重力等)。这将流体以所需流速泵送通过装置，因此，产生具有所需尺寸和速率的微液滴。
向离散实体添加试剂
在主题方法的实践中，可以一个或多个步骤(例如，约2、约3、约4或约5个或更多步骤)，将多种试剂添加至(即，纳入和/或包封进入)离散实体(例如，微液滴)。所述试剂可包括，例如，扩增试剂，例如聚合酶链式反应(PCR)试剂。将试剂添加至离散实体(例如，微液滴)的方法可以多种方式变化。感兴趣的方法包括，但不限于，描述于以下文献的那些：Ahn等,Appl.Phys.Lett.88,264105(2006)；Priest等，Appl.Phys.Lett.89,134101(2006)；Abate等,PNAS,2010年11月9日第107卷第45期19163-19166；和Song等，Anal.Chem.,2006,78(14),第4839–4849页；所述文献的公开内容通过引用纳入本文。
例如，可通过涉及将离散实体(例如，微液滴)与第二离散实体(例如，微液滴)(其包含所述试剂)合并的方法，将试剂添加至离散实体(例如，微液滴)。包含在第二离散实体中的试剂可通过任何方便的方法添加，具体包括本文所述的那些。该第二离散实体可与第一离散实体合并以产生离散实体(例如，微液滴)，其同时包括第一离散实体和第二离散实体的内容物。
一种或多种试剂还可以，或作为替代，采用技术例如液滴聚结或皮注射(picoinjection)来添加。在液滴聚结中，目标液滴(即，微液滴)可沿着包含待添加至所述微液滴的试剂的微液滴流动。可使两种微液滴流动，从而它们彼此接触，但不接触其它微液滴。随后可使这些液滴通过电极或用于施加电场的其它方面，其中所述电场可使微液滴失稳，从而它们合并在一起。
试剂还可以，或作为替代，采用皮注射添加。在该方法中，可使目标液滴(即，微液滴)流动通过包含待添加的试剂的通道，其中所述试剂处于升高的压强下。然而，因存在表面活性剂，在不存在电场时，微液滴将流动通过而不被注射，因为被覆所述微液滴的表面活性剂可能会防止流体进入。然而，如果在微液滴通过注射器时向其施加电场，则包含所述试剂的流体将被注射进入微液滴。可通过几种不同的参数控制添加至微液滴的试剂的量，例如通过开启或关闭电场等，调节使液滴流动的注射压强和速度。
在不同的方面中，一种或多种试剂还可以，或作为替代，通过不依赖于将两个液滴合并在一起或将液体注入液滴的方法来添加至微液滴。而是，一种或多种试剂可通过涉及将试剂乳化成极小液滴的流，然后将这些小液滴与目标微液滴合并的步骤的方法来添加至微液滴。所述方法在本文中应被称作“通过多重-液滴聚结的试剂添加”。这些方法利用了如下事实：因为待添加的液滴的尺寸小于目标液滴的尺寸，小液滴比目标液滴流动得更快，并在其后收集。收集物随后可通过，例如，施加电场，被合并。该方法还可以，或作为替代，用于通过采用若干共同流动的具有不同的流体的小液滴的物流，将多重试剂添加至微液滴。为了允许小液滴和目标液滴的有效合并，重要的是使小液滴小于包含目标液滴的通道，以及使注射目标液滴的通道与施加电场的电极的距离足够远，从而允许小液滴有时间“赶上”目标液滴。如果该通道过短，则并非全部小液滴均能与目标液滴合并，这导致添加的试剂低于所需。某种程度上，这可通过增加电场幅度来补偿，其趋于允许离得较远的液滴合并。除了在相同微流体装置上制造小液滴之外，它们还可以，或作为替代，采用另一微流体液滴制造器或通过均化随后将它们注入包含目标液滴的装置来线下生产。
因此，在一些实施方式中，通过涉及如下内容的方法将试剂添加至微液滴：将试剂乳化成液滴的流，其中所述液滴小于微液滴的尺寸；使所述液滴与微液滴一起流动；和，将液滴和微液滴合并。液滴的流中所含的液滴的直径可在微液滴的直径的约75％或更小的范围内变化，例如，流动液滴的直径是微液滴的直径的约75％或更小，微液滴的直径的约50％或更小，微液滴的直径的约25％或更小，微液滴的直径的约15％或更小，微液滴的直径的约10％或更小，微液滴的直径的约5％或更小，或微液滴的直径的约2％或更小。在某些方面中，多个流动液滴可与微液滴合并，例如2个或更多个液滴，3个或更多个，4个或更多个，或5个或更多个。所述合并可以多种方式进行，包括但不限于通过施加电场，其中所述电场有效使流动液滴与微液滴合并。
在另一方面中，通过将待添加试剂的液滴包封(即，“目标液滴”)包封在包含待添加的试剂(“目标试剂”)的液滴之内，试剂被添加至于较早时间形成的液滴(例如，微液滴)。在某些实施方式中，所述方法通过如下方式进行：首先将目标液滴包封在合适的疏水相(例如，油)的壳中，以形成双重乳剂。该双重乳剂随后被包含目标试剂的液滴包封以形成三重乳剂。为了将目标液滴与包含目标试剂的液滴合并，随后采用任何合适的方法将双重乳剂猛然打开，包括但不限于，施加电场，添加使液滴界面失稳的化学剂，使三重乳剂流动通过多个构造以及其它微流体几何构造，施加机械搅拌或超声，增加或减少温度，或通过将磁性粒子包封在当由磁场牵拉时能够破坏双重乳剂界面的液滴中。
分选
在本发明方法的实践中，可采用一个或多个分选步骤。感兴趣的分选方法包括，但不必限于，涉及采用一个或多个分选器的方法，例如，微流体装置的分选器，其采用微流体阀、膜阀、分支通道、表面声波，和/或介电电泳。可与本文公开的方法、系统和装置联用的分选方法还包括示于图2的那些，和由如下文献所述的那些：Agresti等,PNAS第107卷,第9期,4004-4009；其通过引用其公开内容纳入本文。群，例如，离散实体的群，可通过分选富集，其中，包含具有或不具有所需性质的成员的混合物的群可通过将不具有所需性质的那些成员移去来富集，由此产生具有所需性质的富集的群。
在多种实施方式中，主题方法包括扫描，例如，光学扫描一个或多个离散实体(例如，微液滴)，以促进对离散实体的分选。如此，在一些实施方式中，微流体装置或其部分，例如，分选器，包括一个或多个检测仪，例如，光学扫描仪。本领域已知多种合适的光学扫描仪。所述光学扫描仪可包括，例如，用于将激发能施加至一个或多个离散实体的一个或多个光纤。在一些实施方式中，合适的光学扫描仪使用导入目标后方的激光光源，并且集中在其中液滴流动通过的微流体通道上，例如，以激发一个或多个离散实体中的荧光染料。扫描一个或多个离散实体可允许确定被扫描的实体的一种或多种性质，例如，尺寸、形状、组成。进而，分选可基于所述一种或多种性质进行。例如，分选可基于获自一个或多个离散实体的光学扫描的结果来进行。
可检测的离散实体的性质包括但不限于，尺寸、粘性、质量、浮力、表面张力、电传导性、电荷、磁性，和/或存在或不存在一种或多种组分，例如，一种或多种可检测的标记物(例如，一个或多个荧光标记物)。在某些方面中，分选可至少部分基于微液滴中一个或多个细胞的存在或不存在，例如，一个或多个可检测标记的细胞。在某些方面中，分选可至少部分基于对于PCR扩增产物的存在或不存在的检测结果。
分选可应用于本文公开的方法中的任何合适的点。此外，可对离散实体或其类型(例如，微液滴)的群施加两个或更多个分选步骤，例如，约2个或更多个分选步骤，约3个或更多个，约4个或更多个，或约5个或更多个等。当施加多个分选步骤时，所述步骤可以一个或多个方式基本相同或不同(例如，基于不同性质的分选，采用不同技术的分选等)。
此外，离散实体(例如，液滴)，可在任何分选步骤之前或之后纯化。在一个实施方式中，液滴可如下纯化：液滴中的大部分流体用纯化的溶液替代，而无需移去可包封在所述液滴中的任何离散试剂，例如细胞或珠。首先，微液滴与溶液注射以稀释其中的任何杂质。随后，稀释的微液滴流动通过其上采用电极施加有电场的微流体通道。因通过该场产生的介电电泳力，随着细胞或其它离散试剂通过该场时，它们将在流中移动位置。液滴随后分解，从而全部目标结束于一个微液滴中。因此，初始微液滴已被纯化的，其中污染物可被移去，同时离散试剂(例如珠或细胞)(其可被包封在液滴中)的存在和/或浓度在所得微液滴中得以保持。
微液滴可基于一种或多种性质被分选。感兴趣的性质包括但不限于，尺寸、粘性、质量、浮力、表面张力、电传导性、电荷、磁性，和/或存在或不存在一种或多种组分，例如，一种或多种可检测的标记物。在某些方面中，分选可至少部分基于微液滴中一个或多个细胞的存在或不存在，例如，一个或多个可检测标记的细胞。在某些方面中，分选可至少部分基于对于PCR扩增产物的存在或不存在的检测结果。
分选可用于，例如移去其中无细胞存在的离散实体(例如，微液滴)。包封可导致其中无细胞存在的一个或多个离散实体(例如，微液滴)，包括大部分的离散实体(例如，微液滴)。如果所述空液滴留在系统中，它们将如同任何其它液滴一样被处理，这个过程中将会浪费试剂和时间。为了实现最高速度和效率，这些空液滴可采用液滴分选被移去。例如，可在接近滴落-喷射(dripping-to-jetting)转换时操作液滴制造器，从而，在不存在细胞时，形成第一尺寸的液滴(例如，8μm)；对比之下，当存在细胞时，流中产生的干扰将触发射流(jet)的解体(breakup)，形成第二尺寸的液滴(例如，直径25μm)。装置可因此产生第一尺寸的空液滴(例如，8μm)，和包含单一细胞的第二尺寸的液滴(例如，25μm)的双分散群，其随后可通过尺寸被分选，例如，利用水动力分选器，以仅回收包含单一细胞的第二(例如，更大)尺寸的液滴。
主题实施方式的分选器可以是主动或被动分选器。感兴趣的被动分选器包括水动力分选器，其根据尺寸，基于小液滴和大液滴行进通过微流体通道不同的方式，将离散实体(例如，微液滴)分析进入不同的通道。还感兴趣的是大批量(bulk)分选器，其一简单示例是包含重力场中具有不同质量的液滴的管。通过离心、搅拌和/或振荡所述管，浮力更大的较轻的液滴自然地迁移至容器顶部。具有磁性质的液滴可以类似方式被分选，不同之处在于对容器施加磁场，由此，具有磁性的液滴将根据那些性质的量级而自然地迁移。用于主题方法的被动分选器还可涉及相对大的通道，其将在基于它们的流动性质的同时分选大量的液滴。此外，在一些实施方式中，分选通过使一个或多个阀(例如，微流体阀)活化来进行。
皮注射还可用于改变液滴的电性质。例如，这可用于通过添加离子来改变液滴的传导性，其可随后用于例如采用介电电泳分选它们。或者，皮注射还可用于使液滴带电。这可通过将流体注入带电液滴来实现，从而在注射之后，液滴将是带电的。这将产生液滴的集合，其中一些是带电的而另一些不带电，并且，带电的液滴可随后通过使它们流动通过电场区域来提取，这将使它们基于它们的荷电量偏转。通过注射不同的量的液体，通过调节皮注射，或通过对于附着的注射体积调节注射不同的电荷的电压，可调节液滴上的最终电荷，以产生带有不同电荷的液滴。这些随后将通过电场区域中的不同的量而偏转，这允许它们被分选进入不同的容器。
用于微液滴的高速分选的改进的分选架构
在一些实施方式中，本发明提供具有改进的分选架构的微流体装置，其促进离散实体(例如，微液滴)的高速分选。该分选架构可与本文所述的微液滴打印机实施方式联用，或用于其中需要微液滴的高速分选的任何其它合适的应用中。还描述相关的方法和系统。例如，在一些实施方式中，提供微流体装置，其包括至少进口通道；第一出口通道，其与进口通道流体连通；第二出口通道，其与进口通道流体连通；分隔壁，其将第一出口通道与第二出口通道隔开，其中所述分隔壁包含高度小于所述进口通道的高度的第一近端部分，和高度等于或大于所述进口通道的高度的第二远端部分。
在一些实施方式中，分隔壁的第一近端部分的高度是所述进口通道的高度的约10％-约90％，例如，约20％-约80％、约30％-约70％、约40％-约60％，或所述进口通道的高度的约50％。
在一些实施方式中，分隔壁的第一近端部分的高度是所述进口通道的高度的约10％-约20％、约20％-约30％、约30％-约40％、约40％-约50％、约50％-约60％、约60％-约70％，或约80％-约90％。
在一些实施方式中，分隔壁的近端部分的长度等于或大于本文所述的微液滴的直径，例如，待采用本文所述的微流体装置分选的微液滴。例如，在一些实施方式中，分隔壁的近端部分的长度是本文所述的微液滴的直径的约1X-约100X，例如，约1X-约10X、约10X-约20X、约20X-约30X、约30X-约40X、约40X-约50X、约50X-约60X、约60X-约70X、约70X-约80X、约80X-约90X，或本文所述的微液滴的直径的约90X-约100X。
在一些实施方式中，本发明的微流体装置包括电极，例如，液体电极，其经设置以选择性地在分隔壁上游的微流体装置的进口通道中施加电场，以有效分选一个或多个微液滴。
在一些实施方式中，液体电极包括填充有导电液体(例如盐水或缓冲液)并且位于其中需要电场的微流体装置中的位置处的液体电极通道。在具体实施方式中，液体电极采用电源供应器或高压放大器供电。在一些实施方式中，液体电极通道包括入口，从而可将导电液体添加至该液体电极通道。可将所述导电液体添加至所述液体电极通道，例如，通过将填充有该液体的管连接至所述入口并施加压强。在具体实施方式中，液体电极通道还包括出口端口，供于从所述通道释放导电液体。
在替代性的实施方式中，可采用由任何合适的传导性材料制造的固体电极。
如本文所述，本发明的微流体装置可包括在合适的通道中提供的环绕(moat)盐溶液(以产生场梯度，其用于介电电泳偏转并且限制可能会造成不希望的液滴融合的杂散场)。
因此，提供具有有间隙的分隔壁的微流体装置，其促进高速分选，如实验部分中详细描述。本发明的有间隙的分隔壁联合本文所述的的一个或多个检测仪，和本文所述的一个或多个电极，促进微液滴的高速分选。
打印细胞层
在一些实施方式中，本发明提供用于打印一种或多种组织和/或细胞层的方法和相关的装置和系统。图3描述了本发明的一种类型的微流体系统和方法的非限制性、简化的示意图，且可用于打印一种或多种组织或细胞层。图3说明了将包括细胞的离散实体递送至基质。在一个所述方法中，离散实体301(例如，液滴)采用装置(例如，微流体装置300)和载流302制备，以产生包括该离散实体的混合的乳剂。离散实体(例如，液滴301)，如图3所示，可包括一种或多种试剂，例如，促进细胞生长的试剂和/或细胞培养基组分和/或细胞培养基质，例如，基质胶，以及不同类型的细胞303。主题方法可包括包封，例如，通过完全包含在其中，将一个或多个细胞包封在离散实体中。
在打印组织的一些方面中，使混合的乳剂流动通过分选器304，其基于一个或多个它们的特点从混合的乳剂分选离散实体301。如图3所示，分选器304可经设置以检测和/或基于细胞类型分离包含细胞303的离散实体301。例如，分选器可经设置以分离包含一个或多个感兴趣的细胞的第一类型的离散实体(例如，液滴类型)，和第二类型，例如，不包含一个或多个感兴趣的细胞的类型。如此，分选器304可产生第一组分，例如，包含载流和具有第一类型(例如，感兴趣的一个或多个类型)的离散实体的流体，和，第二组分，例如，包含载流和具有第二类型(例如，不感兴趣的一个或多个类型)的离散实体的流体。分选器304还可经设置以将第一组分导向用于递送至基质的，具有递送孔口305(例如，具有递送孔口305的喷嘴)的微流体装置的部分，并将第二组分导向废液容器或出口。或者，第二组分可通过再引入分选器504的上游而被再循环。在一些实施方式中，喷嘴或其部分，例如，递送孔口305，可位于离开目标例如基质的表面306或先前沉积的离散实体的层约1μm-约200μm，例如约5μm-约100μm，或约10μm-约50μm(含端值)，例如约20μm处。
在一些变化形式中，所述方法可包括使离散实体(例如，包括第一细胞类型的离散实体)第一层307附着至基质的基质表面306，并使一个或多个其它层，例如，离散实体(例如，包括第二细胞类型的离散实体)的第二层308附着至离散实体的第一层。在多种实施方式中，离散实体的第一层307可在第二层308之前或与第二层308同时施加至基质表面306。所述方法的方面还可包括使离散实体(例如，包封细胞的离散实体)的一个或多个其它层附着至一个或多个先前附着的层。例如，主题方法可包括使1-1000万(含端值)，例如10-1百万或100-10,000(含端值)个离散实体的其它层附着。因此，所述方法可包括通过对离散实体层的重复的覆层来提供层化的结构，例如，组织。应注意，各层可包括特定类型的离散实体或具有不同类型的多个离散实体，例如，具有不同的组成或组分的离散实体。例如，第一层307和/或第二层308可包括具有不同的细胞类型的多个离散实体，例如，第一离散实体包括第一细胞类型，而第二离散实体包括与第一离散实体不同的第二细胞类型。换言之，各层可包括同质或异质的离散实体(例如，微液滴)的群。
在一些实施方式中，基质或其部分(例如，基质表面)，包括一个或多个电极309。所述电极309可用于施加力，由此造成离散实体的第一层307(例如，初始层)附着至，例如，湿的，基质或其基质表面306。一旦施加离散实体的第一层307(例如，初始层)，第一层307的离散实体的液滴表面的电场梯度可造成后续离散实体，例如，第二层308的离散实体，附着至，例如，湿的，第一层307。
检测细胞
在一些实施方式中，主题方法涉及，同时在混合的乳剂中和/或在离散实体附着至离散实体的层、基质或其部分(例如，基质表面)之前、过程中或之后，检测一个或多个离散实体(例如，液滴)中的细胞(例如，肿瘤细胞)的一个或多个子集的一个或多个细胞或一种或多种其它特点(例如类型和/或尺寸)的存在和/或不存在，如本文所述。在一些实施方式中，微流体装置的分选器用于检测包封在离散实体中的细胞的一个或多个特点。
本文公开的方法的方面可包括，在多个时间点，例如，多个相等间隔的时间点，检测细胞(例如，附着至基质的离散实体中的一个或多个细胞)的一个或多个特点。所述方法还可包括在一段时间内连续检测一个或多个细胞的一个或多个特点，例如检测一个或多个细胞的组分和/或一个或多个细胞的产物。所述方法的一些实施方式还可包括回收，例如，通过提取，从离散实体回收一个或多个细胞，一个或多个细胞的组分，例如，脱氧核糖核酸(DNA)，和/或一个或多个细胞的产物。在多种实施方式中，所述方法可包括对从一个或多个细胞回收的DNA测序。
本文公开的方法的方面可包括，将具有获自生物样品的一个或多个细胞的离散实体纳入混合的乳剂。
