CN107083394A

CN107083394A - 一种共表达核糖体蛋白提高外源蛋白表达量的方法

Info

Publication number: CN107083394A
Application number: CN201710431799.3A
Authority: CN
Inventors: 喻晓蔚; 徐岩
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-06-09
Filing date: 2017-06-09
Publication date: 2017-08-22
Anticipated expiration: 2037-06-09
Also published as: CN107083394B

Abstract

本发明公开了一种共表达核糖体蛋白提高外源蛋白表达量的方法，属于酶工程技术领域。本发明通过在表达外源目的蛋白的同时过表达核糖体蛋白RPL10、RPL38、RPL43，显著提高了外源目的蛋白的表达量。

Description

一种共表达核糖体蛋白提高外源蛋白表达量的方法

技术领域

本发明涉及一种共表达核糖体蛋白提高外源蛋白表达量的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

毕赤酵母(Komagataella phaffii，K.phaffii，原命名为Pichia pastoris)是重要的蛋白表达平台微生物，能以甲醇或者甘油作为单一的碳源和能源，其中甲醇可作为诱导剂，诱导醇氧化酶(AOX1)启动子。毕赤酵母表达系统和其它蛋白表达系统相比较，具备如下优势：具有强诱导性和强启动性启动子，利于外源基因高效表达；蛋白质加工折叠和翻译后修饰的作用，使外源蛋白的结构与天然蛋白相似，从而表现出一定的生物活性；上清液中内源蛋白分泌量非常少，有利于表达产物的分离纯化；外源基因与毕赤酵母染色体通过基因重组的方式整合，避免了外源基因的丢失，为外源蛋白插入酵母并稳定传代提供了可能。

提高毕赤酵母外源蛋白的表达量是当前微生物研究的重要课题之一，在工业中毕赤酵母中高效表达外源蛋白具有相当高的应用价值。毕赤酵母基因组序列的解读，有利于根据高产蛋白的特定属性来改良菌株品系。目前已有多种外源蛋白在毕赤酵母中取得较好的表达效果。

迄今大多数研究都集中在优化发酵条件，建立发酵条件与外源蛋白产量之间关系。但是这种简单的对应关系，未能明确发酵菌株与蛋白产量之间联系的依据。

此外，利用毕赤酵母生产具有较高酶活性的蛋白还面临一些难题，比如，虽高蛋白表达量，酶活性较低。有研究报道利用伴侣蛋白来促进外源蛋白的折叠，从而提高蛋白的表达水平，以及比活力。如Smit等通过共表达KAR2的方式提高了酿酒酵母中葡萄糖苷酶的表达量；卢鑫等在毕赤酵母中共表达伴侣蛋白(PDI和ERO1)提高了米根霉脂肪酶的产量；沙冲等进一步研究发现同时共表达伴侣蛋白PDI和ERO1，多种伴侣蛋白通过协同作用，可较大程度提高外源蛋白的活力。另有研究报道，共表达伴侣蛋白并不能提高外源蛋白的表达水平，在有些情况下反而使得外源蛋白的表达水平降低，如当在酿酒酵母中共表达Scj1时，外源蛋白人白蛋白的表达水平降低了60％(ANTIOXIDANTS&REDOX SIGNALING,2014,21:414-437)。

目前仅仅局限在利用少数几种伴侣蛋白进行共表达来提高外源蛋白的表达量，急需在研究毕赤酵母高效表达机制的基础上开发其他新型的能够促进外源蛋白表达的因子。

发明内容

本发明提供了一种提高毕赤酵母中外源蛋白表达量的方法，所述方法是在表达外源目的蛋白的同时过表达核糖体蛋白RPL10、RPL38、RPL43中的任意一种或者多种。

在一种实施方式中，所述核糖体蛋白RPL10、RPL38、RPL43是来源于毕赤酵母的核糖体蛋白。

在一种实施方式中，所述核糖体蛋白RPL10、RPL38、RPL43的氨基酸序列分别如SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。

在一种实施方式中，所述外源目的蛋白可以是磷脂酶、脯氨酰内肽酶、脂肪酶、蛋白酶或糖化酶等。

在一种实施方式中，所述方法是在同一宿主中表达外源蛋白和所述核糖体蛋白。

在一种实施方式中，所述宿主为毕赤酵母。

本发明的第二个目的是提供一种外源蛋白表达量提高的毕赤酵母重组菌，所述毕赤酵母重组菌在表达外源目的蛋白的基础上，还同时过表达了核糖体蛋白RPL10、RPL38、RPL43中的任意一种或者多种。

