CN107075448B - 用于由真菌浆生产酶鸡尾酒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于由产生纤维素酶和/或半纤维素酶的纤维素水解微生物生产酶鸡尾酒的方法，所述方法包括：‑用于生产酶的步骤，其中获得含有酶和微生物浆的培养基；将所述浆与含有所述酶的液体分离或不分离，‑冷却所述浆至低于酶生产步骤温度的温度的步骤，持续一定时间使得源自冷却步骤的液体的β‑葡糖苷酶浓度大于源自酶生产步骤的液体的β‑葡糖苷酶浓度，和/或固体体积/总体积比率小于酶生产步骤的所述比率，和在冷却步骤结束时获得酶鸡尾酒。

Description

用于由真菌浆生产酶鸡尾酒的方法
本发明涉及改进纤维素水解酶和/或半纤维素水解酶的生产，特别是在由纤维素或木质纤维素材料生产乙醇的情形内。
后者这些由木质纤维素生物质生产，且就对用于生产生物燃料的农业用地的使用而言，相比于基于甘蔗、玉米、小麦、甜菜等的所谓的第一代产品造成较少的与食品生产竞争的问题。
各种技术-经济研究论证了降低纤维素酶的成本是用于起始于木质纤维素原材料来生物生产乙醇的方法的关键因素之一。
当前，工业纤维素酶主要由丝状真菌，里氏木霉（Trichoderma reesei）来生产，这是由于其高分泌能力。在用于生产纤维素酶的常规方法中，经由若干分离步骤在培养上清液中将其回收。
真菌浆（fungal must）（过滤后回收的固体部分）未被再利用。其被视为废料。
此外，由里氏木酶的高产菌株（hyper-producing strain）生产的酶鸡尾酒（enzymatic cocktail）在β-葡糖苷酶活性方面是不足的。
专利已经提出了以若干种方式改进生产菌株（producing strain）的方法：通过过表达基因（例如关于β-葡糖苷酶的过表达的专利申请EP2082054），或通过克隆源自其它微生物的更有效的β-葡糖苷酶（例如专利申请WO2013115305，其描述了对里氏木酶中的曲霉属的β-葡糖苷酶基因的克隆），亦或通过由β-葡糖苷酶的不同基因生成更有效的新基因（例如专利申请WO2010029259，其描述了通过L-Shuffling来生产具有改进活性的β-葡糖苷酶的变体）。
还从专利申请WO11079048已知，在SSF方法（同步水解和发酵）中，β-木糖苷酶活性的增加对酶促水解具有有益作用，这是因为其使得可以降低使用的酶的剂量。其还使得可以水解烷基木糖苷。
本发明提出了用于生产酶鸡尾酒的方法和适合于执行根据本发明的方法的设备，使得可以显著地、或甚至剧烈地增加β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶活性的鸡尾酒。
令人惊讶地，已经发现对根据本发明的方法的执行带来β-葡糖苷酶、滤纸酶（FPase）和β-木糖苷酶的比活性的显著改进。β-葡糖苷酶活性可为在普通条件下在酶生产结束时测量的活性的3至10倍；β-木糖苷酶的活性为3倍。
因此在常规酶生产步骤过程中与酶分离的真菌浆被再利用。该浆（must）相对于培养物的总质量占10-20质量%。
更为准确地，本发明涉及用于由生产纤维素酶和/或半纤维素酶的纤维素水解微生物生产酶鸡尾酒的方法，所述方法包括：
-用于生产酶的步骤，其中获得含有酶和微生物浆的培养基；将所述浆与含有所述酶的液体分离或不分离，
-冷却所述浆至包括在4至20℃之间的温度的步骤，所述温度是低于酶生产步骤温度的温度，持续一定时间使得：
-源自冷却步骤的液体的β-葡糖苷酶或β-木糖苷酶浓度大于源自酶生产步骤的液体的β-葡糖苷酶或β-木糖苷酶浓度，
和/或
-固体体积/总体积比率小于酶生产步骤的所述比率，
-和在冷却步骤结束时获得酶鸡尾酒。
有利地，冷却步骤的温度包括在4至20℃之间，且优选在4℃至18℃之间。