本文中所用的术语“生物样品”涵盖获自多种来源的多种样品类型，所述样品类型包含生物材料。例如，该术语包括获自哺乳动物对象(例如，人类对象)的生物样品，和获自食物、水或其它环境来源等的生物样品。该定义包括生物来源的血液和其它液体样品，固体组织样品如活检样品或组织培养物或由其衍生的细胞，以及它们的后代。该定义还包括获得后经任何方式处理的样品，如试剂处理、溶解、或对某些组分(例如多核苷酸)的富集。术语“生物样品”包括临床样品，还包括培养的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、细胞、血清、血浆、生物液体和组织样品。“生物样品”包括细胞；生物流体例如血液、脑脊液、精液、唾液等；胆汁；骨髓；皮肤(例如，皮肤活检物)；和获自个体的抗体。
如本文中更详细地描述，在不同的方面中，主题方法可用于检测来自细胞(例如来自生物样品的细胞)的多种组分。感兴趣的组分包括但不必限于，细胞(例如，循环细胞和/或循环肿瘤细胞)、多核苷酸(例如，DNA和/或RNA)、多肽(例如，肽和/或蛋白质)，和可存在于生物样品中的多种其它组分。
本文所用的“多核苷酸”或“寡核苷酸”指核苷酸单体的线性聚合物，并可互换使用。多核苷酸和寡核苷酸可具有多种结构构型中的任一种，例如，单链的、双链的，或两者的组合，以及具有较高级别的分子内或分子间二级/三级结构，例如，发卡结构、环、三链区域等。多核苷酸的大小范围通常是当它们通常称作“寡核苷酸”时的少许单体单位如5-40个单体单位，直至几千个单体单位。多核苷酸或寡核苷酸由一系列字母代表(大写或小写)，如"ATGCCTG"时，应理解从左到右的核苷酸是5'→3'顺序，其中"A"指代脱氧腺苷，"C"指代脱氧胞苷，"G"指代脱氧鸟苷，"T"指代胸苷，“I”指代脱氧次黄苷，“U”指代尿苷，除非另有说明或从上下文中显见并非如此。除非另有说明，术语和原子编号习惯遵循Strachan和Read，Human Molecular Genetics 2(《人分子遗传学2》)(WL出版社(Wiley-Liss)，纽约，1999)所述。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合形式。NH2指存在于多肽的氨基末端处的游离氨基基团。COOH指存在于多肽的羧基末端的游离羧基基团。为了与标准多肽命名法一致，采用J.Biol.Chem.，243(1969)，3552-3559。
在某些方面中，提供用于对细胞(包括正常细胞或肿瘤细胞)进行计数和/或基因分型的方法。所述方法的一个特征是利用微流体。
根据主题方法的一些实施方式，细胞，例如，乳剂中的和/或附着至基质的离散实体中的细胞，生物样品(例如，全血)可采用任何方便的方法，例如，通过应用针头和/或注射器，回收自对象。生物样品随后可例如采用处理步骤(例如离心、过滤等)经处理以移去非细胞组分。
生物样品或其子集中的各细胞随后可采用微流体装置被包封进入离散实体(例如，液滴)。在包封来自生物样品的组分中可采用的方法和装置描述于PCT公开号WO 2014/028378，其公开内容通过引用其全文的方式纳入本文并用于所有目的。感兴趣的包封方法还包括但不限于，通过水动力方式触发的液滴形成和如下文献中所述的那些：Link等，Phys.Rev.Lett.92，054503(2004)，其公开内容通过引用纳入本文。也可应用将细胞包封进入液滴的其它方法。需要时，在将它们包封进入液滴之前，细胞可用一种或多种抗体和/或探针染色。
还可在其中可造成所述细胞破坏(由此释放它们的基因组)的条件下将一个或多个裂解剂添加至包含细胞的离散实体(例如，液滴)。裂解剂可在细胞被包封进入离散实体(例如，微液滴)之后添加。可采用任何方便的裂解剂，例如蛋白酶K或细胞毒素。在具体实施方式中，细胞可与包含去污剂例如曲通X100和/或蛋白酶K的裂解缓冲液共同包封在液滴中。其中可造成所述细胞爆破的特定条件将根据所用的特定裂解剂而变化。例如，如果将蛋白酶K纳入作为裂解剂，离散实体(例如，液滴)可被加热至约37-60℃持续约20分钟，以裂解细胞并且允许蛋白酶K消化细胞蛋白质，这之后，它们可被加热至约95℃持续约5-10分钟以使蛋白酶K失活。
在某些方面中，细胞裂解还可以，或作为替代，依赖于不涉及裂解剂的添加的技术。例如，裂解可通过可采用不同几何特征部来有效穿刺、剪切、研磨细胞等的机械技术来实现。也可采用其它类型机械断裂例如声学技术。此外，热能也可用于裂解细胞。有效于细胞裂解的任何方便的方法均可用于本文所述的方法。
对于待检测的各基因(例如，致癌基因)，可将一个或多个引物引入离散实体(例如，液滴)。因此，在某些方面中，对于全部靶基因(例如，致癌基因)的引物，可同时存在于离散实体(例如，液滴)中，由此提供多重化的测定。离散实体(例如，液滴)可经温度循环，从而例如包含癌性细胞的离散实体(例如，液滴)将经历PCR。在该时间过程中，仅对应于基因(例如，致癌基因)的存在于基因组中的引物将诱导扩增，在离散实体(例如，液滴)中产生这些基因(例如，致癌基因)的多个拷贝。检测这些PCR产物的存在与否可通过多种方式实现，例如通过采用FRET，用嵌入染料染色，或将它们附着至珠。本文还提供关于用于所述检测的不同的选择的更多信息。离散实体(例如，液滴)，可被光学探测，例如，采用激光探测，以检测PCR产物。光学探测离散实体(例如，液滴)可涉及对存在于初始群中的目标细胞(例如，肿瘤细胞)的数量计数，和/或允许鉴定存在于各细胞(例如，肿瘤细胞)中的目标(例如，致癌基因)。
主题方法的方面可用于确定生物样品是否包含具体的感兴趣的细胞，例如，肿瘤细胞。在某些方面中，主题方法可包括对存在于生物样品中的感兴趣的细胞(例如，肿瘤细胞)的数量定量。对存在于生物样品中的感兴趣的细胞(例如，肿瘤细胞)的数量的定量可至少部分基于离散实体(例如，液滴)的数量，其中检测PCR扩增产物。例如，离散实体(例如，液滴)，可在预期其中大多数离散实体(例如，液滴)包含零个或一个细胞的条件下产生。不包含任何细胞的那些离散实体(例如，液滴)可采用本文更详细描述的技术去除。在进行上文描述的PCR步骤之后，可对经检测包含PCR产物的离散实体(例如，液滴)的总数计数，从而对生物样品中感兴趣的细胞(例如，肿瘤细胞)的数量定量。在某些方面中，所述方法还可包括对离散实体(例如，液滴)的总数计数，从而确定来自生物样品的感兴趣的细胞(例如，肿瘤细胞)的组分或百分比。
PCR
如上所述，在主题方法的实践中，可采用基于PCR的测定，例如，定量PCR(qPCR)，来检测离散实体或其一种或多种组分(例如，其中包封的细胞)中存在的某些感兴趣的基因(例如，致癌基因)的存在。所述测定可应用至微流体装置或其部分中的离散实体和/或在离散实体附着至基质或其部分(例如，基质表面)时应用。所述基于PCR的测定的条件可包括随时间推移检测核酸扩增，并且可以一个或多个方式不同。
例如，可添加至微液滴的PCR引物的数量可不同。术语"引物"可指多于一种引物并且可指寡核苷酸，不论是在纯化的限制性消化中天然产生的还是通过合成方式产生的，其在置于一定条件下时能够作为沿互补链合成的起始点，该条件中，催化互补于核酸链的引物延伸产物的合成。所述条件包括，例如，存在四种不同的脱氧核苷三磷酸酯和聚合诱导剂例如DNA聚合酶或逆转录酶，在合适的缓冲液("缓冲液"，其包括作为辅因子的替代物或影响pH、离子强度等)中以及合适的温度下。引物可以是单链的以供最大效率扩增。
本文所用的核酸序列的组分可指寡核苷酸，其在与所述核酸序列比对时，一个序列的5'端与另一序列的3'端配对，处于"反平行的关联"中。不需完美互补；稳定的二聚体可包含错配碱基对或不相配的碱基。二聚体的稳定性可通过经验考虑多种变化形式来确定，包括例如，寡核苷酸的长度、寡核苷酸中胞嘧啶和鸟嘌呤的浓度百分比、离子强度，和错配碱基对的发生率。
可添加至微液滴的PCR引物的数量的范围可以是约1-约500或更多，例如，约2-100引物、约2-10引物、约10-20引物、约20-30引物、约30-40引物、约40-50引物、约50-60引物、约60-70引物、约70-80引物、约80-90引物、约90-100引物、约100-150引物、约150-200引物、约200-250引物、约250-300引物、约300-350引物、约350-400引物、约400-450引物、约450-500引物，或约500引物或更多。
所述引物可包含针对一个或多个感兴趣的基因(例如致癌基因)的引物。添加的所述针对感兴趣的基因的引物可以是，约1-500，例如，约1-10引物，约10-20引物，约20-30引物，约30-40引物，约40-50引物，约50-60引物，约60-70引物，约70-80引物，约80-90引物，约90-100引物，约100-150引物，约150-200引物，约200-250引物，约250-300引物，约300-350引物，约350-400引物，约400-450引物，约450-500引物，或约500引物或更多。
所述引物和/或试剂可以一个步骤或多于一个步骤添加至离散实体(例如，微液滴)中。例如，引物可以两个或更多个步骤，三个或更多个步骤，四个或更多个步骤，或五个或更多个步骤添加。无关于引物是以一个步骤还是多于一个步骤添加，它们可在添加裂解剂之后，添加裂解剂之前，或伴随地裂解剂的添加而添加。在添加裂解剂之前或之后添加时，PCR引物可以与添加裂解剂分开的步骤添加。在一些实施方式中，离散实体(例如，微液滴)，可经历稀释步骤和/或酶失活步骤，然后添加PCR试剂。所述方法的示例性实施方式描述于PCT公开号WO 2014/028378，其公开内容通过引用其全文的方式纳入本文并用于所有目的。
一旦引物已被添加至离散实体(例如，微液滴)，离散实体(例如，微液滴)，可在允许PCR的条件下孵育。离散实体(例如，微液滴)可在与用于添加引物相同的微流体装置上孵育，或可在分离装置上孵育。在某些实施方式中，离散实体(例如，微液滴)在允许PCR扩增的条件下的孵育在用于包封细胞和/或裂解细胞的相同微流体装置上进行。微液滴的孵育可采用多种形式。在某些方面中，包含PCR主混物的液滴可流动通过有效于PCR的条件下孵育液滴的通道。使微液滴流动通过通道可涉及蛇行通过(snake over)保持在有效于PCR的温度的不同温度区的通道。例如，所述通道可循环通过两个或更多个温度区，其中至少一个区保持在约65℃且至少一个区保持在约95℃。随着液滴移动通过所述区，它们的温度按PCR所需循环。区的精确数量，和各区的相应温度，可经确定以实现所需PCR扩增。
在其它实施方式中，微液滴的孵育可涉及采用“Megadroplet Array”，例如如PCT公开号WO 2014/028378所述，其公开内容通过引用其全文的方式纳入本文并用于所有目的。在所述装置中，数百、数千或数百万的阱的阵列缩排进入热系统之上的通道(例如，PDMS通道)。通道可被施压，由此防止气体逃逸。微流体通道的高度小于离散实体(例如，液滴)的直径，造成离散实体采用展平的煎饼形状。当离散实体流动通过未被占据的缩排(indentation)时，其采用较低、更加能量有利的曲率半径，导致将离散实体整体拉入阱的力。通过使离散实体以密集流体(close pack)形式流动，确保阵列上的全部阱被占据。整个装置可采用加热器热循环。
在某些方面中，加热器包括Peltier板、散热器，和控制计算机。通过控制施加的电流，Peltier板允许加热或冷却芯片高于或低于室温。为了确保受控且可再现的温度，计算机可采用整合的温度探针监测阵列的温度，并且可调节施加的电流以按需加热和冷却。金属(例如铜)板允许均一地施加热并在冷却循环过程中散去过度的热，允许在1分钟内从约95℃冷却至约60℃。
本发明的方法还可包括引入一个或多个探针至微液滴。本文关于核酸所用的术语"探针"指标记的寡核苷酸，其与目标核酸中的序列形成二聚体结构，这归因于探针中至少一段序列与目标区域中的序列具有互补性。感兴趣的探针包括但不限于，探针(例如，描述于Holland,P.M.；Abramson,R.D.；Watson,R.；Gelfand,D.H.(1991)."通过利用栖热水生菌DNA聚合酶的5'----3'核酸外切酶活性检测特定聚合酶链式反应产物(Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the5'----3'exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase)".PNAS,88(16):7276–7280)。
在主题方法的一些实施方式中，基于RT-PCR的测定用于检测某些感兴趣的转录本(例如，致癌基因)在细胞中的存在。在此类实施方式中，除了用于进行本文所述的PCR的试剂(统称“RT-PCR试剂”)之外，将cDNA合成必需的逆转录酶和任何其它试剂添加至离散实体(例如，微液滴)。RT-PCR试剂采用本文所述的任何方法添加至离散实体(例如，微液滴)。一旦用于RT-PCR的试剂已被添加至离散实体(例如，微液滴)，微液滴可在允许反转录的条件下孵育，然后在允许本文所述的PCR的条件下孵育。微液滴可在与用于添加RT-PCR试剂相同的微流体装置上孵育，或可在分离装置上孵育。在某些实施方式中，微液滴在允许RT-PCR的条件的孵育在用于包封细胞和裂解细胞的相同微流体装置上进行。
在某些实施方式中，添加至微液滴用于RT-PCR或PCR的试剂还包括能够检测实时RT-PCR或PCR产物的荧光DNA探针。可用的任何合适的荧光DNA探针包括但不限于SYBRGreen，Molecular Beacons和Scorpion探针。在某些实施方式中，添加至微液滴的试剂包括多于一种DNA探针，例如，两种荧光DNA探针，三种荧光DNA探针，或四种荧光DNA探针。多重荧光DNA探针的应用允许在单一反应中同时测量RT-PCR或PCR产物。
此外，可根据主题实施方式采用的基于PCR的感兴趣的测定的示例包括但不限于，定量PCR(qPCR)、定量荧光PCR(QF-PCR)、多重荧光PCR(MF-PCR)、实时PCR(RT-PCR)、单细胞PCR、PCR-RFLP/RT-PCR-RFLP、热启动PCR、巢式PCR、原位普罗尼PCR(polony PCR)、原位滚环扩增(RCA)、桥式PCR、皮升滴定PCR和乳液PCR。其他合适扩增方法包括连接酶链反应(LCR)，转录扩增，自我维持的序列复制，靶多核苷酸序列选择性扩增，共有序列引物聚合酶链反应(CP-PCR)，随机引物聚合酶链反应(AP-PCR)，简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)和基于核酸序列的扩增(NABSA)。
多路技术(Multiplexing)
在主题方法的不同的方面中，可针对具体的离散实体或其一种或多种组分，例如，其中包封的细胞检测并分析多重生物标志物。检测的生物标志物可包括但不限于，一种或多种蛋白质、转录本和/或一个细胞的基因组中的遗传学签名或其组合。采用标准的基于荧光的检测，可同时询问的生物标志物的数量可限于荧光染料的数量，其可在各离散实体(例如，微液滴)中被独立地可视化。在某些实施方式中，可增加可在具体的离散实体(例如，微液滴)中单独检测的生物标志物的数量。例如，这可通过如下方式实现：将染料隔离至离散实体(例如，微液滴)的不同部分。在具体实施方式中，可将珠(例如珠)偶联染料和探针(例如，核酸或抗体探针)可包封在离散实体(例如，微液滴)中以增加分析的生物标志物的数量。在另一个实施方式中，荧光极化可用于实现针对单细胞的不同的生物标志物的更大数量的可检测的信号。例如，荧光染料可附连至不同探针，并且离散实体(例如，微液滴)可在不同的极化条件下可视化。由此，相同有色染料可用于提供针对单细胞的不同的探针靶标的信号。固定的和/或透性化的细胞的应用还能用于增加多重化的水平。例如，标记的抗体可用于靶蛋白靶标对细胞组分的定位，而标记的PCR和/或RT-PCR产物在离散实体(例如，微液滴)中是游离的。这允许相同颜色的染料用于抗体并且用于通过RT-PCR产生的扩增子。
检测PCR产物
其中PCR产物可被检测的方式可根据主题方法而不同。例如，如果目的是对群中存在的具体细胞类型(例如，肿瘤细胞)计数，这可通过采用简单的二元测定法，其中SybrGreen，或任何其它染剂和/或嵌入染剂，被添加至各离散实体(例如，微液滴)，从而在事件中，存在特征性基因(例如，致癌基因)，并且产生PCR产物，所述离散实体(例如，微液滴)将变得发荧光。荧光变化可归因于荧光极化。检测组分可包括嵌入染剂(例如，SybrGreen)的应用。
多种不同的检测组分可用于实践主题方法，包括采用一种或多种荧光染料。所述荧光染料可被分成几个家族，例如荧光素及其衍生物；罗丹明及其衍生物；菁蓝及其衍生物；香豆素及其衍生物；Cascade Blue及其衍生物；荧光素黄及其衍生物；氟化硼络合二吡咯甲川(BODIPY)及其衍生物等。荧光团的示例包括吲哚碳菁(C3)、吲哚二碳菁(C5)、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、德克萨斯红、太平洋蓝、俄勒冈绿488、Alexa Fluor-355、AlexaFluor488、Alexa Fluor532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor568、AlexaFluor594、Alexa Fluor647、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680、JOE、丽丝胺、罗丹明绿、BODIPY、异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基荧光素(FAM)、藻红蛋白、罗丹明、二氯罗丹明(dRhodamine)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、羧基-X-罗丹明(ROX)、LIZ、VIC、NED、PET、SYBR、PicoGreen、RiboGreen等。关于荧光团及其应用的描述可见于，例如，R.Haugland，《荧光探针和研究产品手册》(Handbook of Fluorescent Probes and Research Products)，第9版.(2002)，分子探针公司(Molecular Probes)，奥勒冈州尤金市；M.Schena,《微阵列分析》(Microarray Analysis)(2003)，约翰威利父子出版社(John Wiley&Sons)，新泽西州霍博肯；《合成医药化学2003/2004目录》(Synthetic Medicinal Chemistry 2003/2004Catalog)，百瑞联合公司(Berry and Associates)，密歇根州安娜堡；G.Hermanson,《生物偶联技术》(Bioconjugate Techniques)，学术出版社(Academic Press)(1996)；和《葛莱研究2002目录》(Glen Research 2002Catalog)，弗吉尼亚州斯特林。