在一种实施方式中，所述表达核糖体蛋白RPL10、RPL38、RPL43的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。

在一种实施方式中，所述外源目的蛋白为紫红链霉菌磷脂酶A₂。

在一种实施方式中，所述毕赤酵母重组菌是以毕赤酵母GS115、X33、KM71、KM71H、SMD1168、SMD1163等中的任意一种为宿主菌构建得到的。

在一种实施方式中，所述毕赤酵母重组菌是以pPIC9K、pPICZA/B/C、pPIC9K-His、pPIC3.5K、pPICZalphaA/B/C、pGAPZalpha、pAO815、pHIL-S1、pPink hc等中的任意一种为质粒载体构建得到的。

本发明的第三个目的是提供所述毕赤酵母重组菌的应用。

在一种实施方式中，所述应用是应用于食品、酿造、造纸、制革、制糖、化工等领域，更具体地，是应用于食品与酿造领域。

本发明的优点和效果：

本发明通过在表达外源目的蛋白的同时过表达核糖体蛋白RPL10、RPL38、RPL43，显著提高了外源目的蛋白的表达量。

附图说明

图1为含磷脂酶菌株共表达核糖体蛋白菌体浓度摇瓶发酵曲线；

图2为含磷脂酶菌株共表达核糖体蛋白菌体浓度摇瓶发酵曲线；

图3为含磷脂酶菌株共表达核糖体蛋白产外源蛋白摇瓶发酵曲线；

图4为含磷脂酶菌株共表达核糖体蛋白产外源蛋白摇瓶发酵曲线；

图5为含磷脂酶菌株共表达核糖体蛋白产磷脂酶酶活摇瓶发酵曲线；

图6为含磷脂酶菌株共表达核糖体蛋白产磷脂酶酶活摇瓶发酵曲线；

图7为含脯氨酰内肽酶菌株共表达核糖体蛋白菌体浓度摇瓶发酵曲线；

图8为含脯氨酰内肽酶菌株共表达核糖体蛋白产外源蛋白摇瓶发酵曲线；

图9为含脯氨酰内肽酶菌株共表达核糖体蛋白产脯氨酰内肽酶酶活摇瓶发酵曲线。

具体实施方案

(1)生物量测定

采用细胞干重(DCW)表示。取样后置于离心机中离心(12000r·min^-1，6min)，将菌体保留，加生理盐水悬浮菌体，重复离心去上清，然后放置在90℃烘箱中烘干得细胞干重。

(2)蛋白含量测定

利用考马斯亮蓝法测定发酵液上清中总蛋白浓度。取上述发酵上清液，测定595nm波长下测吸光度，每组设置三个平行，计算上清液中总蛋白浓度。

(3)磷脂酶活力测定

使用sPLA2Assay Kit测定磷脂酶A₂酶活力，方法步骤见说明书。

(4)脯氨酰内肽酶酶活力测定方法

具体操作步骤见文献(Journal ofMolecular Catalysis B:Enzymatic,2016,125:81-87)。酶活计算公式为：

其中，U·mL^-1：酶活力单位；ΔA：反应体系吸光度变化；V：总反应体系(mL)；v：发酵液体积(mL)；γ：摩尔消光系数(cm²·mol^-1)；β：比色杯光程(cm)。

下面是对本发明进行具体描述。

实施例1：共表达核糖体蛋白相关基因菌株的构建

以小分子量蛋白磷脂酶(21KD)以及大分子量蛋白脯氨酰内肽酶(66KD)两种蛋白作为外源目的蛋白表达对象，构建共表达核糖体蛋白相关基因的重组菌株。

具体是：

(1)通过PCR方法扩增毕赤酵母核糖体蛋白(RPL10、RPL38、RPL43)的基因序列(核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示)，并在序列两端添加酶切位点。用限制性内切酶AsuII和NotI分别对质粒pPICZA和基因片段进行双酶切，胶回收目的片段，利用T4DNA连接酶连接目的基因和载体，转化至DH5α感受态细胞，筛选验证获得重组质粒。