因此，在主题方法的实践中，组分可基于，例如，荧光变化，来检测。在某些方面中，荧光变化归因于荧光能量共振转移(FRET)。在该方法中，可采用特殊引物组，其中所述5'引物具有淬灭剂染料且3'引物具有荧光染料。这些染料可被安排在引物上的任何位置，在末端或在中段。因为引物是互补性的，它们在溶液中将以二聚体形式存在，从而荧光染料的发射将通过淬灭剂染料被淬灭，因为它们将彼此紧密接近，使溶液看上去昏暗。PCR之后，这些引物将被纳入长的PCR产物，因此将彼此远离。该将允许荧光染料发光，使溶液变得发荧光。因此，为了检测具体的靶基因(例如，致癌基因)是否存在，可以在荧光染料的波长检测离散实体(例如，液滴)的强度。为了检测不同的靶基因(例如，致癌基因)是否存在，这将采用针对不同的引物的不同的有色染料来进行。该可能会使离散实体(例如，液滴)变得在对应于存在于细胞中的靶基因(例如，致癌基因)的引物的全部波长处发荧光。
在一些实施方式中，本文公开的方法可包括如下步骤：将独特标识物分子(例如，核酸条形码)包封进入或纳入多个离散实体(例如，液滴)，从而所述多个离散实体的各离散实体包含不同组的独特标识物分子。或者或此外，本文公开的方法可包括如下步骤：将独特标识物分子纳入具体的离散实体(例如，液滴)中的各分子。
与分离技术联合的打印
在一些实施方式中，本文所述的打印方法可与分离技术联用，以实现对于离散实体的内容物的检测和分析的更精细的灵敏度。例如，包含细胞的离散实体(例如，液滴)，可被打印至基质，并且例如通过使它们凝胶化而被固化。载体油随后可被移去并用另一材料替代，例如适于分离的凝胶基质。所述基质随后可在适于裂解并分离细胞的内容物的条件下孵育，例如通过施加电流以诱导分子以特定方向(例如垂直于基质平面或在基质的平面内)电泳迁移通过基质。所述分离还可以两种或三种维度进行，以实现平面或立体分离。
可选择离散实体(例如，液滴)在打印的基质上的分隔，从而提供供于分离材料的合适的距离。分离的材料随后可采用多种技术来检测，例如印迹技术例如Western、Southern和Northern印迹，或光学或光谱技术，例如拉曼光谱或质谱，等等。这允许以较高分辨率分析细胞内容物，通过基于生化性质进行分离，然后进行分析步骤，其是灵敏测量技术如液体色谱质谱法的重要的方面。相同概念可应用于其它打印实体，例如包封无细胞转录本和翻译试剂或其它生物试剂的液滴，以及应用于粒子和其它液体液滴，其中所述两步分离和分析技术将是有价值的。例如，所述方法可用于合成生物筛选，通过打印包封细胞或表达目标途径的无细胞提取物的液滴，随后采用分离操作以分离介质中重要的分子，然后进行光谱或质谱分析。
因此，在一些实施方式中本，发明提供方法，其中所述方法包括，采用本文所述的任何合适的方法打印离散实体至基质表面；用适于分子分离的材料(例如聚丙烯酰胺、琼脂糖等)代替载流；在足以诱导离散实体的内容物分子分离进入周围的分离材料(例如，通过施加电流)的条件下孵育打印的基质；和，分析材料中的离散实体的分离的内容物。在一些所述实施方式中，离散实体包括具有生物材料(例如，蛋白质、核酸、细胞、病毒等)的液滴。在一些实施方式中，分离采用凝胶电泳进行。在一些实施方式中，所述方法可用于进行对离散实体和它们的内容物进行印迹实验，例如Southern、Northern和Western印迹。在一些实施方式中，分离的材料采用质谱分析，例如，MALDI、NIMS等。在一些实施方式中，通过改变分离力的方向，材料以多于一个维度分离。在一些实施方式中，分离的材料的分析采用3D成像或其它技术，例如共聚焦显微镜或逐层(layer-by-layer)MALDI-MS，以分析分离材料的3D网络中的分离的材料。
装置
如上所示，本发明主题的实施方式采用包括微流体装置的系统和/或装置。本发明的装置包括上文关于主题方法描述的全部那些。本发明的微流体装置可具有不同形式的特点。
在一些方面中，例如，提供系统和/或装置，其包括一个或多个离散实体(例如，液滴)打印机。离散实体打印机可包括一个或多个微流体装置，例如包括一个或多个离散实体制造器(例如，液滴制造器)的微流体装置，其经设置以产生离散实体(例如，液滴)，如本文所述，和/或一个或多个流道。在一些方面中，一个或多个流道操作性地连接(例如，流体连通)的至一个或多个液滴制造器和/或经设置以从其接收一个或多个液滴。本文中所用的“操作性地连接”和“操作性地偶联”表示以特定方式连接(例如，以允许流体(例如，水)移动和/或允许电力传输的方式)，其允许本文的系统或装置及其不同组分以本文所述的方式有效地操作。
本文的装置的方面还包括一个或多个递送孔口，例如流体连通至一个或多个流道的递送孔口。在一些实施方式中，递送孔口包括其中一个或多个离散实体可通过的开口，例如，圆形或椭圆开口。在一些实施方式中，递送孔口的开口通过装置或其部分(例如，喷嘴(例如可定位的喷嘴))的轮廓确定。递送孔口，如主题实施方式中所含的递送孔口，可具有与本文所述的流道相同的任何尺寸(例如，截面尺寸)，或可具有不同的尺寸。
本文所述的递送孔口，例如，本文所述的微流体喷嘴的递送孔口，将一般具有与待被递送通过其中的液滴的尺寸类似的尺寸。因此，在一些实施方式中，本文所述的递送孔口具有如下直径：约1μm-约1000μm(含端值)，例如，约10μm-约300μm(含端值)。在一些实施方式中，本文所述的递送孔口具有如下直径：约1μm-约10μm、约10μm-约100μm、约100μm-约500μm，或约500μm-约1000μm(含端值)。
喷嘴可被模制作为本文所述的微流体分选器的部分，或可以是与本文所述的微流体分选器配合使用的分开的部分。适用于喷嘴的材料可包括，例如，聚合物管道、小孔皮下注射管道，和改性的玻璃毛细管。
本发明的实施方式还包括装置，其包括与所述递送孔口整合的一个或多个自动化的系统，其中所述自动化的系统(a)选择性地定位，例如，在操作过程中，通过基于离散实体的数量级移动一个或多个距离来将所述递送孔口定位至基质或其部分的附近，和/或(b)选择性地定位，例如，在操作过程中，通过基于离散实体的数量级移动一个或多个距离，将基质或其部分定位于递送孔口的附近，从而离散实体(例如，液滴)可从所述递送孔口喷出和/或沉积在所述基质上。在一些实施方式中，自动化的系统是电子化的和/或包括一个或多个控制单元用于控制自动化，例如控制单元，包括中央处理单元。
如上所述，液滴打印机可包括一个或多个流道，例如，离散实体可进入、流出和/或通过的流道。在某些实施方式中，流道是一个或多个“微”通道。所述通道可具有毫米级别或更小(例如，小于或等于约1毫米)的至少一个截面尺寸。对于某些应用而言，该尺寸可被调节；在一些实施方式中，至少一个截面尺寸是约500微米或更少。在一些实施方式中，截面尺寸是约100微米或更少，或约10微米或更少，并且有时是约1微米或更少。截面尺寸一般垂直于中心线流动方向的尺寸，然而应理解，当遇到通过弯头或趋于改变流动方向的其它特征部流动时，相应的截面尺寸不必严格垂直于流。还应理解，在一些实施方式中，微通道可具有两个或更多个截面尺寸，例如矩形截面的高度和宽度，或椭圆截面的长轴和短轴。这些尺寸之一可与本文提供的大小相比较。注意，用于本发明的微通道可具有极其不成比例的两个尺寸——例如，高度为约100-200微米且宽度在该级别或厘米级或更大的矩形截面。当然，某些装置可采用其中所述两个或更多个轴极其类似或甚至尺寸相同的通道(例如，具有方形或圆形截面的通道)。
在本发明的一些实施方式中，微流体装置采用微制造(microfabrication)技术制造。所述技术可用于制造整合的回路(IC)、微电机械装置(MEMS)、显示屏装置等。可在微流体装置制造中用以产生小尺寸图案的微制造工艺的类型包括：光刻法(包括X射线光刻法、电子束光刻法等)、自对准沉积和蚀刻技术、各向异性沉积和蚀刻工艺、自组装掩模形成(例如，形成疏水-亲水共聚物的层)等。
从而，应理解，本文所述的原理和设计特征部的一些可扩大规模至更大的装置和系统，包括采用达到毫米或甚至厘米规模的通道截面的装置和系统。因此，在将一些装置和系统描述为“微流体的”时，该描述意图在某些实施方式中等同地应用于一些更大规模的装置。
提及微流体“装置”时，一般意在代表单一的实体，其中一个或多个通道、储器、测站等共有连续基质，其可以是或不是单片的。微流体装置的方面包括具有如本文所述的尺寸的一个或多个流体流路径(例如，通道)的存在。微流体“系统”可包括一个或多个微流体装置和相关的流体连接、导电连接、控制/逻辑特征部等。
例如，本发明的系统可包括一个或多个离散实体打印机，例如，一个或多个液滴打印机，和/或基质或其部分(例如，基质表面)，用于接收例如通过离散实体打印机(例如，液滴打印机)的递送孔口沉积在其上的一个或多个离散实体(例如，液滴)。系统还可包括一个或多个以下部件：(a)温度控制模块，用于控制主题装置和/或其中的离散实体的一个或多个部分的温度，并且其操作性地连接至离散实体打印机，例如，液滴打印机，(b)检测器具，即，检测仪，例如，光学成像器，其操作性地连接至离散实体打印机，例如，液滴打印机，(c)孵育器，例如，细胞孵育器，其操作性地连接至离散实体打印机，例如，液滴打印机，和(d)测序仪，其操作性地连接至离散实体打印机，例如，液滴打印机。主题系统还可包括一个或多个传送器，其经设置以移动(例如，传送)基质从第一离散实体(例如，液滴)，接收位置至(a)-(d)中的一个或多个。
主题装置和系统包括用于分选离散实体(例如，液滴)的一个或多个进入一个或多个流道的分选器。所述分选器可，基于离散实体的一个或多个特点分选并分配离散实体(例如，液滴)，包括组成、尺寸、形状、浮力或其它特点。
装置的方面还包括一个或多个检测器具，即，检测仪，例如，光学成像器，其经设置以用于检测一个或多个离散实体(例如，液滴)，或其一个或多个特点(包括它们的组成)的存在。在一些实施方式中，检测器具经设置以识别一个或多个流道中的一个或多个离散实体(例如，离散实体)的一种或多种组分。
在多种实施方式中，本发明的微流体装置提供流体介质的连续流。流动通过流体微流体中的通道的装置显示许多独特性质。通常，无量纲雷诺数极低，这导致流动总是保持层状。此外，在该流态中，两股流体接合将不易混合，并且单独扩散可驱动两种化合物的混合。
此外，在一些实施方式中，主题装置包括一个或多个温度和/或压强控制模块。所述模块可以能够调节装置的一个或多个流道中的载流的温度和/或压强。更具体地，温度控制模块可以是一个或多个热循环仪。
现将描述适用于本发明的不同特征部和微流体装置组分的示例。
基质
根据本发明，用于微流体装置和/或系统的基质是这样的支持物：其中提供流体运输必需的元件。基质的基础结构可以是单片的、叠片的或在其它情况中被分成部分的。基质可包括一个或多个流道，例如作为用于分子文库和/或试剂的导管的微通道。它们还可包括输入端口、输出端口，和/或特征部，以协助控流。
在某些实施方式中，基质选择可取决于装置的应用和设计。可选择基质材料的与多种操作条件的相容性。用于给定材料的微制造工艺中的限制还有关于选择合适的基质的考虑。可用于本发明的有用的基质材料包括，例如，玻璃、聚合物、硅、金属、陶瓷和/或其组合。
在一些实施方式中，主题装置包括一种或多种聚合物。对于微流体装置，聚合物是有用的材料，因为它们有利于成本有效和高体积生产。聚合物，包括根据本发明使用的聚合物，可根据它们的模塑性能分成三种类别：热塑性聚合物、弹性体聚合物和硬质塑性聚合物。热塑性聚合物可在玻璃化转变温度上模制成各种形状，并且将在冷却低于玻璃化转变温度之后保留这些形状。弹性体聚合物可在施加外部力之后被拉伸，但将在该外部力被移去时回复到原始状态。弹性体在到达它们的分解温度之前不熔化。硬质塑性聚合物被浇铸成它们的最终形状，因为它们在温度达到它们的分解温度之前稍有软化。
可用于微制造的本发明的装置的聚合物包括：聚酰胺(PA)、聚丁对苯二甲酸酯(PBT)、聚碳酸酯(PC)、聚乙烯(PE)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲醛(POM)、聚丙烯(PP)、聚苯醚(PPE)、聚苯乙烯(PS)和聚砜(PSU)。聚合物的化学和物理性质可限制它们在微流体装置中的应用。具体地与玻璃做比较，对化学品的较低抗性、老化、机械稳定性，和UV稳定性可能会限制聚合物在某些应用中的应用。
玻璃，其也可用作基质材料，在某些操作条件下具有特定优点。因为玻璃在化学上对于大多数液体和气体呈惰性，其特别适于采用趋于溶解塑料的某些溶剂的应用。此外，其透明性质使玻璃特别有用于光学或UV检测。
表面处理和被覆
表面修饰可用于控制微流体装置的功能结构(例如，流动控制)，并且可根据本发明施加。例如，其可用于保持流体物质吸附至通道壁或使抗体贴附至表面，用于生物组分检测。
聚合物装置尤其趋于疏水，因此，通道的加载可能是困难的。聚合物表面的疏水性质还可造成难以控制电渗流(EOF)。用于被覆本发明的聚合物表面的一项技术是将聚电解质多层(PEM)施加至通道表面。PEM涉及相继用阳性和阴性聚电解质交替填充通道，允许多层以形成静电键。尽管所述层通常不键合至通道表面，它们可完全被覆通道，甚至在长期储存之后也是如此。用于在本发明的聚合物表面上施加亲水层的另一技术涉及聚合物向所述通道表面的UV接枝。第一接枝位点，通过将表面暴露至UV辐照同时将装置暴露至单体溶液来在表面处产生自由基。单体反应以形成共价键合在反应位点处的聚合物。
在一些实施方式中，本发明的玻璃通道，一般具有高水平的表面电荷，由此使蛋白质吸附并可能妨碍分离过程。在一些情况中，本文包括施加聚二甲基硅氧烷(PDMS)和/或表面活性剂覆层至玻璃通道。可用于阻止表面吸附的其它聚合物包括聚丙烯酰胺、乙二醇基团、聚硅氧烷、丙三醇缩水甘油醚氧丙基(glyceroglycidoxypropyl)，聚(乙二醇)和羟乙基化的聚(乙撑亚胺)。此外，主题电渗装置可包括带电荷的覆层，通过装置内部的操作条件(例如pH)，其在量级上是可调节的。还可基于覆层选择流的方向，因为覆层可以是带正电或带负电的。
根据本发明还可施加专用的覆层以将某些物质固定在通道表面上——该过程称为“使表面功能化”。例如，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)表面可被覆有胺，以促进多种官能团或靶标的连接。或者，PMMA表面通过氧等离子体处理工艺而具有亲水性。
微流体元件
本发明的微流体系统和装置可包含一个或多个流道，例如微通道、阀、泵、反应器、混合器和/或其它组分。这些组分中的一些及它们的一般结构和尺寸在下文中讨论。
可使用不同类型的阀以用于本发明的微流体装置中的流控。这些包括，但不限于被动阀和止回阀(膜、瓣、双瓣体、泄漏体等)。通过这些阀的流速取决于阀的不同物理特征部，例如表面积、流道尺寸、阀材料等。阀还与可在微流体装置的设计过程中纳入考虑的操作和处理优点/缺点相关联。
主题装置的实施方式包括一个或多个微泵。微泵，与其它微流体组件一同，经历操作约束条件。泵设计中的典型考虑方面包括气泡处理、阻塞，和持久性。可包括在主题装置中的微泵包括但不限于电当量泵、定动(fixed-stroke)微移位、蠕动微膜和/或整合有止回阀的泵。
大型装置依赖于湍流力(例如振荡和搅拌以混合试剂)。比较而言，所述湍流力在微装置(例如本发明所述那些)中不是实践可行的，不同的是，微流体装置中的混合一般通过扩散实现。因为通过扩散的混合可能是缓慢并且低效，微结构(例如本文主题所采用的那些)通常经设计以增强混合工艺。这些结构以这样的方式操纵流体：增加流体区域之间的界面间表面积，由此加速扩散。在某些实施方式中，采用微流体混合器。在整合有混合器的一些情况中，所述混合器可提供在本发明的微流体分离装置和/或分选器上游。
在一些实施方式中，本发明的装置和系统包括微混合器。微混合器可分成两种一般类别：主动混合器和被动混合器。主动混合器通过对于流动区域施加主动控制来工作(例如不同的压强梯度，电荷等)。被动混合器不需要输入能量并且仅利用“流体动态”(例如压强)来以恒定的速率驱动流体流。被动混合器的一个示例涉及将两个流动流堆叠在借由板彼此分离的顶部。一旦撤去分离板，流动流彼此接触。两种液体的堆叠增加接触面积并减小扩散长度，由此增强扩散过程。如果需要热控制，则可将混合和反应装置连接至热传递系统。如同大型热交换器那样，微型热交换可具有平行流、相对流，或横向流流动方案。微流体装置可具有约10μm-约10cm的通道宽度和深度。一个通道结构包括长的主分离通道，而三个较短“分支”侧通道终止于缓冲液、样品或废液储器中。分离通道可以是若干厘米长，并且三个侧通道通常仅数毫米长。当然，微流体装置的实际长度、截面面积、形状、支路设计取决于应用，以及其它设计考虑，例如通量(其取决于流阻)、速度概况、停留时间等。
本文所述的微流体装置可包括一个或多个电场生成器，以进行本文所述的方法的某些步骤，包括但不限于，皮注射、液滴聚结、选择性液滴融合，和液滴分选。在某些实施方式中，电场采用金属电极产生。在具体实施方式中，电场采用液体电极产生。在某些实施方式中，液体电极包括填充有导电液体(例如盐水或缓冲液)并且位于其中需要电场的微流体装置中的位置处的液体电极通道。在具体实施方式中，液体电极采用电源供应器或高压放大器供电。在一些实施方式中，液体电极通道包括入口，从而可将导电液体添加至该液体电极通道。可将所述导电液体添加至所述液体电极通道，例如，通过将填充有该液体的管连接至所述入口并施加压强。在具体实施方式中，液体电极通道还包括出口端口，供于从所述通道释放导电液体。在具体实施方式中，液体电极用于本文所述的微流体装置的皮注射、液滴聚结、选择性液滴融合和/或液滴分选方面。液体电极可用于，例如，待注射通过施加的电场的材料不带电的情况中。
在某些实施方式中，微流体装置的一个或多个微通道(例如，输入微通道、配对微通道、皮注射微通道，和/或一个或多个这些通道上游或下游的流道)的宽度是100微米或更小，例如，90微米或更小、80微米或更小、70微米或更小、60微米或更小、50微米或更小、例如、45微米或更小、40微米或更小、39微米或更小、38微米或更小、37微米或更小、36微米或更小、35微米或更小、34微米或更小、33微米或更小、32微米或更小、31微米或更小、30微米或更小、29微米或更小、28微米或更小、27微米或更小、26微米或更小、25微米或更小、20微米或更小、15微米或更小，或10微米或更小。在一些实施方式中，一个或多个上述微通道的宽度是约10微米-约15微米、约15微米-约20微米、约20微米-约25微米、约25微米-约30微米、约30微米-约35微米、约35微米-约40微米、约40微米-约45微米、或约45微米-约50微米、约50微米-约60微米、约60微米-约70微米、约70微米-约80微米、约80微米-约90微米，或约90微米-约100微米。
关于可与本文公开的方法和装置联用的不同微通道结构和特征部的其它描述提供于PCT公开号WO 2014/028378，其公开内容通过引用其全文的方式纳入本文并用于所有目的。
制造方法
根据本文公开的实施方式，微制造工艺根据用于基质的材料类型和/或所需生成体积而不同。对于小体积生成或原型模式，制造技术包括LIGA、粉末爆炸(powderblasting)、激光器烧蚀、机械加工、电火花加工、光造型等。用于大批生产微流体装置的技术可采用平版印刷或基于模板的复制工艺。用于从硅/玻璃制造基质的平版印刷工艺包括湿法和干法蚀刻技术，其常用于制造半导体装置。注射模塑和热模压通常用于大批生产塑性基质。
玻璃，硅和其它“硬”材料(平板印刷、蚀刻、沉积)
根据本文公开主题的实施方式，平板印刷、蚀刻和/或沉积技术的组合可用于用玻璃、硅和其它“硬”材料制造微管道和微腔。基于上述技术的技术可应用于0.1–500微米规模的装置的制造。
基于半导体制造工艺的微制造技术一般在洁净室中进行。洁净室的质量通过粒子数量<4μm(尺寸，以立方英寸计)来分类。用于MEMS微制造的典型的洁净室类别可以是1000-10000。
在某些实施方式中，光刻法可用于微制造。在光刻法中，已沉积在基质上的光刻胶通过光学掩模暴露至光源。常规光刻胶方法允许至多10-40μm的结构高度。如果需要较高结构，可采用较厚的光刻胶例如SU-8，或聚酰亚胺，其导致至多1mm的高度。
在将掩模上的图案转移至光刻胶被覆的基质之后，随后采用湿法或干法工艺刻蚀基质。在湿法蚀刻中，基质——不被掩模保护的区域——经历液相中的化学攻击。用于蚀刻工艺的液体试剂取决于蚀刻是各向同性还是各向异性。各向同性蚀刻一般采用酸以在玻璃或硅中形成三维结构，例如球状空穴。各向异性蚀刻采用高度碱性溶剂形成浅表面例如孔和隧道。在硅上进行湿法各向异性蚀刻产生倾斜通道概况。
干法蚀刻涉及用气或等离子体相中的离子攻击基质。干法蚀刻技术可用于产生矩形通道截面和任意通道路径。可采用的不同类型的干法蚀刻包括物理、化学、物理-化学(例如，RIE)和采用抑制剂的物理-化学法。物理蚀刻利用加速通过电场的离子以攻击基质的表面以“蚀刻”所述结构。化学蚀刻可采用电场以将化学物质迁移至所述基质的表面。化学物质随后与基质的表面反应以产生空洞和挥发性物质。
在某些实施方式中，微制造中采用沉积。沉积技术可用于产生金属、绝缘体、半导体、聚合物、蛋白质和其它有机物质的层。大多数沉积技术属于如下两个主要类别之一：物理汽相淀积(PVD)和化学汽相淀积(CVD)。在PVD的一个方式中，基质目标与持气(holdinggas)(其可通过例如蒸发产生)接触。气体中的某些物质吸附至目标表面，形成组成沉积物的层。在常用于微电子制造工业的另一方式中，包含带沉积的材料的目标用氩离子束或其它合适能量来源喷溅。喷溅的材料随后沉积在微流体装置的表面。在CVD中，与目标接触的物质与表面反应，形成化学键合至目标的组分。其它沉积技术包括：旋转涂布、等离子体喷涂、等离子体聚合、浸涂、铸造和LB膜沉积。在等离子体喷涂中，包含直径至多100μm的粒子的精细粉末悬浮于载体气体中。使包含所述粒子的混合物加速通过等离子体射流并加热。熔化的粒子喷溅在基质上并冻结以形成致密覆层。等离子体聚合从包含有机蒸汽的等离子体产生聚合物薄膜(例如PMMA)。
一旦微通道、微腔和其它特征部已被蚀刻进入玻璃或硅基质，蚀刻的特征部通常是密封的以确保微流体装置是“不透水”的。密封时，可对变得彼此接触的全部表面上施加粘附。密封工艺可涉及融合技术，例如经开发用于玻璃-硅、玻璃-玻璃或硅-硅之间的键合的那些。
阳极键合可用于键合玻璃至硅。在玻璃和硅之间施加电压，并且使系统升温以诱导表面的密封。电场和升高的温度诱导玻璃中的钠离子迁移至玻璃-硅界面。玻璃-硅界面分钟的钠离子与硅表面具有高度反应性，形成表面之间的固体化学键。所用玻璃类型可具有与硅(例如Pyrex Corning 7740)接近的热膨胀系数。
融合键合可用于玻璃-玻璃或硅-硅密封。基质首先受力并通过施加高接触力一起对齐。一旦接触，原子吸引力(主要是范德华力)将基质保持在一起，从而它们可被置入炉子并在高温下煅烧。根据材料，所用温度范围在约600至1100℃。
聚合物/塑料
多种技术可用于在主题实施方式中微型机械制造塑性基质。这些包括激光器烧蚀、立体平版印刷、氧等离子体蚀刻、粒子喷射烧蚀和微电蚀。这些技术中的一些也可用于使其它材料(玻璃、硅、陶瓷等)成形。
为了产生多重拷贝的微流体装置，采用复制技术。所述技术涉及包含待复制的图案的第一制造模板或模具镶件。模板随后用于通过聚合物复制工艺大批生产聚合物基质。
在复制工艺中，包含在模具中的模板图案被复制到聚合物结构上。在某些实施方式中，聚合物和固化剂混合物在高温下被倾倒至模具上。在冷却混合物之后，聚合物包含模具图案，随后从模具被移去。或者，可将塑料注入包含模具镶件的结构。在微注射中，被加热成液态的塑料被注入模具。分离和冷却后，塑料保留模具的形状。
PDMS(聚二甲基硅氧烷)，硅基有机聚合物，可用于模制工艺以形成微流体结构。因为其弹性特性，PDMS适于约5μm-500μm的微通道。PDMS的特定性质使其适于微流体目的。所述性质包括：
1)其是光学透明的，这允许流动的可视化。
2)PDMS，当与合适量的成网剂混合时，具有促进保持微流体连接“不透水”的弹性体质量。
3)采用膜的阀和泵可用PDMS制成，因为其具有弹性。
4)未处理的PDMS是疏水的，并且在表面通过氧等离子体氧化之后或在强碱中浸没之后变得暂时亲水；只要那些表面本身暴露至氧等离子体，氧化的PDMS通过其本身贴附至玻璃、硅或聚乙烯。
5)PDMS可透过气体。用液体填充这些通道是便利的，甚至在管道中存在气泡的情况下也是如此，因为气泡会受力移出材料。此外，PDMS还可透过非极性-有机溶剂。
微注射可用于形成用于广泛范围的微流体设计的塑性基质。在该工艺中，液体塑性材料首先在高于该塑料的玻璃化转变温度的温度下，于真空和压强下被注入模具。该塑料随后被冷却低于玻璃化转变温度。在移去模具之后，所得塑料结构具有阴性的模具图案。
而另一复制技术是热模压，其中聚合物基质和模板被加热至高于聚合物的玻璃化转变温度，Tg(对于PMMA或PC而言约为100–180℃)。随后用预设压力将压印模板按压至基质。该系统随后经冷却至低于Tg，并且随后分离模具和基质。
通常，在从模具工具分离之后，特别是在微结构包含高纵横比和纵向壁时，聚合物经历最高物理力。为了避免破坏聚合物微结构，可考虑基质和模具工具的材料性质。这些性质包括：侧壁粗糙度、侧壁角、压印模板和基质之间的化学界面，和温度系数。压印工具的高侧壁粗糙度可破坏聚合物微结构，因为粗糙在分离过程中会增加工具与结构之间的摩擦力。如果摩擦力大于聚合物的局部抗张强度，则有可能毁坏该微结构。工具和基质之间的摩擦在具有纵向壁的微结构中可能是重要的。模板和基质之间的化学界面也可具有意义。因为压印工艺使系统经历升高的温度，可在模板-基质界面中形成化学键。这些界面间的键可能会干扰分离过程。工具和基质的热膨胀系数差异可能会产生额外的摩擦力。
可采用不同技术以形成模具、压印模板，和包含用于通过上述复制工艺复制塑性结构的图案的其它模板。所述技术的示例包括LIGA(如下所述)、烧蚀技术，和不同其它机械加工技术。类似技术还可用于以小体积产生掩模、原型模式和微流体结构。用于模具工具的材料包括金属、金属合金、硅和其它硬材料。
可采用激光器烧蚀以直接在基质上或通过利用掩模形成微结构。该技术采用精确导引激光，通常具有红外光和紫外光之间的波长。激光烧蚀可在玻璃和金属基质上，以及在聚合物基质上进行。激光烧蚀可通过相对于固定的激光束移动基质表面，或相对于固定的基质移动该束来进行。不同微-孔、通道和高纵横比(high aspect)结构可采用激光烧蚀来制造。
某些材料，例如不锈钢，制造耐久的模具镶件并且可经微型机械制造以形成小至10-μm范围的结构。用于微制造的现有不同其它微型机械制造技术包括μ-电镀电火花加工(μ-EDM)、μ-碾磨法、聚焦离子束研磨法。μ-EDM允许在导电材料中制造3维结构。在μ-EDM中，材料通过电极(阴极工具)和工件(阳极)制剂之间产生的高频放电而被移去。工件和工具均浸入介电质流体中。该技术产生相对粗糙的表面但提供材料和几何构造方面的可行性。
可利用电镀来从，例如，镍合金，制造复制模具工具/模板。该加工以光刻法步骤开始，其中光刻胶用于确定的电镀用结构。待电镀的区域不含抗蚀剂。具有具有高纵横比和低粗糙度要求的结构，LIGA可用于产生电镀形式。LIGA是平版印刷(平板印刷)、电铸成型(电镀)、压模(模塑)的德语缩写。在LIGA的一个方式中，厚PMMA层暴露至来自同步加速器来源的x射线。通过LIGA产生的表面具有低粗糙度(约10nm RMS)，并且所用镍工具对于大多数聚合物具有良好的表面化学。
如同玻璃和硅装置，聚合物微流体装置必须在它们行使功能之前闭合。微流体装置的键合过程中的常见问题包括通道阻塞和通道的物理参数变化。叠片是用于密封塑性微流体装置的一种方法。在一个叠片过程中，被覆有熔化粘合剂层(通常5μm–10μm)的PET箔(约30μm)用加热辊轧制至微结构上。通过该过程，盖箔密封至通道板上。若干研究团队已报道通过在界面处聚合的键合，由此结构被加热并且力诶施加至接近通道的相对侧。但施加过度的力可能会破坏微结构。对于塑性-塑性和塑性-玻璃界面，现有可逆和不可逆键合技术。可逆密封的一种方法涉及首先用甲醇彻底漂洗PDMS基质和玻璃板(或第二块PDMS)，然后使表面彼此接触，随后干燥。微结构随后在炉中于65℃干燥10分钟。该过程不需要洁净室。不可逆密封通过如下方式进行：首先用甲醇彻底漂洗块状物，随后用氮气流分开干燥它们。两块随后被置于空气等离子清洗器中，并在大功率氧化约45秒。随后使基质彼此接触，并且自发地形成不可逆的密封。
其它可用技术包括激光和超声焊接。在激光焊接中，聚合物通过激光产生的热接合在一起。该方法已被用于微泵制造。超声焊接是可用于一些应用的另一键合技术。
本文所述的一种核酸扩增技术是聚合酶链式反应(PCR)。然而，在某些实施方式中，可采用非PCR扩增技术例如不同等温核酸扩增技术；例如，实时链替代扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)和多重替代扩增(MDA)。
关于PCR扩增模块，有必要向所述模块提供至少用于扩增核酸的构建模块(例如，足够浓度的四种核苷酸)、引物、聚合酶(例如，Taq)，和合适的温度控制程序)。聚合酶和核苷酸构建模块可提供于通过外部导入扩增模块提供或来自上游来源的缓冲液溶液中。在某些实施方式中，用于分选模块的缓冲液流包含用于核酸扩增的全部原材料中的一些。尤其对于PCR，反应混合物的精确的温度控制是极重要的，以实现高反应效率。芯片上热控制的一种方法是焦耳加热，其中电极用于加热确定的位置处的模块内部的流体。流体传导性可用作用于功率控制的温度反馈。
在某些方面中，可使包含PCR混合物的离散实体(例如，微液滴)流动通过通道，所述通道在有效于PCR的条件下孵育离散实体。使离散实体流动通过通道可涉及蛇行通过(snake over)保持在有效于PCR的温度的不同温度区的通道。例如，所述通道可循环通过两个或更多个温度区，其中至少一个区保持在约65℃且至少一个区保持在约95℃。随着离散实体移动通过所述区，它们的温度按PCR所需循环。区的精确数量，和各区的相应温度，可经本领域技术人员容易地确定以实现所需PCR扩增。
本发明的示例性非限制性方面
本发明的主题的上述方面，包括实施方式，单独或联合一个或多个其它方面或实施方式，是有利的。不意在限制前述内容，将本发明的某些非限制性方面编号1-252，并提供如下。如本领域技术人员在阅读本发明之后显见的那样，各个单独编号的方面可被采用或与任何前述或下述单独编号的方面联用。这意在提供对于全部所述方面的组合的支持，并且不限于如下明确提供的方面的组合。
1.一种将离散实体递送至基质的方法，所述方法包括：
使多个离散实体于载流中流动通过微流体装置，其中所述离散实体不溶于所述载流和/或不与所述载流混溶；
通过递送孔口，将所述载流和所述多个离散实体中的一个或多个导向至所述基质；和
使所述多个离散实体中的一个或多个附着至所述基质。
2.如1所述的方法，其中所述多个离散实体中的一个或多个通过力附着至所述基质，其中所述力选自重力、电动力、磁力及其组合。
3.如2所述的方法，其包括将附着的实体在受控的环境条件下储存一段储存期，其中所述力在所述储存期期间保持。
4.如3所述的方法，其中所述受控的环境条件包括恒定的温度和/或压强。
5.如2-4中任一项所述的方法，其中所述力是电动力。
6.如5所述的方法，其中所述电动力是介电电泳力。
7.如1-6中任一项所述的方法，其中所述离散实体是液滴。
8.如7所述的方法，其中所述液滴通过润湿附着至所述基质。
9.如7所述的方法，其中所述液滴包括水性流体，其与所述载流不混溶。
10.如9所述的方法，其中所述基质在第一表面上包括流体层，其可与所述载流混溶但不与所述水性流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的所述流体层之后，所述液滴附着至所述基质的第一表面。
11.如7所述的方法，其中所述载流是水性流体并且所述液滴包括与所述载流不混溶的流体。
12.如11所述的方法，其中所述基质在第一表面上包括水性流体层，其可与所述载流混溶但不与所述液滴包含的流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的水性流体层之后，所述液滴附着至所述基质的第一表面。
13.如1所述的方法，其中所述离散实体通过界面张力附着至所述基质。
14.如1-13中任一项所述的方法，其中所述离散实体的尺寸是约1-1000μm。
15.如14所述的方法，其中所述离散实体的直径是约1-1000μm。
16.如1-13中任一项所述的方法，其中所述离散实体的体积是约1毫微微升-约1000纳升。
17.如1-16中任一项所述的方法，其中所述微流体装置包括分选器，并且其中，所述方法包括通过所述分选器分选待通过所述递送孔口从所述多个离散实体递送至所述基质的所述多个离散实体中的一个或多个。
18.如17所述的方法，其中所述分选器包括具有有间隙的分隔物的流道，其包括延伸小于所述流道的整个高度的隔板。
19.如17所述的方法，其中所述多个离散实体在分选之前经光学扫描。
20.如19所述的方法，其中所述分选器包括光纤，其经设置以将激发能施加至所述多个离散实体中的一个或多个。
21.如20所述的方法，其中所述分选器包括第二光纤，其经设置以收集通过向所述多个离散实体中的一个或多个施加激发能产生的信号。
22.如20所述的方法，其中所述光纤经设置以将激发能施加至所述多个离散实体中的一个或多个，并且收集通过向所述多个离散实体中的一个或多个施加激发能所产生的信号。
23.如19所述的方法，其中所述分选基于光学扫描得出的结果。
24.如17所述的方法，其中所述分选器是主动分选器。
25.如17所述的方法，其中所述分选器是被动分选器。
26.如24所述的方法，其中所述分选包括通过介电电泳的分选。
27.如24所述的方法，其中所述分选器包括一个或多个微流体阀，并且其中，所述分选包括通过活化一个或多个微流体阀的分选。
28.如1-27中任一项所述的方法，其中所述离散实体是液滴，所述微流体装置包括可选择性地活化的液滴制造器，其从流体流形成液滴，并且其中，所述方法包括通过选择性活化液滴制造器来形成所述多个离散实体中的一个或多个。
29.如1-28中任一项所述的方法，其中所述多个离散实体包括在组成上不同的离散实体。
30.如1-29中任一项所述的方法，其中所述微流体装置整合有自动化的系统，其相对于基质选择性地定位所述递送孔口，并且其中，所述方法包括通过自动化的系统，相对于基质，选择性地定位递送孔口，以将所述多个离散实体中的一个或多个选择性地递送至所述基质上或附近的一个或多个位置。
31.如1-29中任一项所述的方法，其中所述微流体装置整合有自动化的系统，其相对于递送孔口选择性地定位所述基质，并且其中，所述方法包括通过自动化的系统，相对于递送孔口，选择性地定位递送基质，以将所述多个离散实体中的一个或多个选择性地递送至所述基质上或附近的一个或多个位置。
32.如30或31所述的方法，其中所述方法包括，将所述多个离散实体的第一成员递送至所述基质上或附近的第一位置，并将所述多个离散实体的第二成员递送至所述基质上或附近的第二位置。
33.如32所述的方法，其中所述第一和第二位置是相同的。
34.如1-33中任一项所述的方法，其中在向所述基质递送之前和/或之后，在所述离散实体中的一个或多个中进行一个或多个生物学测定。
35.如1-34中任一项所述的方法，其中，在向所述基质递送之前和/或之后，控制所述离散实体中的一个或多个的温度。
36.如35所述的方法，其中，在向所述基质递送之前和/或之后，对所述离散实体中的一个或多个进行热循环。