(2)将上述构建的重组质粒用限制性内切酶PmeI酶切线性化，胶回收目的片段，分别电转感受态细胞(毕赤酵母K.phaffii GS115/pPIC9K-MLMH、GS115/pPIC9K-PLA2-1和GS115/pPIC9K-PLA2-12感受态细胞)，培养并验证阳性菌株，得到了如表1所示的毕赤酵母重组菌。

其中，表达紫红链霉菌磷脂酶A₂的毕赤酵母菌株K.phaffii GS115/pPIC9K-PLA2-1(含1拷贝磷脂酶基因)、K.phaffii GS115/pPIC9K-PLA2-12(含12拷贝磷脂酶基因)为本实验室之前构建的菌株(参见：刘爱霞，硕士毕业论文，江南大学，2015年)。GS115/pPIC9K-MLMH代表以K.phaffii GS115为宿主、pPIC9K为载体，重组表达了脯氨酰内肽酶融合蛋白MLMH的重组菌，具体是从质粒pPICZA-MLMH(Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2016,125:81-87)中PCR克隆得到MLMH基因，通过酶切连接构建质粒pPIC9K-MLMH，然后转化到K.phaffii GS115宿主中得到GS115/pPIC9K-MLMH。

表1共表达核糖体蛋白和外源目的蛋白的毕赤酵母重组菌列表

实施例2：

以小分子量蛋白磷脂酶(21KD)以及大分子量蛋白脯氨酰内肽酶(66KD)两种蛋白作为外源目的蛋白表达对象，分析含有核糖体蛋白相关基因的重组菌株对外源目的蛋白表达的影响。

其中毕赤酵母摇瓶发酵方法如下：

将甘油管保藏菌株用平板划线法培养，30℃培养3–5d。挑取单克隆至BMGY培养基中，在30℃200r·min^-1条件下培养16h–18h至OD₆₀₀达到2–6。将菌液在无菌条件下转移至无菌的离心管中，在6000r·min^-1条件下离心10min，弃掉上清收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，28℃250r·min^-1条件下培养，每24h添加1％的甲醇诱导表达，定时取样测定发酵液的菌体浓度和发酵上清液的蛋白浓度。

(1)产磷脂酶重组菌株共表达核糖体蛋白相关基因的摇瓶发酵结果

将构建的共表达核糖体蛋白菌株(表1)与出发菌株(GS115/pPIC9K-PLA-1和GS115/pPIC9K-PLA-12)进行摇瓶发酵。结果显示，从图1和图2中可以看出，菌体生长趋势相接近，而与对照菌株相比较，共表达核糖体蛋白能够促进磷脂酶的表达水平，共表达核糖体蛋白促进磷脂酶表达的程度依次是RPL10，RPL43和RPL38(图3、图4)。其中，共表达核糖体蛋白RPL10使得总蛋白浓度最高增加了14.7％，胞外酶活力增加了16.9％(图5、图6)。

从图5中可以看出，共表达RPL10、RPL43、RPL38和1拷贝磷脂酶基因的重组菌菌株在发酵84h下达到的磷脂酶酶活分别为0.47U·L^-1、0.45U·L^-1、0.44U·L^-1，相比对照菌株GS115/pPIC9K-PLA-1，分别提高了1.12倍、1.08倍、1.05倍。

从图6中可以看出，共表达RPL10、RPL43、RPL38和12拷贝磷脂酶基因的重组菌在发酵84h下达到的磷脂酶酶活分别为0.62U·L^-1、0.58U·L^-1、0.56U·L^-1，相比对照菌株GS115/pPIC9K-PLA-12，分别提高了1.15倍、1.07倍、1.04倍。

(2)产脯氨酰内肽酶重组菌株共表达核糖体蛋白相关基因摇瓶发酵

以表达脯氨酰内肽酶基因的毕赤酵母作为对照菌株，分析共表达核糖体蛋白对其的影响，结果如图7、图8、图9所示。

如图7所示，共表达核糖体蛋白菌株与对照菌株(K.phaffii GS115/pPIC9K-MLMH)菌体浓度(OD₆₀₀)生长趋势相似。

如图8所示，共表达核糖体蛋白促进脯氨酰内肽酶表达的程度依次是RPL10，RPL38和RPL43。脯氨酰内肽酶蛋白浓度最高的菌株是GS115/pPIC9K-MLMH/pPICZ-RPL10，胞外总蛋白浓度为0.25g·L^-1。共表达RPL38和RPL43菌株蛋白浓度分别为0.22g·L^-1、0.24g·L^-1。