37.如17-36中任一项所述的方法，其中，回收未经分选用于通过递送孔口递送至所述基质的所述多个离散实体的成员。
38.如37所述的方法，其中，回收的所述多个离散实体的成员被再循环，从而，1的方法采用所述多个离散实体的回收的成员重复进行。
39.如38所述的方法，其中，回收的所述多个离散实体的成员在所述方法的进行过程中被持续再循环。
40.如1-39中任一项所述的方法，其中，所述多个离散实体中的一个或多个包括细胞。
41.如40所述的方法，其中所述多个离散实体的各成员包括不多于一个细胞。
42.如1-39中任一项所述的方法，其中，所述多个离散实体中的一个或多个包括核酸。
43.如1-42中任一项所述的方法，其中所述方法包括，将一种或多种试剂包封进入或纳入所述多个离散实体。
44.如43所述的方法，其中所述一种或多种试剂包括扩增试剂。
45.如44所述的方法，其中所述扩增试剂包括聚合酶链式反应(PCR)试剂。
46.一种打印一个或多个细胞层的方法，所述方法包括：
将细胞包封在液滴中，所述液滴包含水性流体，以提供含有细胞的液滴；
使包括含有细胞的液滴的多个液滴于载流中流动通过微流体装置，其中所述载流不与所述水性流体混溶；
通过递送孔口，将所述载流和多个含有细胞的液滴导向至基质；和
使多个所述含有细胞的液滴附着至所述基质以提供含有细胞的液滴的第一层，其中所述基质在第一表面上包括流体层，其可与所述载流混溶但不与所述水性流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的流体层之后，多个所述含有细胞的液滴附着至所述基质的第一表面。
47.如46所述的方法，其中所述微流体装置包括分选器，并且其中，所述方法包括通过所述分选器分选待通过递送孔口从含有细胞的液滴递送至所述基质的所述多个含有细胞的液滴。
48.如47所述的方法，其中所述分选器包括具有有间隙的分隔物的流道，其包括延伸小于所述流道的整个高度的隔板。
49.如46-48中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
将一种或多种试剂包封进入或纳入液滴以提供包含试剂的液滴；
使包括所述包含试剂的液滴的多个液滴在所述载流中流动通过所述微流体装置；
和，通过所述递送孔口，将所述载流和多个包含试剂的液滴导向至所述基质。
50.如49所述的方法，其中所述包含试剂的液滴和含有细胞的液滴是相同的。
51.如49所述的方法，其中含有细胞的液滴和包含试剂的液滴沉积在所述基质上的相同层中。
52.如49-51中任一项所述的方法，其中所述一种或多种试剂包括促进细胞生长的材料。
53.如52所述的方法，其中所述促进细胞生长的材料包括细胞培养基组分。
54.如52所述的方法，其中所述促进细胞生长的材料包括细胞培养基质。
55.如46-54中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
通过所述递送孔口，将所述载流和第二多个含有细胞的液滴导向至所述基质；和
将含有细胞的液滴的第二层沉积在含有细胞的液滴的第一层上，由此提供层化的结构。
56.如46-54中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
将包含试剂的液滴的层沉积在含有细胞的液滴的第一层上，由此提供层化的结构。
57.一种打印和检测一个或多个细胞的方法，所述方法包括：
将细胞包封在液滴中，所述液滴包含水性流体，以提供含有细胞的液滴；
使包括含有细胞的液滴的多个液滴于载流中流动通过微流体装置，其中所述载流不与所述水性流体混溶；
通过递送孔口，将所述载流和多个含有细胞的液滴导向至基质；
使多个所述含有细胞的液滴附着至所述基质，其中所述基质在第一表面上包括流体层，其可与所述载流混溶但不与所述水性流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的流体层之后，多个所述含有细胞的液滴附着至所述基质的第一表面；和
检测附着的含有细胞的液滴中的一个或多个细胞、附着的含有细胞的液滴中的一个或多个细胞的组分，或附着的含有细胞的液滴中的一个或多个细胞的产物。
58.如57所述的方法，其中所述检测在多个时间点进行。
59.如57所述的方法，其中所述方法包括在一段时间内连续检测附着的含有细胞的液滴中的一个或多个细胞，附着的含有细胞的液滴中的一个或多个细胞的组分，或附着的含有细胞的液滴中的一个或多个细胞的产物。
60.如57-59中任一项所述的方法，其包括从附着的含有细胞的液滴回收附着的含有细胞的液滴中的一个或多个细胞，附着的含有细胞的液滴中的一个或多个细胞的组分，或附着的含有细胞的液滴中的一个或多个细胞的产物。
61.如60所述的方法，其包括从附着的含有细胞的液滴中的一个或多个细胞回收DNA。
62.如61所述的方法，其包括对所述DNA测序。
63.一种打印三维结构的方法，所述方法包括：
使离散实体在载流中流动通过微流体装置，其中所述离散实体不溶于所述载流和/或不与所述载流混溶；和
通过递送孔口，将所述载流和第一组(first plurality of)离散实体导向至基质以在其上提供第一层；
通过所述递送孔口，将所述载流和第二组(second plurality of)离散实体导向至第一层以在其上提供第二层；和
一个或多个其它导向步骤，其中通过所述递送孔口，将多个离散实体导向至紧接的上一层以在其上提供后续的层，其中提供多层、三维结构。
64.如63所述的方法，其中所述离散实体是亲水的并且所述载流是疏水的。
65.如64所述的方法，其中所述离散实体是液滴。
66.如65所述的方法，其中所述液滴包括水性流体。
67.如66所述的方法，其中所述基质在第一表面上包括流体层，其可与所述载流混溶但不与所述水性流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的所述流体层之后，所述液滴附着至所述基质的第一表面。
68.如63所述的方法，其中所述离散实体是疏水的并且所述载流是亲水的。
69.如68所述的方法，其中所述离散实体是液滴。
70.如69所述的方法，其中所述载流是水性流体并且所述液滴包括与所述载流不混溶的流体。
71.如70所述的方法，其中所述基质在第一表面上包括水性流体层，其可与所述载流混溶但不与所述液滴包含的流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的水性流体层之后，所述液滴附着至所述基质的第一表面。
72.如64或68所述的方法，其中所述离散实体由固体材料组成。
73.如64或68所述的方法，其中所述离散实体由凝胶材料组成。
74.如64或68所述的方法，其包括起始使所述离散实体或所述载流固化的反应。
75.如74所述的方法，其中所述反应是光聚合反应。
76.一种从递送孔口递送液滴的方法，所述方法包括：
使多个液滴在载流中流动通过微流体装置，其中所述微流体装置包括分选器；
检测所述多个液滴中的一个或多个以提供一个或多个经检测的液滴；
通过所述分选器，从所述多个液滴分选所述一个或多个经检测的液滴；
将所述载流和所述一个或多个经检测的液滴导向通过所述递送孔口。
77.如76所述的方法，其包括使所述一个或多个经检测的液滴沉积在基质上。
78.如76或77所述的方法，其中所述液滴包括水性流体，其与所述载流不混溶。
79.如78所述的方法，其中所述基质在第一表面上包括流体层，其可与所述载流混溶但不与所述水性流体混溶，并且其中，将所述一个或多个经检测的液滴引入所述基质的第一表面上的流体层。
80.如76或77所述的方法，其中所述载流是水性流体并且所述液滴包括与所述载流不混溶的流体。
81.如80所述的方法，其中所述基质在第一表面上包括水性流体层，其可与所述载流混溶但不与所述液滴中所含的水性流体混溶，并且其中，将所述一个或多个经检测的液滴引入所述基质的第一表面上的流体层。
82.如76-81中任一项所述的方法，其中所述分选器包括具有有间隙的分隔物的流道，其包括延伸小于所述流道的整个高度的隔板。
83.一种使液滴附着至基质的方法，所述方法包括：
通过孔口，于第一载流中将液滴从微流体装置递送至基质表面；
使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；和
通过力，使所述液滴附着至所述基质表面。
84.如83所述的方法，其中所述第一和第二载流是相同的。
85.如83所述的方法，其中所述力选自重力、电动力、磁力及其组合。
86.如85所述的方法，其中所述力是磁力。
87.如85所述的方法，其中所述力是电动力。
88.如87所述的方法，其中所述电动力是介电电泳力。
89.如89所述的方法，其中所述基质包括多个通道，其填充有传导性液体或固体材料，和位于所述多个通道和载流之间的绝缘片层，其中所述多个通道是图案化的，以在施加电压之后在所述绝缘片层上方产生电场梯度，并且其中，所述方法包括向所述多个通道中的一个或多个施加足以产生所述电场梯度的电压，其中所述电场梯度产生足以使所述液滴粘附至所述基质表面的介电电泳力。
90.如89所述的方法，其中所述基质包括多个通道，其填充有传导性液体或固体材料，和位于所述多个通道和所述载流之间的绝缘片层，其中所述多个通道是图案化的，以产生足以使所述液滴粘附至所述基质表面的介电电泳力。
91.如89所述的方法，其中所述基质和所述液滴具有极性相反的净电荷。
92.如83所述的方法，其中所述基质的可润湿性足以通过润湿力使所述液滴粘附至所述基质。
93.如83所述的方法，其包括改变所述基质的可润湿性，从而足以使所述液滴通过润湿力粘附至所述基质。
94.如89所述的方法，其中所述基质包括多个通道，其填充有传导性液体或固体材料，和位于所述多个通道和所述载流之间的绝缘片层，其中所述多个通道是图案化的，以提供多个电极特征部，并且其中，所述多个电极特征部彼此相对定位，从而在所述基质表面提供位置，所述位置在向所述多个通道中的一个或多个施加电压时能够减少液滴界面能，并且其中，所述位置足以使所述液滴粘附至所述基质表面。
95.如94所述的方法，其中至少一个电极特征部相对于至少一个其它电极特征部定位，从而在所述特征部之间存在间隙，其中所述间隙的距离在所述液滴直径的数量级之内。
96.如95所述的方法，其包括使所述液滴附着至所述间隙附近。
97.如83所述的方法，其中所述方法包括施加外源电磁辐射，其足以使所述液滴粘附至所述基质表面上的特定位置。
98.一种使附着的液滴在基质上移动的方法，所述方法包括：通过孔口，于第一载流中将液滴从微流体装置递送至基质表面；使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；
通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；和
调节所述力，从而使所述液滴从其附着的位置移动至另一个位置和/或施加第二力，其单独或与该经调节的力联合足以使所述液滴从其附着的位置移动至另一个位置。
99.如98所述的方法，其中所述第一和第二载流是相同的。
100.如98或99所述的方法，其中所述基质包括多个通道，其填充有传导性液体或固体材料，和位于所述多个通道和载流之间的绝缘片层，其中所述多个通道是图案化的，以在施加电压之后在所述绝缘片层上方产生电场梯度，并且其中，所述方法包括向所述多个通道中的一个或多个施加足以产生所述电场梯度的电压，其中所述电场梯度产生足以使所述液滴粘附至所述基质表面的介电电泳力。
101.如100所述的方法，其包括调节所述电场，从而将所述液滴从其附着的位置移动至另一个位置。
102.如98所述的方法，其中所述方法包括施加外源电磁辐射，其足以使所述液滴从其附着的位置移动至另一个位置。
103.如98所述的方法，其中所述方法包括引入流体的横向流，其足以使所述液滴从其附着的位置移动至另一个位置。
104.如98所述的方法，其中所述液滴在第二载流中的的浮力经调节以使所述液滴从其附着的位置移动至另一个位置。
105.一种添加试剂至液滴的方法，所述方法包括：
通过孔口，将第一液滴在第一载流中从微流体装置递送至基质表面；
使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；
通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；
将第二液滴递送至与附着至所述基质表面的第一液滴相同的位置或所述基质表面上第一液滴附近的位置；和
使第一液滴与第二液滴聚结从而合并第一液滴和第二液滴的内容物。
106.如105所述的方法，其中所述第一和第二载流是相同的。
107.如105或106的方法，其中多重液滴被递送至与附着至所述基质表面的第一液滴相同的位置或所述基质表面上的第一液滴附近的位置，并且其中，所述多重液滴与第一液滴聚结，从而第一液滴和所述多重液滴的内容物合并。
108.如105-107中任一项所述的方法，其中聚结通过向所述液滴中的一个或多个施加力来触发。
109.如105-107中任一项所述的方法，其中聚结自发地发生。
110.如108所述的方法，其中所述力是电动力。
111.一种添加试剂至液滴的方法，所述方法包括：
通过第一孔口，将液滴在第一载流中从微流体装置递送至基质表面；
使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；
通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；
将与试剂来源流体连接的第二孔口插入所述液滴；和
通过第二孔口，将一种或多种试剂注入所述液滴。
112.如111所述的方法，其中所述第一和第二载流是相同的。
113.一种使液滴附着至基质的方法，所述方法包括：
通过孔口，于第一载流中将液滴从微流体装置递送至基质表面；
使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；
通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；和
回收附着的液滴的全部或部分。
114.如113所述的方法，其中所述第一和第二载流是相同的。
115.如113或114所述的方法，其中所述回收包括调节作用在附着的液滴上的一种或多种力。
116.如113或114所述的方法，其中所述回收包括使附着的液滴与微流体孔口接触，所述微流体孔口与抽吸装置流体连通以从所述基质表面回收附着的液滴的全部或部分。
117.如113或114所述的方法，其中所述回收包括将与抽吸装置流体连通的微流体孔口带至附着的液滴附近，以从所述基质表面回收附着的液滴。
118.如113或114所述的方法，其中所述回收包括，将与抽吸装置流体连通的微流体孔口插入附着的液滴，以回收附着的液滴的内容物的全部或部分。
119.如113或114所述的方法，其中所述回收包括从所述基质表面剪切附着的液滴。
120.如113或114所述的方法，其中所述回收包括增加附着的液滴的浮力，从而作用于附着的液滴上的浮力足以克服使所述液滴附着至所述基质表面的力，由此从所述基质表面释放附着的液滴。
121.如120所述的方法，其中增加附着的液滴的浮力包括增加附着的液滴的体积。
122.如121所述的方法，其中附着的液滴的体积通过将水性流体注入附着的液滴来增加。
123.如113或114所述的方法，其中所述回收包括调节使所述液滴附着至所述基质表面的力，从而所述液滴从所述基质表面释放。
124.如123所述的方法，其中所述调节包括移去所述力。
125.如113或114所述的方法，其中所述液滴包括一个或多个珠。
126.如125所述的方法，其中所述一个或多个珠包括结合试剂，其选择性地结合存在于所述液滴中的一种或多种材料。
127.如125或126所述的方法，其中所述一个或多个珠浮在所述液滴中。
128.如125或126所述的方法，其中所述一个或多个珠选自磁珠和传导性珠。
129.如125-128中任一项所述的方法，其包括定位和/或浓集一个或多个珠于所述液滴的第一区域，留出相对缺乏珠的第二区域。
130.如129所述的方法，其包括从所述液滴选择性地回收来自第一区域的一个或多个珠。
131.如129所述的方法，其包括从所述液滴的第二区域选择性地回收材料。
132.如113-131中任一项所述的方法，包括通过递送孔口，将回收的液滴或所述液滴的回收的部分递送至一个或多个分离的容器。
133.一种处理附着的液滴的方法，所述方法包括：
通过孔口，于第一载流中将液滴从微流体装置递送至基质表面；
使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；
通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；和
调节所述液滴的直接环境，由此调节所述液滴的内容物。
134.如133所述的方法，其中所述第一和第二载流是相同的。
135.如133或134所述的方法，其中所述调节包括调节参数，所述参数选自：所述直接环境的化学组成、所述直接环境的温度、所述直接环境的pH、所述直接环境的压强，和所述直接环境的辐射水平。
136.如133-135中任一项所述的方法，其中所述基质表面是选择性可透过的，所述基质包括位于下方且与选择性可透过的基质表面接触的流体体积，并且所述液滴的直接环境通过调节如下参数经调节：调节所述流体体积的一种或多种化学组成、所述流体体积的温度、所述流体体积的pH、所述流体体积的压强，和所述流体体积的辐射水平。
137.如136所述的方法，其中所述流体体积是流体流。
138.如133-137中任一项所述的方法，其中所述基质包括图案化的电极，其位于所述流体体积下方。
139.如133-138中任一项所述的方法，其包括将附着的液滴在受控的环境条件下储存一段储存期，其中所述力在所述储存期期间保持。
140.如139所述的方法，其中所述受控的环境条件包括恒定的温度和/或压强。
141.如133-140中任一项所述的方法，其包括至少部分固化附着的液滴。
142.如141所述的方法，其包括从所述基质表面移去第二载流。
143.如142所述的方法，其中，在附着的液滴至少部分固化之前，第二载流与附着的液滴的内容物不混溶，并且其中，所述方法包括用可混溶的流体替代被移去的第二载流。
144.如143所述的方法，其包括调节所述可混溶的流体的化学组成，由此调节附着的液滴。
145.一种处理附着的液滴的方法，所述方法包括：
通过孔口，于第一载流中将液滴从微流体装置递送至基质表面；
使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；
通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；
至少部分固化附着的液滴；
从所述基质表面移去第二载流，其中，在附着的液滴至少部分固化之前，第二载流与附着的液滴的内容物不混溶；
用可混溶的流体替代被移去的第二载流；和调节所述可混溶的流体的化学组成，由此调节附着的液滴。
146.如145所述的方法，其中所述第一和第二载流是相同的。
147.一种对附着的液滴中的细胞穿孔的方法，所述方法包括：
通过孔口，于第一载流中将液滴从微流体装置递送至基质表面，其中所述液滴包含细胞；
使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；
通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；和
对所述液滴中的所述细胞穿孔。
148.如147所述的方法，其中所述第一和第二载流是相同的。
149.如147或148所述的方法，其中所述细胞采用电、化学或声学手段穿孔。
150.如147-148中任一项所述的方法，其包括将一个或多个核酸引入穿孔的细胞。
151.如147-150中任一项所述的方法，其中所述穿孔在所述微流体装置中发生。
152.如147-150中任一项所述的方法，其中所述穿孔在通过所述孔口之后且在使所述液滴附着至所述基质表面之前发生。
153.如147-150中任一项所述的方法，其中所述穿孔在所述液滴附着至所述基质表面之后发生。
154.如147-149中任一项所述的方法，其中所述穿孔在所述微流体装置中于递送通过所述孔口之前发生。
155.如154所述的方法，其中所述液滴被递送至所述基质表面的位于所述基质表面上的第二液滴附近，其中所述第二液滴包括核酸，并且其中，所述方法包括将所述液滴与第二液滴合并以使所述核酸与所述穿孔的细胞接触。
156.一种分析基质上的液滴的方法，所述方法包括：
通过孔口，于第一载流中将液滴从微流体装置递送至基质表面；
使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；
通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；和
检测附着的液滴的一种或多种组分。
157.如156所述的方法，其中所述第一和第二载流是相同的。
158.如156或157所述的方法，其中所述检测在多个时间点进行。
159.如156或157所述的方法，其中所述方法包括在一段时间内连续检测附着的液滴的一种或多种组分。
160.如158或159所述的方法，其中所述方法包括检测附着的液滴的一种或多种组分的变化。
161.如156-160中任一项所述的方法，其中所述检测包括光学检测附着的液滴的一种或多种组分。
162.如161所述的方法，其中所述光学检测包括检测附着的液滴的一种或多种组分的吸光度。
163.如161所述的方法，其中所述光学检测包括检测附着的液滴的一种或多种组分的荧光。
164.如156-160中任一项所述的方法，其中所述检测包括通过一种或多种光谱技术检测附着的液滴的一种或多种组分。
165.如164所述的方法，其中所述一种或多种光谱技术选自核磁共振(NMR)光谱、UV光谱，和质谱。
166.如156-160中任一项所述的方法，其中所述方法包括，在固定之前或之后，添加合适的基质辅助激光解吸/电离(MALDI)基质材料至所述液滴，并通过MALDI检测附着的液滴的一种或多种组分。
167.如156-165中任一项所述的方法，其包括回收并分析附着的液滴的全部或部分。
168.一种将离散实体递送至基质的方法，所述方法包括：
使多个第一离散实体在第一载流中流动通过第一微流体装置，其中所述第一离散实体在第一载流中不溶解和/或不混溶，并且其中，所述第一微流体装置包括第一递送孔口；
通过第一递送孔口，将第一载流和所述多个第一离散实体中的一个或多个导向至所述基质；
使多个第二离散实体在第二载流中流动通过第二微流体装置，其中所述第二离散实体在第二载流中不溶解和/或不混溶，并且其中，所述第二微流体装置包括第二递送孔口；
通过第二递送孔口，将第二载流和所述多个第二离散实体中的一个或多个导向至所述基质；和
使所述多个第一离散实体中的一个或多个和所述多个第二离散实体中的一个或多个附着至所述基质。
169.如168的方法，其中第一离散实体和/或第二离散实体是液滴。
170.如169所述的方法，其中所述液滴包括水性流体，其与第一载流和第二载流不混溶。
171.如170所述的方法，其中所述基质在第一表面上包括流体层，其可与所述载流混溶但不与所述水性流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的所述流体层之后，所述液滴附着至所述基质的第一表面。
172.如169所述的方法，其中第一载流和第二载流是水性流体，并且所述液滴包含与第一载流和第二载流不混溶的流体。
173.如172所述的方法，其中所述基质在第一表面上包括水性流体层，其可与第一载流和第二载流混溶但不与所述液滴包含的流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的水性流体层之后，所述液滴附着至所述基质的第一表面。
174.如168-173中任一项所述的方法，其中第一载流和第二载流是相同的。
175.如168-174中任一项所述的方法，其中第一微流体装置和第二微流体装置整合有自动化的系统，其相对于所述基质选择性地定位所述递送孔口，并且其中，所述方法包括通过所述自动化的系统，相对于所述基质，选择性地定位所述递送孔口，以选择性地递送所述多个第一离散实体和所述多个第二离散实体至所述基质上或附近的一个或多个位置。
176.如168-174中任一项所述的方法，其中第一微流体装置和第二微流体装置整合有自动化的系统，其相对于所述递送孔口选择性地定位所述基质，并且其中，所述方法包括通过所述自动化的系统，相对于所述递送孔口，选择性地定位所述基质，以选择性地递送所述多个第一离散实体和所述多个第二离散实体至所述基质上或附近的一个或多个位置。
177.一种将离散实体递送至基质的方法，所述方法包括：
使多个离散实体于载流中流动通过微流体装置，其中所述离散实体不溶于所述载流和/或不与所述载流混溶，并且其中，所述微流体装置包括多个递送孔口；
通过所述多个递送孔口中的第一递送孔口，将所述载流和所述多个离散实体中的第一一个或多个导向至所述基质；
通过所述多个递送孔口中的第二递送孔口，将所述载流和所述多个离散实体中的第二一个或多个导向至所述基质；和
使多个第一离散实体中的第一一个或多个，和所述多个离散实体中的第二一个或多个附着至所述基质。
178.如177所述的方法，其中所述离散实体是液滴。
179.如178所述的方法，其中所述液滴包括水性流体，其与所述载流不混溶。
180.如179所述的方法，其中所述基质在第一表面上包括流体层，其可与所述载流混溶但不与所述水性流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的所述流体层之后，所述液滴附着至所述基质的第一表面。
181.如178所述的方法，其中所述载流是水性流体并且所述液滴包括与所述载流不混溶的流体。
182.如181所述的方法，其中所述基质在第一表面上包括水性流体层，其可与所述载流混溶但不与所述液滴包含的流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的水性流体层之后，所述液滴附着至所述基质的第一表面。
183.如177-182中任一项所述的方法，其中所述微流体装置整合有自动化的系统，其相对于所述基质选择性地定位所述递送孔口，并且其中，所述方法包括，通过所述自动化的系统，相对于所述基质，选择性地定位所述递送孔口，以将所述多个离散实体中的第一一个或多个和所述多个离散实体中的第二一个或多个选择性地递送至所述基质上或附近的一个或多个位置。
184.如177-182中任一项所述的方法，其中所述微流体装置整合有自动化的系统，其相对于所述递送孔口选择性地定位所述基质，并且其中，所述方法包括，通过所述自动化的系统，相对于所述递送孔口，选择性地定位所述基质，以将所述多个离散实体中的第一一个或多个和所述多个离散实体中的第二一个或多个选择性地递送至所述基质上或附近的一个或多个位置。
185.一种分析液滴的方法，所述方法包括：
使多个液滴在载流中流动通过微流体装置，
将独特标识物分子包封进入或纳入所述多个液滴，从而所述多个液滴中的各液滴包括不同的独特标识物分子；
通过孔口，将所述多个液滴在第一载流中从微流体装置递送至基质表面；
使所述多个液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；
通过力，使所述多个液滴附着至所述基质表面；
对于各个附着的多个液滴，回收附着的液滴的全部或部分，并且对于各个液滴，回收所述独特标识物；
联合所述独特标识物，分析回收的液滴或回收的其部分，其中，基于所述独特标识物的存在，将所述分析的结果鉴定为特定于源自具体液滴的材料。
186.如185所述的方法，其中第一载流和第二载流是相同的。
187.如185所述的方法，其中所述独特标识物分子特定地结合至存在于所述多个液滴中的一种或多种材料。
188.如185所述的方法，其中没有两个液滴包括相同独特标识物分子。
189.如185所述的方法，其中所述独特标识物分子包括核酸。
190.如189所述的方法，其中所述多个液滴包括核酸分子，所述独特标识物分子中的一个或多个共价结合至所述核酸分子，并且其中，所述方法包括对核酸分子连同所述独特标识物分子一起测序，其中，如果核酸分子的序列读出中存在独特标识物分子的序列，则将所述核酸分子鉴定为源自具体液滴。
191.一种进行定量PCR的方法，所述方法包括：
将核酸的异质群体分隔成包含水性流体的多个液滴；
将定量的PCR试剂包封进入或纳入所述多个液滴；
使所述多个液滴在载流中流动通过微流体装置，其中所述载流不与所述水性流体混溶；
通过递送孔口，将所述载流和多个液滴导向至基质；
使所述多个液滴附着至所述基质，其中所述基质在第一表面上包括流体层，其可与所述载流混溶但不与所述水性流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的所述流体层之后，所述多个液滴附着至所述基质的第一表面；
在足以供于核酸扩增的条件下，孵育附着的多个液滴；和
随时间推移检测核酸扩增。
192.如191所述的方法，其中所述包封或纳入步骤在附着步骤之后进行。
193.如191或192所述的方法，其中所述核酸的异质群体由多个细胞包含，并且其中，所述分区包括将所述多个细胞分区进入包含水性流体的所述多个液滴。
194.如193所述的方法，其中所述方法包括分开的细胞裂解和核酸扩增步骤。
195.一种对单细胞核酸测序的方法，所述方法包括：
将异质的多个细胞分隔成包含水性流体的多个液滴，从而各液滴包括不多于一个细胞；
使所述多个液滴经历足以使其中所含的细胞裂解并释放细胞核酸的条件；
将独特核酸标识物分子包封进入或纳入所述多个液滴，从而所述多个液滴的各液滴包括不同的独特核酸标识物分子；
将所述独特核酸标识物分子连接至所述多个液滴中的一个或多个细胞核酸或连接至其扩增产物；
使所述多个液滴在第一载流中流动通过微流体装置；
通过孔口，将所述多个液滴在第一载流中从所述微流体装置递送至基质表面；
使所述多个液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；
通过力，使所述多个液滴附着至所述基质表面；
多于各附着的多个液滴，回收附着的液滴的全部或部分，包括各液滴的细胞核酸和独特核酸标识物；
连同所述独特标识物分子一起，对来自回收的液滴或回收的其部分的核酸测序，其中，如果核酸分子的序列读出中存在所述独特标识物分子的序列，则将所述核酸分子鉴定为源自特定细胞。
196.如195所述的方法，其中所述经历步骤在附着步骤之后进行。
197.如195所述的方法，其中所述包封或纳入步骤和所述连接步骤在附着步骤之后进行。
198.如195-197中任一项所述的方法，其中所述方法包括分开的细胞裂解、核酸扩增和连接步骤。
199.一种在基质上合成聚合物的方法，所述方法包括：
使包含第一液滴流体的第一液滴在载流中流动通过微流体装置，其中所述第一液滴包括第一聚合物或第一单体；
通过递送孔口，将所述载流和第一液滴导向至所述基质；
使第一液滴附着至所述基质其中所述基质在第一表面上包括流体层其可与所述载流混溶但不与第一液滴流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的所述流体层之后，第一液滴附着至所述基质的第一表面的预定位置处；
使第二液滴在所述载流中流动通过所述微流体装置，其中所述第二液滴包括第二聚合物或第二单体；
通过所述递送孔口，将所述载流和第二液滴导向至第一液滴附着的预定位置处；
在足以使第一和第二液滴的内容物接触并且使第一聚合物或第一单体与第二聚合物或单体形成共价键的条件下，孵育第一和第二液滴，由此产生合成的聚合物。
200.如199所述的方法，其中所述孵育包括在足以供于液滴聚结的条件下孵育第一和第二液滴。
201.如199或200所述的方法，其中所述合成的聚合物是多肽。
202.如199或200所述的方法，其中所述合成的聚合物是核酸。
203.一种分析基质上的液滴的方法，所述方法包括：
将包含多个文库成员的分子文库分隔成包含水性流体的多个液滴；
通过孔口，将所述多个液滴在第一载流中从微流体装置递送至基质表面；
使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；
通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；和
在附着的液滴中，与所述文库成员进行一个或多个反应；
检测附着的液滴中的所述一个或多个反应的结果和/或回收附着的液滴的全部或部分用于进一步分析。
204.如203所述的方法，其中所述第一和第二载流是相同的。
205.一种打印微阵列的方法，所述方法包括：
通过孔口，将多个液滴在第一载流中从微流体装置递送至基质表面，其中各所述多个液滴包括分子；
使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；
通过力，使所述液滴在预定位置处附着于所述基质表面；
在适于由附着的液滴包含的分子与所述基质表面化学键合的条件下孵育所述基质，由此提供结合基质的分子的阵列。
206.如205所述的方法，其中所述第一和第二载流是相同的。
207.一种原位测序的方法，所述方法包括：
使多个液滴在载流中流动通过微流体装置，
将独特核酸标识物分子包封进入或纳入所述多个液滴，从而所述多个液滴的各液滴包括不同的独特核酸标识物分子的一个或多个拷贝；
通过孔口，将所述多个液滴在第一载流中动微流体装置递送至组织基质的表面；
将所述多个液滴在第二载流中于所述组织基质的表面上定位；
通过力，使所述多个液滴附着至所述组织基质的表面；
在足以使来自各个附着的液滴的独特核酸标识物分子与该附着的液滴附近的组织基质中所含的核酸结合的条件下，孵育所述组织基质；
对所述独特核酸标识物分子以及它们结合的核酸进行测序；和
利用所述独特核酸标识物分子，对包含在所述组织基质内对应于特定液滴附着的位置处的位置的核酸进行鉴定和/或定量。
208.如207所述的方法，其中所述第一和第二载流是相同的。
209.一种处理细胞或胚胎的方法，所述方法包括：
使多个液滴在载流中流动通过微流体装置，其中所述多个液滴的各液滴包括水性流体和受精的卵细胞或胚胎，并且其中，所述载流不与所述水性流体混溶；
通过递送孔口，将所述载流和所述多个液滴导向至基质；
使所述多个液滴附着至所述基质，其中所述基质在其表面上包括流体层，其可与所述载流混溶但不与所述水性流体混溶，并且其中，在引入所述基质的表面上的流体层之后，所述多个液滴附着至所述基质的表面；
检测附着的多个液滴中的一个或多个胚胎的发育；和
从附着的液滴中选择并回收胚胎。
210.一种处理细胞或胚胎的方法，所述方法包括：
使多个液滴在载流中流动通过微流体装置，其中所述多个液滴的各液滴包括水性流体和未受精的卵细胞，并且其中，所述载流不与所述水性流体混溶；
通过递送孔口，将所述载流和所述多个液滴导向至基质；
使所述多个液滴中的一个或多个所述卵细胞受精；
使所述多个液滴附着至所述基质，其中所述基质在其表面上包括流体层，其可与所述载流混溶但不与所述水性流体混溶，并且其中，在引入所述基质的表面上的流体层之后，所述多个液滴附着至所述基质的表面；
检测附着的液滴中的胚胎的发育；和
从附着的液滴选择并回收特定胚胎。
211.如210所述的方法，其中所述受精在附着之后进行。
212.一种液滴打印机，其包括：
微流体装置，其包括一个或多个液滴制造器和一个或多个流道，其中所述一个或多个流道与所述一个或多个液滴制造器流体连通，并且经设置以从其接收一个或多个液滴；
递送孔口，其与所述一个或多个流道中的一个或多个流体连通；和
自动化的系统，其与所述递送孔口整合，其中所述自动化的系统(a)在处理过程中将所述递送孔口选择性地定位至基质附近或(b)在处理过程中将所述基质选择性地定位至所述递送孔口附近，从而液滴可从所述递送孔口喷出并沉积在所述基质上。
213.如212所述的液滴打印机，其中所述微流体装置包括液滴分选器，其选择性地分选所述一个或多个流道中的一个或多个中的液滴以供递送通过所述递送孔口。
214.如212或213所述的液滴打印机，其中所述微流体装置包括或整合有温度控制模块，其能够调节所述一个或多个流道中的载流的温度。