如图9所示，当发酵96h时，共表达菌株RPL10，RPL38、RPL43的脯氨酰内肽酶酶活分别为190U·L^-1、185U·L^-1、180U·L^-1，与对照菌GS115/pPIC9K-MLMH的磷脂酶酶活175U·L^-1相比，分别提高了1.09倍、1.06倍、1.03倍。

从本次实验结果证明，共表达核糖体蛋白也可以提高脯氨酰内肽酶的表达量及酶活。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种共表达核糖体蛋白提高外源蛋白表达量的方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Arg Arg Pro Ala Arg Cys Tyr Arg Tyr Cys Lys Asn Lys Pro

1 5 10 15

Phe Pro Lys Ser Arg Tyr Asn Arg Gly Val Pro Asp Pro Lys Ile Arg

20 25 30

Ile Tyr Asp Leu Gly Arg Lys Lys Ala Ala Val Asp Asp Phe Pro Leu

35 40 45

Cys Val His Leu Val Ser Asn Glu Ile Glu Gln Leu Ser Ser Glu Ala

50 55 60

Leu Glu Ala Ala Arg Ile Cys Ala Asn Lys Tyr Ile Thr Thr Gln Ser

65 70 75 80

Gly Arg Asp Ser Phe His Leu Arg Ile Arg Val His Pro Tyr His Val

85 90 95

Leu Arg Ile Asn Lys Met Leu Ser Cys Ala Gly Ala Asp Arg Leu Gln

100 105 110

Gln Gly Met Arg Gly Ala Trp Gly Lys Pro His Gly Leu Ala Ala Arg

115 120 125

Val Thr Ile Gly Gln Ile Leu Met Ser Ile Arg Thr Lys Asp Ser Asn

130 135 140

Lys Ala Val Val Ile Glu Gly Leu Arg Arg Ser Arg Tyr Lys Phe Pro

145 150 155 160

Gly Gln Gln Lys Ile Ile Ile Ser Lys Lys Trp Gly Phe Thr Pro Leu

165 170 175

Asp Arg Glu Asp Tyr Ile Val Lys Arg Ala Ser Gly Glu Ile Arg Asp

180 185 190

Asp Gly Ala Tyr Val Lys Phe Leu Thr Lys Lys Gly Pro Leu Gln Glu

195 200 205

Asn Leu Glu Gln Phe Pro Asp Tyr Asn Tyr Ala Glu Ala Asn

210 215 220

<210> 2

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ile Tyr Leu Lys Thr Met Leu Lys Cys Ile Asp Asn Ser Gly Ala

1 5 10 15

Gln Met Val Glu Cys Ile Lys Val Leu Arg Lys Asn Pro Lys Asn Phe

20 25 30

Ala Ser Ile Gly Asp Lys Ile Val Cys Val Val Gln Lys Ala Arg Pro

35 40 45

Ser Thr Ser Thr Ile Thr Gly Ala Ser Ala Ser Asn Arg Val Lys Arg

50 55 60

Gly Asp Ile Val Arg Ala Val Ile Val Arg Thr Lys Lys Glu Thr Gln

65 70 75 80

Arg Pro Asp Gly Ser Val Ile Arg Phe Asp Asp Asn Ala Cys Val Leu

85 90 95

Leu Asn Lys Asn Asp Glu Pro Ile Ala Thr Arg Ile Ser Ser Val Val

100 105 110

Ala Lys Glu Leu Arg Asp Lys Asn Phe Asn Lys Ile Val Ser Leu Ala

115 120 125

Pro Lys Val Val

130

<210> 3

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ser Lys Arg Thr Lys Lys Val Gly Ile Ala Gly Lys Tyr Gly Val