215.如214所述的液滴打印机，其中所述温度控制模块是热循环仪。
216.如212-215中任一项所述的液滴打印机，所述液滴打印机包括检测器具，其能够检测所述一个或多个流道中的一个或多个中的一个或多个液滴或一种或多种液滴组分。
217.如216所述的液滴打印机，其中所述检测器具是光学成像器。
218.如212-217中任一项所述的液滴打印机，其中所述分选器包括具有有间隙的分隔物的流道，其包括延伸小于所述流道的整个高度的隔板。
219.一种系统，其包括：
如212-217中任一项所述的液滴打印机；
基质表面，其用于接收通过所述液滴打印机的递送孔口沉积的一个或多个液滴；和
以下一个或多个：
(a)温度控制模块，其操作性地连接至所述液滴打印机，
(b)检测器具，其操作性地连接至所述液滴打印机，
(c)孵育器，其操作性地连接至所述液滴打印机，和
(d)测序仪，其操作性地连接至所述液滴打印机；和
传送器，其经设置以将所述基质从第一液滴接收位置传送至(a)-(d)中的一个或多个。
220.一种基质，其包括：
基质表面，其包括不混溶的相流；和
液滴的有序阵列，其位于所述不混溶的相流中，其中所述液滴附着至所述基质表面，并且其中，所述液滴的有序阵列包括至少10,000个单独液滴。
221.如220所述的基质，其中所述液滴的有序阵列包括至少50,000个单独液滴。
222.如221所述的基质，其中所述液滴的有序阵列包括至少100,000个单独液滴。
223.如221所述的基质，其中所述液滴的有序阵列包括至少1,000,000个单独液滴。
224.如220-223中任一项所述的基质，其中所述基质的长度是128mm或更小，且宽度是85mm或更小。
225.一种电极阵列系统，其包括：
嵌入基质材料的单独可控的电极的阵列；
电源；和
控制器，其中所述控制器经设置以选择性地允许或不允许所述电源和所述阵列中的各单独可控的电极之间的导电连接，由此分别提供活化或去活化电极，并且其中，当所述离散实体沉积在各活化电极附近时，所述活化电极能够使离散实体附着至所述活化电极附近的所述基质材料的表面。
226.如1-39中任一项所述的方法，其中所述多个离散实体中的一个或多个包括多个材料，并且其中，所述方法包括使包含所述多个材料的附着的离散实体中的一个或多个经历足够供于所述多个材料的组装的条件。
227.如226所述的方法，其中所述多个材料包括多个微粒子和/或纳米粒子。
228.如226所述的方法，其中所述多个材料包括一种或多种金属。
229.如226所述的方法，其中所述多个材料包括一种或多种半导体材料。
230.如226所述的方法，其中所述多个材料包括一种或多种有机材料。
231.如226所述的方法，其中所述多个材料包括一个或多个核酸。
232.如226所述的方法，其中所述多个材料包括一个或多个水凝胶材料。
233.如226所述的方法，其中所述多个材料包括一种或多种液体材料。
234.如226所述的方法，其中所述多个材料包括一种或多种材料，其具有选自下组的形状：球、棒、多面体或星形。
235.如226所述的方法，其中所述多个材料包括具有表面覆层的一种或多种材料。
236.如235所述的方法，其中所述表面覆层选自带电的覆层、亲水覆层、疏水覆层，和包括一个或多个分子识别元件的覆层。
237.如226所述的方法，其中所述多个材料包括一种或多种单体和/或聚合物。
238.如226-237中任一项所述的方法，其中所述组装包括所述多个材料之间的一个或多个共价键合相互作用。
239.如226-237中任一项所述的方法，其中所述组装包括所述多个材料之间的一个或多个非共价键合相互作用。
240.如226-239中任一项所述的方法，其中，使包括所述多个材料的附着的离散实体中的一个或多个经历足以使所述多个材料组装的条件，包括使包括所述多个材料的附着的离散实体中的一个或多个暴露至光，增大或减小足以供于所述多个材料的自组装的温度、磁力、电场(例如，频率调节的电场)、催化剂、酶(例如，酶催化剂)、排空力，和/或条件。
241.如226-240中任一项所述的方法，其包括筛选组装的材料的一种或多种性质。
242.如241所述的方法，其中所述一种或多种性质选自：传导性；与电磁辐射的相互作用，例如，可见光、紫外光或红外光，例如折射率或光散射率；荧光；磁性质；与生物组分或实体(例如，细胞(例如，细菌或哺乳动物)、真菌或病毒)的相互作用，例如，结合相互作用；催化性质；浮力；和密度。
243.一种微流体装置，其包括：
进口通道；
第一出口通道，其与进口通道流体连通；
第二出口通道，其与进口通道流体连通；
分隔壁，其将第一出口通道与第二出口通道隔开，其中所述分隔壁包括高度小于所述进口通道的高度的第一近端部分，和高度等于或大于所述进口通道的高度的第二远端部分。
244.如243所述的微流体装置，所述微流体装置包括电极，其经设置以在所述分隔壁上游的进口通道中选择性地施加电场。
245.如243或244所述的微流体装置，其中第一近端部分的高度是所述进口通道的高度的约10％-约90％。
246.如243-245中任一项所述的微流体装置，其中第一近端部分的长度等于或大于待分选通过所述微流体装置的微液滴的直径。
247.如246所述的微流体装置，其中第一近端部分的长度是待通过所述微流体装置分选的微液滴的直径的约1X-约100X。
248.如247所述的微流体装置，其中第一近端部分的长度是待通过所述微流体装置分选的微液滴的直径的约20X-约30X。
249.如243-248中任一项所述的微流体装置，包括与第一出口通道流体连通的收集储器和与第二出口通道流体连通的废液储器。
250.一种系统，其包括如244-249中任一项所述的微流体装置，和光学检测仪，其经设置以检测通过所述电极施加的电场的位置的上游的进口通道中的一个或多个微液滴的光学性质。
251.一种分选微液滴的方法，所述方法包括：
使多个微液滴于载流中流动通过微流体装置的进口通道；
通过检测仪检测所述进口通道中的多个微液滴中的一个或多个的性质；
基于对性质的检测，向所述进口通道施加电场，以选择性地使所述多个微液滴中的一个或多个偏转进入与进口通道流体连通的第一出口通道或与进口通道流体连通的第二出口通道，其中所述微流体装置包括分隔壁，其将第一出口通道与第二出口通道隔开，其中所述分隔壁包括高度小于所述进口通道的高度的第一近端部分和高度等于或大于所述进口通道的高度的第二远端部分。
252.如251所述的方法，其中所述性质是光学性质。
实施例
提供以下实施例的目的是向本领域普通技术人员完整地公开和描述如何制备和，使用本发明，这些实施例不意在限制发明人认为的发明范围，也不代表下述实验是所进行的所有或仅有的实验。努力保证所用数值(如量、温度等)的准确性，但应允许一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。可能会使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；nt，核苷酸等。
实施例1：制造并测试微流体喷嘴和图案化的电极基质
采用图8所示的方案构建并测试微液滴打印系统。液滴微流体打印头，包括用出口喷嘴改良的紧凑型微流体液滴分选器，悬置于倒置显微镜的平台上方。流动通过分选器的液滴被荧光标记，并且由耦合至外部检测光学器件的激光器在装置中被检测。当检测到所需液滴时，其被主动分选至喷嘴并引导至目标表面。恒定的载流(油)背景流使该液滴与介电电泳阱(dielectrophoretic trap)紧密接触。将在其表面中具有双极(biopolar)电极图案化的定制基质置于显微镜的xy平台上，并作为供于液滴沉积的目标。具有高电场梯度的该基质上的特定区域，通过使液滴朝向这些区域移动并润湿到这些区域上，作为供于液滴的介电电泳阱。在该实例中，打印头的喷嘴保持固定，而基质水平平移(translate)。
图9显示来自液滴打印示例的初步结果。打印头和介电电泳阱的网络是可见的，并且处于图像的平面中。沿着该图像顶部可见打印至该表面的一系列液滴。
微流体打印头的构建：微流体打印头包含修改形式的介电电泳-驱动的分选器。该实施例中所用的分选器经设计以分选约80μm直径的液滴。分选器几何形状在PDMS中采用本领域已知的软刻蚀技术模制。将装置几何形状裁剪至2cm x2cm方形，穿孔以供流体进入，以及等离子体键合至盖玻片。将分选器的“分选”出口耦合至来自装置的横向出口。将250μmOD/125μm ID聚乙烯管插入该出口通道并采用两部分环氧树脂原位粘合，产生喷嘴，以将液滴导向至打印基质。分选器的顶表面是键合至1”x 3”载玻片以允许将该分选器锚着至xyz微细操纵器的等离子体。该微细操纵器允许将打印喷嘴的尖头置入打印基质表面内100μm。
打印基质的制造：打印基质包括两个成对的电极网络，其在平面表面上产生介电电泳阱网格，如图4所示。电极是盐水填充的通道，通过外部电源带电，已显示有效于基于介电电泳的微流体装置的方案。示于图4的电极网络在PDMS中模制，采用标准软刻蚀技术。所述装置被穿孔以供流体进入和等离子体键合至载玻片，其中模制的几何特征部面朝上。所述通道随后从顶部用25μm厚片聚酰亚胺胶带(kapton tape)密封。该密封膜应一般相对较薄，因为电场的量级，因此介电电泳力的大小随着距离带电的特征部的距离暗淡。聚硅氧烷嵌缝的轮廓沉积在密封的装置的表面上以保持薄油层在介电电泳阱阵列的顶部。当采用该基质时，密封的通道通过压力注射器填充有盐水。取自荧光灯镇流器的AC生成器附连至注射器针头，并且用于以30,000Hz AC施加约1500V至该盐水通道。
初步实验：进行微液滴打印机概念证实实验，以证明联合介电电泳阱基质的基于微流体分选器打印头功能。采用外部液滴制造器来产生包含油中的80μm水性液滴的乳剂。包含PBS的水相用40μM荧光素染料染色。采用注射泵将该乳剂再次注入打印头。开发专用的软件以将该分选器用作按需喷墨装置，其中，当手动按压软件界面中的按钮时，具有所需荧光性质组的液滴可被分选至打印喷嘴。在分选的液滴附着至打印基质之后，将倒置显微镜的xy平台手动移动至下一个网格位置。图9中的液滴采用该技术打印，显示该打印技术的可行性。
实施例2：用于微液滴的高速分选的改进的分选架构
此处描述的是允许以>99％精确性进行30kHz液滴分选的微流体设计。相较于最快的现有液滴分选器，这十倍速率增加允许每小时分选约108个液滴，每天超过十亿个液滴。实际上，采用所述架构，分选速度不受分选的物理机理限制(甚至在Ca～1也是如此)，而是受检测液滴的电子器件(electronics)的限制；采用更快的电子器件，能够预期甚至更快的分选。
所述装置采用由装置模板模铸的聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)的软刻蚀制造。从光刻胶(MicroChem，SU-8 3010)的两个相继层(11μm和19μm厚)产生的模板被悬冲至硅片上。将由10:1聚合物:交联剂混合物(Dow Corning，Sylgard 184)组成的未固化的PDMS倾倒至模板上，脱气，并在85℃烧制2小时。该PDMS模具随后从模板切割并剥离，用0.75mm HarrisUni-core穿孔用于入口，并且等离子体键合至1mm厚、10:1PDMS厚板以确保强键合。键合的PDMS装置随后在85℃烧制10分钟。全部PDMS装置的底部随后等离子体键合至载玻片以提供结构支持和刚性。为了允许立即使用采用油包水乳剂的装置，通过用Aquapel冲洗，用加压空气清洁并在85℃另烧制30分钟来进行疏水的表面处理。
使分选速度产生数量级的增加这一主要创新是用有间隙的分隔物替代一般将收集和废液通道分开的不透性壁。所述有间隙的分隔物，其仅部分地从所述通道顶板到达底板，允许液滴挤入分选通道(30μm高)之间的能量不利的区域(11μm高)。归因于液滴拉普拉斯(Laplace)压力，高于或低于分选器中心线的小横向位移随着液滴向下游行进而增大，将它们完全推入最近的通道。该过程示于图10分图(a)的示意图中，其中提供有间隙的分隔物插图中受挤压的液滴的截面。图10分图(b)还显示取自以22kHz分选的25μm液滴的高速影片。这比常规分选器快十倍，其采用硬壁分隔物，液滴在类似流速处因分隔物边缘处的剪切而分解(图10，分图(c))。如果液滴在它们到达其起始边缘之前充分越过分隔物位移，则不发生分解；然而，在高流速下，所用的大电场将液滴击碎(图10，分图(d))。通过比较，当采用有间隙的分隔物时，液滴经历较小的剪切并且能够最终逐渐进入一个通道。
对于实现最大分选速度而言可能重要的另一个因素是油间隔物流速的最小化。合适的液滴分隔在允许液滴被询问且单独分选中是重要的，但过多的油增加毛细管数量并且限制分选速度。为了使油流速最小化，使用采用宽电极的50μm宽的窄分选接合处，其在长距离上对液滴施以恒定的力。还在分选接合处的入口处应用第二有间隙的分隔物(图10左侧的部分，分图(a)和(b)，其将到来的液滴牵制于上壁上，从而在分选过程中利用完全通道并且没有油被浪费。该分隔物通过转移高流速载体油被操作，用于正确地分隔液滴，从再注射通道进入携带有偏压油(bias oil)的较低通道，所述偏差油用于调整下游的横向液滴位置。合并的油从下方被牵制的前来的液滴流向上通道壁；若不采用所述设计，液滴移动至通道中心。
有间隙的分隔物允许使分选速度最大化，但其它特征部可能重要于确保分选精确性。例如，随着流速增加以更快分选，入口压强增大，造成液滴滤器弯曲(图11，分图(a))。弯曲加宽滤器间隙，这允许灰尘通过，这可能会阻塞装置。其还造成液滴在纵向层中拥挤，导致不规则的分隔(图11，分图(b))和可能的分选错误。为了解决这些问题，采用替代性的设计，其中处于相同浅层中的滤器作为有间隙的分隔物(图11，分图(a)中的液滴入口)而不是分选接合处的剩余部分的较高层(灰色)。滤器在压强下仍然弯曲，但间隙保留得足够小以去除碎片。此外，随着液滴接近注射通道，它们受力成单层、单一细线以供均匀分隔(图11，分图(c))。弯曲的证据可见于滤器的开口区域，其中桩周围的形变显示为非均一的阴影，并且液滴在这里纵向堆叠成多层(图11，分图(d))。
分隔后，液滴行进至分选器，如图11分图(a)所示，并且在图10分图(a)和(b)中展开。在那里，液滴通过激光器扫描并且它们的荧光被检测。连接至高压放大器的盐水电极(2M NaCl)施加分选液滴的电场。环绕(moat)、接地的盐水电极与装置毗邻，产生介电电泳偏转和限制可能会造成滤器中不希望的液滴合并的杂散场所需的场梯度。一旦分选，分开的群以类似水动态阻力在两个平行的通道中向下行进。因为阴性分选的群通常比阳性分选的群大得多，阴性通道经历来自液滴拖拽的较大流阻。为了平衡压强并允许受控分配进入收集储器，在出口附近包括一系列浅的平行的通道(放大于图11，分图(e))以允许油，但非液滴，在出口之间移动并平衡小压强差。这还使分选器对出口管高度的小差异不那么敏感，该差异可能会产生重力回压，这可能会干扰液滴分选。
为了证明快速分选器的有效性，将其用于分选测试乳剂包括两个液滴群：暗淡的“阴性”群和明亮的“阳性”群。阳性液滴包括磷酸盐缓冲盐水，其具有1.4％(以体积计)0.5μm乳胶珠(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)，L3280)，以使它们在光学显微镜检图像中显得暗淡(图10，分图(b))，和0.75％荧光黄色0.03μm乳胶珠(西格玛奥德里奇(SigmaAldrich)，L5150)，以使它们发明亮荧光。阴性液滴是磷酸盐缓冲盐水，其具有0.13％荧光黄色珠，以使它们发暗淡荧光，从而它们也可被液滴检测仪检测。为了产生充分的乳剂以供以30kHz进行若干小时的分选，乳剂采用连续液滴分解产生，初始形成为50μm液滴，其各均分三次以产生直径25μm的8个液滴。这对于水相允许以2mL/小时生成液滴，采用流动聚焦生成器可达到快约5倍。
为了分选乳剂，以0.7mL/小时将液滴注入装置，其中液滴分隔油和液滴定位-调谐偏压油(tuning bias oil)各以7mL/小时。这对应于3m/s通过30μm x50μm分选器截面的平均流速。氟化油(3M，HFE-7500)和1％PEG-PFPE两亲性嵌段共聚物表面活性剂合并供于4mN/m的液滴界面张力，以及近乎相配的0.1mPa-s的水-油动态粘性，在该流处产生极大的0.8的Ca。荧光由473nm激光(CNI激光)产生，通过带通滤器(Semrock)在517±10nm过滤，并由光电倍增管(PMT，Thorlabs，PMM02)检测。信号由FPGA(NI，PCI-7833R)采用定制LabVIEW软件分析。落进用户确定的阈值的液滴通过来自FPGA，通过盐水电极传输进入装置的放大脉冲(Trek 609E-6)分选。为了观察该分选并捕捉高速视频，该装置用不与液滴荧光重叠的红外照射，并用快速相机(Phantom，Miro M310)以50kHz帧速率成像。
荧光信号和来自1小时长、约30kHz分选运行(等同于处理超过108个液滴)的分选前和分选后的液滴群示于图12。随着液滴通过激发激光，由PMT检测它们发出的荧光，其输出与发出的光强度成比例的电压。如PMT检测的半周期性液滴荧光示于图12分图(a)中的蓝色时间序列，其中相应的分选脉冲为红色。PMT具有0-20kHz的带宽，从而高于该范围的频率组成通过与它们在20kHz之上的倍数增加成比例的因子减弱。具有较高频率响应的PMT是市售可得的并且可用于更快地检测液滴。在200kHz记录PMT电压，取样时程为5μs，其约为液滴在检测仪区域所耗的时间。不论通过限制的PMT带宽的幅度减弱和时间宽展，个体液滴信号仍远高于本底噪声并且由时间踪迹所示是可区分的。
将荧光高于0.15V的PMT阈值和该阈值处的时间宽度<50μs的那些鉴定为阳性液滴，其排除大的、合并的液滴。当检测到阳性液滴时，计算机输出1V、33μs矩形脉冲，其由13kHz-带宽、高压放大器以倒角(edge rounding)放大至1kV。检测激光器位于电极之前，从而，在鉴定液滴之后，立即-施加的脉冲对应于液滴直接与电极相对的时刻，其对于分选是最优的。为估计分选速度，1小时长的运行的时间序列中的液滴速率通过如下方式来检测：通过鉴定峰，以及，通过检测傅里叶变换的最大值，其在29±1kHz附近(图12，分图(a)，插图)集中。常规微流体装置的分选速率比该速度小10倍，并且，用于比较，落入该插图左侧的红色条带。
为了证实准确的液滴分选，分选前(图12，分图(b))、阳性分选(图12，分图(c))，和阴性分选(图12，分图(d))液滴群采用荧光显微镜检成像。分选前的群为6.4％明亮，这符合采用PMT时间踪迹检测的阳性部分。阳性群为99.3％并且阴性为0.2％明亮。假阳性(阳性群中暗淡的液滴)异常地大(大多数是平均液滴体积的>3倍，图12，分图(c))并且可能是合并的液滴，其过大以无法用于该装置设计。假阴性(阴性群中的明亮的液滴)异常地小(比平均液滴体积<2倍)，其在分选过程中可能导致成比例较小的介电电泳力和不充分的偏转。大多数情况中，分选错误因此是由起始乳剂中的多分散性所致，表明较高精确性要求更均一的乳剂。这是难以实现的，因为大多数乳剂，不论关于它们的产生和处理有多仔细，都将包含合并或分解的液滴(因此，异常地大或小)的少见情况。分选之前，乳剂的过滤可改善该情况，但需要额外步骤，而这些额外步骤可能导致甚至更多的合并和分解。
所述装置实现了堪比荧光活化的细胞分选器的分选速率，其可以数十个千赫兹进行分选。最近，采用这些FACS方法，小微流体液滴(10-20μm)已能以10-15kHz分选。然而，这需要双重乳化步骤，其中油包水液滴在与FACS相容的水性载体中悬浮为水包油包水双重乳剂。这可能不适于所有应用，因为双重乳剂的稳定性一般低于单一乳剂，此外，趋于对于小分子更具透过性，其可能随时间推移漏出液滴。在其中这些问题具有重要性的情况中，快速微流体液滴分选是有价值的。
如本文所述，本发明提供在30kHz(比现有的液滴分选器快10倍)准确地分选液滴的微流体装置。可能使该速率更高，但可能会需要更快的电学器件。所述液滴分选器的速度将允许以空前数量的液滴来分选乳剂。这对于其中目标液滴或细胞在群体中极少见的蛋白质工程改造和细胞生物学的应用而言是有价值的。例如，对于通过基于液滴的微流体定向进化来增强酶或对于从血液细胞分离极少见的循环肿瘤细胞而言，所述富集是重要的。
虽然出于阐明目的已经通过说明和举例的方式对本发明有所描述，但本领域普通技术人员根据本发明的教导不难了解，可以对本发明作出某些改变和修改而不背离所附权利要求书的构思和范围。
因此，前述内容只是说明本发明的原理。应理解，本领域技术人员能够设计各种安排，虽然本文没有明确描述或显示这些安排，但它们均体现本发明的原理并包含在本发明构思和范围内。此外，本文中所用的全部示例和常规语言原则上意在协助读者理解本发明的原理，而不是限制到具体所述的示例和条件。而且，本文有关本发明原理、方面、实施方式以及具体实施例的所有陈述都应包括其结构和功能等同物。此外，这些等同物应包括目前已知的等同物和将来开发的等同物，即新开发的具有相同功能的任何成员，无论其是何种结构。因此，本发明的范围不限于本文所示和所述的示例性实施方式。适当的是，本发明的范围和构思由所附权利要求书限定。
Claims (55)
1.一种将离散实体递送至基质的方法，所述方法包括：
使多个离散实体于载流中流动通过微流体装置，其中所述离散实体不溶于所述载流和/或不与所述载流混溶；
通过递送孔口，将所述载流和所述多个离散实体中的一个或多个导向至所述基质；和
使所述多个离散实体中的一个或多个附着至所述基质。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述多个离散实体中的一个或多个通过力附着至所述基质，其中所述力选自重力、电动力、磁力及其组合。
3.如权利要求2所述的方法，其包括，将附着的实体在受控的环境条件下储存一段储存期，其中所述力在所述储存期期间保持。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述受控的环境条件包括恒定的温度和/或压强。
5.如权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述力是电动力。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述电动力是介电电泳力。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述离散实体是液滴。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述液滴通过润湿附着至所述基质。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述液滴包括水性流体，其与所述载流不混溶。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述基质在第一表面上包括流体层，其可与所述载流混溶但不与所述水性流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的所述流体层之后，所述液滴附着至所述基质的第一表面。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述载流是水性流体并且所述液滴包括与所述载流不混溶的流体。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述基质在第一表面上包括水性流体层，其可与所述载流混溶但不与所述液滴包含的流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的水性流体层之后，所述液滴附着至所述基质的第一表面。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述离散实体通过界面张力附着至所述基质。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述离散实体的尺寸是约1-1000μm。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述离散实体的直径是约1-1000μm。
16.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述离散实体的体积是约1毫微微升-约1000纳升。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述微流体装置包括分选器，并且其中，所述方法包括通过所述分选器分选待通过所述递送孔口从所述多个离散实体递送至所述基质的所述多个离散实体中的一个或多个。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述分选器包括具有有间隙的分隔物的流道，其包括延伸小于所述流道的整个高度的隔板。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述多个离散实体在分选之前经光学扫描。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述分选器包括光纤，其经设置以将激发能施加至所述多个离散实体中的一个或多个。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述分选器包括第二光纤，其经设置以收集通过向所述多个离散实体中的一个或多个施加激发能产生的信号。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述光纤经设置以将激发能施加至所述多个离散实体中的一个或多个，并且收集通过向所述多个离散实体中的一个或多个施加激发能所产生的信号。
23.如权利要求19所述的方法，其中所述分选基于光学扫描得出的结果。
24.如权利要求17所述的方法，其中所述分选器是主动分选器。
25.如权利要求17所述的方法，其中所述分选器是被动分选器。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述分选包括通过介电电泳的分选。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述分选器包括一个或多个微流体阀，并且其中，所述分选包括通过活化一个或多个微流体阀的分选。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述离散实体是液滴，所述微流体装置包括可选择性地活化的液滴制造器，其从流体流形成液滴，并且其中，所述方法包括通过选择性活化液滴制造器来形成所述多个离散实体中的一个或多个。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述多个离散实体包括在组成上不同的离散实体。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述微流体装置整合有自动化的系统，其相对于基质选择性地定位所述递送孔口，并且其中，所述方法包括通过所述自动化的系统，相对于所述基质，选择性地定位递送孔口，以将所述多个离散实体中的一个或多个选择性地递送至所述基质上或附近的一个或多个位置。
31.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述微流体装置整合有自动化的系统，其相对于递送孔口选择性地定位所述基质，并且其中，所述方法包括通过自动化的系统，相对于递送孔口，选择性地定位递送基质，以将所述多个离散实体中的一个或多个选择性地递送至所述基质上或附近的一个或多个位置。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中所述方法包括，将所述多个离散实体的第一成员递送至所述基质上或附近的第一位置，并将所述多个离散实体的第二成员递送至所述基质上或附近的第二位置。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述第一和第二位置是相同的。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中在向所述基质递送之前和/或之后，在所述离散实体中的一个或多个中进行一个或多个生物学测定。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中，在向所述基质递送之前和/或之后，控制所述离散实体中的一个或多个的温度。
36.如权利要求35所述的方法，其中，在向所述基质递送之前和/或之后，对所述离散实体中的一个或多个进行热循环。
37.如权利要求17-36中任一项所述的方法，其中，回收未经分选用于通过递送孔口递送至所述基质的所述多个离散实体的成员。
38.如权利要求37所述的方法，其中，回收的所述多个离散实体的成员被再循环，从而，如权利要求1所述的方法采用所述多个离散实体的回收的成员重复进行。
39.如权利要求38所述的方法，其中，回收的所述多个离散实体的成员在所述方法的进行过程中被持续再循环。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中，所述多个离散实体中的一个或多个包括细胞。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述多个离散实体的各成员包括不多于一个细胞。
42.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中，所述多个离散实体中的一个或多个包括核酸。
43.如1-42中任一项所述的方法，其中所述方法包括，将一种或多种试剂包封进入或纳入所述多个离散实体。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述一种或多种试剂包括扩增试剂。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述扩增试剂包括聚合酶链式反应(PCR)试剂。
46.一种打印一个或多个细胞层的方法，所述方法包括：
将细胞包封在液滴中，所述液滴包含水性流体，以提供含有细胞的液滴；
使包括含有细胞的液滴的多个液滴于载流中流动通过微流体装置，其中所述载流不与所述水性流体混溶；
通过递送孔口，将所述载流和多个含有细胞的液滴导向至基质；和
使多个所述含有细胞的液滴附着至所述基质以提供含有细胞的液滴的第一层，其中所述基质在第一表面上包括流体层，其可与所述载流混溶但不与所述水性流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的流体层之后，多个所述含有细胞的液滴附着至所述基质的第一表面。
47.一种使附着的液滴在基质上移动的方法，所述方法包括：
通过孔口，于第一载流中将液滴从微流体装置递送至基质表面；
使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；
通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；和
调节所述力，从而使所述液滴从其附着的位置移动至另一个位置和/或施加第二力，其单独或与该经调节的力联合足以使所述液滴从其附着的位置移动至另一个位置。
48.一种添加试剂至液滴的方法，所述方法包括：
通过第一孔口，将液滴在第一载流中从微流体装置递送至基质表面；
使所述液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；
通过力，使所述液滴附着至所述基质表面；
将与试剂来源流体连接的第二孔口插入所述液滴；和
通过第二孔口，将一种或多种试剂注入所述液滴。
49.一种将离散实体递送至基质的方法，所述方法包括：
使多个第一离散实体在第一载流中流动通过第一微流体装置，其中所述第一离散实体在第一载流中不溶解和/或不混溶，并且其中，所述第一微流体装置包括第一递送孔口；
通过第一递送孔口，将第一载流和所述多个第一离散实体中的一个或多个导向至所述基质；
使多个第二离散实体在第二载流中流动通过第二微流体装置，其中所述第二离散实体在第二载流中不溶解和/或不混溶，并且其中，所述第二微流体装置包括第二递送孔口；
通过第二递送孔口，将第二载流和所述多个第二离散实体中的一个或多个导向至所述基质；和
使所述多个第一离散实体中的一个或多个和所述多个第二离散实体中的一个或多个附着至所述基质。
50.一种进行定量PCR的方法，所述方法包括：
将核酸的异质群体分隔成包含水性流体的多个液滴；
将定量的PCR试剂包封进入或纳入所述多个液滴；
使所述多个液滴在载流中流动通过微流体装置，其中所述载流不与所述水性流体混溶；
通过递送孔口，将所述载流和多个液滴导向至基质；
使所述多个液滴附着至所述基质，其中所述基质在第一表面上包括流体层，其可与所述载流混溶但不与所述水性流体混溶，并且其中，在引入所述基质的第一表面上的所述流体层之后，所述多个液滴附着至所述基质的第一表面；
在足以供于核酸扩增的条件下，孵育附着的多个液滴；和
随时间推移检测核酸扩增。
51.一种对单细胞核酸测序的方法，所述方法包括：
将异质的多个细胞分隔成包含水性流体的多个液滴，从而各液滴包括不多于一个细胞；
使所述多个液滴经历足以使其中所含的细胞裂解并释放细胞核酸的条件；
将独特核酸标识物分子包封进入或纳入所述多个液滴，从而所述多个液滴的各液滴包括不同的独特核酸标识物分子；
将所述独特核酸标识物分子连接至所述多个液滴中的一个或多个细胞核酸或连接至其扩增产物；
使所述多个液滴在第一载流中流动通过微流体装置；
通过孔口，将所述多个液滴在第一载流中从所述微流体装置递送至基质表面；
使所述多个液滴在第二载流中于所述基质表面上定位；
通过力，使所述多个液滴附着至所述基质表面；
多于各附着的多个液滴，回收附着的液滴的全部或部分，包括各液滴的细胞核酸和独特核酸标识物；
连同所述独特标识物分子一起，对来自回收的液滴或回收的其部分的核酸测序，其中核酸分子的序列读出中存在所述独特标识物分子的序列将所述核酸分子鉴定为源自特定细胞。
52.一种液滴打印机，其包括：
微流体装置，其包括一个或多个液滴制造器和一个或多个流道，其中所述一个或多个流道与所述一个或多个液滴制造器流体连通，并且经设置以从其接收一个或多个液滴；
递送孔口，其与所述一个或多个流道中的一个或多个流体连通；和
自动化的系统，其与所述递送孔口整合，其中所述自动化的系统(a)在处理过程中将所述递送孔口选择性地定位至基质附近或(b)在处理过程中将所述基质选择性地定位至所述递送孔口附近，从而液滴可从所述递送孔口喷出并沉积在所述基质上。
53.一种系统，所述系统包含：
如权利要求55所述的液滴打印机；
基质表面，其用于接收通过所述液滴打印机的递送孔口沉积的一个或多个液滴；和
以下一个或多个：
(a)温度控制模块，其操作性地连接至所述液滴打印机，
(b)检测器具，其操作性地连接至所述液滴打印机，
(c)孵育器，其操作性地连接至所述液滴打印机，和
(d)测序仪，其操作性地连接至所述液滴打印机；和
传送器，其经设置以将所述基质从第一液滴接收位置传送至(a)-(d)中的一个或多个。
54.一种微流体装置，其包括：
进口通道；
第一出口通道，其与进口通道流体连通；
第二出口通道，其与进口通道流体连通；
分隔壁，其将第一出口通道与第二出口通道隔开，其中所述分隔壁包括高度小于所述进口通道的高度的第一近端部分，和高度等于或大于所述进口通道的高度的第二远端部分。
55.一种分选微液滴的方法，所述方法包括：
使多个微液滴于载流中流动通过微流体装置的进口通道；
通过检测仪检测所述进口通道中的多个微液滴中的一个或多个的性质；
基于对性质的检测，向所述进口通道施加电场，以选择性地使所述多个微液滴中的一个或多个偏转进入与进口通道流体连通的第一出口通道或与进口通道流体连通的第二出口通道，其中所述微流体装置包括分隔壁，其将第一出口通道与第二出口通道隔开，其中所述分隔壁包括高度小于所述进口通道的高度的第一近端部分和高度等于或大于所述进口通道的高度的第二远端部分。
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