1 5 10 15

Arg Tyr Gly Ser Ser Leu Arg Lys Gln Cys Lys Lys Leu Glu Thr Gln

20 25 30

Gln His Ala Lys Tyr Asp Cys Ala Phe Cys Gly Lys Lys Thr Val Lys

35 40 45

Arg Gln Ala Thr Gly Ile Trp Ser Cys Lys Ala Cys Lys Lys Thr Val

50 55 60

Ala Gly Gly Ala Tyr Thr Val Ser Thr Ala Ala Ala Ala Thr Val Arg

65 70 75 80

Ser Thr Ile Arg Arg Leu Arg Glu Met Ala Glu Ala

85 90

<210> 4

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggctagaa gaccagctag atgttacaga tactgcaaga acaagccgtt cccaaagtcc 60

agatacaacc gtggtgtccc agatcctaag atcagaattt atgacttggg tagaaagaag 120

gctgctgtcg atgacttccc attgtgtgtt cacttggttt ccaacgagat tgagcaactg 180

tcttccgagg ctttggaagc cgctcgtatc tgtgctaaca agtacattac cacacaatct 240

ggtagagatt cattccactt gagaatcaga gtccacccat accatgtctt acgtatcaac 300

aagatgttgt cttgtgccgg tgccgataga ttgcaacaag gtatgagagg tgcttggggt 360

aagccacacg gtttggccgc tcgtgtcacc attggtcaaa ttctgatgtc tatcagaacc 420

aaggactcta acaaggccgt cgttattgag ggtctcagaa gatcccgtta caagttccca 480

ggtcaacaaa agatcattat ctccaagaag tggggtttca ctccactgga ccgtgaggac 540

tacattgtca agagagctag tggtgagatc agagacgatg gtgcttacgt caagttcctg 600

accaagaagg gtcctttgca agagaacttg gagcaattcc cagactacaa ctacgccgag 660

gctaattag 669

<210> 5

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgatatacc ttaagacgat gcttaaatgc atcgacaatt ctggtgcgca gatggttgaa 60

tgcatcaagg tgttgagaaa gaacccgaag aactttgctt ccattggaga caagattgtc 120

tgtgtggtgc agaaggccag accttccact tccacgatca ctggtgcttc ggcttctaac 180

agagtcaaaa ggggagacat agtccgggca gttattgtga gaacaaagaa ggaaactcag 240

agaccagatg gttcagtgat cagatttgat gataacgcat gtgttctgtt gaacaagaat 300

gatgaaccca tagccaccag aatcagtagc gttgtagcca aggagctgcg tgacaagaac 360

tttaacaaaa tagtatcgtt ggcgcccaag gtcgtgtag 399

<210> 6

<211> 279

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgtctaaga gaactaagaa ggtaggaatt gccggtaaat atggtgtccg ttacggttca 60

tctctgagaa agcaatgtaa gaagttggag actcagcaac acgccaagta cgactgtgca 120

ttctgtggta agaagactgt caagagacag gctactggta tctggtcttg caaggcttgc 180

aagaagaccg ttgctggtgg tgcttacact gtttccactg ctgctgccgc cactgtcaga 240

tccaccatca gacgtttgag agagatggct gaggcatga 279

Claims

1.一种提高毕赤酵母中外源蛋白表达量的方法，其特征在于，所述方法是在表达外源目的蛋白的同时过表达核糖体蛋白RPL10、RPL38、RPL43中的任意一种或者多种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核糖体蛋白RPL10、RPL38、RPL43是来源于毕赤酵母的核糖体蛋白。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核糖体蛋白RPL10、RPL38、RPL43的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源目的蛋白是磷脂酶、脯氨酰内肽酶、脂肪酶、蛋白酶或糖化酶。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是在同一宿主中表达外源蛋白和所述核糖体蛋白。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主为毕赤酵母。

7.一种外源蛋白表达量提高的毕赤酵母重组菌，其特征在于，所述毕赤酵母重组菌在表达外源目的蛋白的基础上，还同时过表达了核糖体蛋白RPL10、RPL38、RPL43中的任意一种或者多种。

8.根据权利要求7所述的毕赤酵母重组菌，其特征在于，所述核糖体蛋白RPL10、RPL38、RPL43的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。

9.根据权利要求7所述的毕赤酵母重组菌，其特征在于，所述外源目的蛋白可以是磷脂酶、脯氨酰内肽酶、脂肪酶、蛋白酶或糖化酶。

10.权利要求7～9任一所述毕赤酵母重组菌的应用。