优选地，冷却步骤在包括在3.5至5.5之间，且优选大于4的pH下进行。
在一个优选的方式中，冷却步骤在贫氧气氛中，优选在无氧气氛中进行。
通常，注入中性气体，例如氮气或二氧化碳。
优选地，所述微生物属于木霉属，特别是里氏木霉，且优选为菌株CL847。
在冷却步骤之后，分离源自浆的酶鸡尾酒且获得残留的浆。
通常，分离借助至少一个离心或过滤/挤压或微滤进行，任选之前进行沉降。
可浓缩经分离的液体中的酶，例如通过超滤。
使用的微生物选自纤维素水解真菌或其它改性微生物。在一个优选的方式中，纤维素水解微生物属于木霉属、曲霉属、青霉属和裂褶菌属，其特别产生适合于纤维素和半纤维素完全水解（total hydrolysis）的纤维素酶和半纤维素酶。
在一个优选的方式中，使用的工业菌种属于里氏木霉物种；真菌通常已经被改性以改进通过诱变选育法（随机突变）来生产纤维素水解酶和/或半纤维素水解酶，例如为菌株IFP CL847（法国专利FR-B-2 555 803）。这些菌株是本领域技术人员公知的。
根据本发明的方法包括酶生产步骤，其中获得含有酶和微生物浆的培养基，和其中任选将所述浆与含有酶的液体分离。
菌株在被搅拌和充气的发酵罐中在与它们的生长和酶的生产相适应的条件下培养；这些条件是本领域技术人员已知的。引入用于生长的碳源和用于生产酶的诱导（inductive）源。碳源可为工业可溶性糖，例如葡萄糖、乳糖或木糖，或来自源自经预处理的生物质的单体形式的半纤维素级分的提取物。诱导碳源可选自乳糖、纤维二糖、槐糖和纤维素。水解残留物或经预处理的木质纤维素材料也可用作用于微生物生长和表达系统的诱导的碳源。后者的碳源也可被基因上改进的菌株且特别是重组菌株所用。
在酶生产步骤结束时，浆与液体分离或未与液体分离亦或可分离仅部分的浆。浆对应于真菌，对应于固体部分。液体含有酶。经分离的浆可被稀释（全部或部分）。经分离的浆优选被水稀释。
可对分离进行调整，特别是根据所需的活性。
分离可通过本领域技术人员已知的任何手段进行。优选地，可提及至少一个离心或一个过滤/挤压（压滤器）或微滤。离心之前任选进行沉降。可设想浓缩酶（例如通过超滤）的步骤。
根据本发明的方法继续进行将所述浆（经分离或未经分离）冷却至低于酶生产步骤温度的温度的步骤并持续特定的一段时间。
冷却步骤的温度有利地包括在4至20℃之间，且优选在4℃至18℃之间。
优选地，冷却步骤在包括在3.5至5.5之间，且优选大于4的pH下进行。将pH区间限定在β-葡糖苷酶开始失活的pH3和真菌的可能的孢子形成的pH6之间。
优选地，冷却步骤在贫氧气氛中，优选在无氧气氛中进行。通常，注入中性气体，例如氮气或二氧化碳。在贫氧气氛中已经观察到改进的产率，且最佳产率在无氧气氛中。在氧气的存在下，真菌可再次消耗酶。
通常，冷却持续最多120小时，优选12小时至90小时，优选地24至72小时是足够的，且通常为大约48小时。
在该冷却步骤过程中，建立了存在于浆中的真菌的自溶反应，自溶由酶产生。后者存在于未经分离的浆的液体中或它们为仍被保持在经分离的浆之内，且未能被分离的那些。
在实验上注意到，在根据本发明的方法的条件下，β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶活性非常显著地增加且生物质丸粒减少。
为了优化酶鸡尾酒的产率，可预先在实验室测试中确定冷却时间。
有利地，在执行该方法的过程中控制冷却时间，通过取样来监测反应进程。
冷却时间使得
-源自冷却步骤的液体的β-葡糖苷酶或β-木糖苷酶活性大于源自酶生产步骤的液体的β-葡糖苷酶或β-木糖苷酶活性，
和/或
-固体体积/总体积（生物质丸粒）比率小于酶生产步骤的所述比率。
为确定β-葡糖苷酶或芳基β-葡糖苷酶活性所使用的基质为对硝基苯基-ß-D-吡喃葡糖苷(PNPG)。其被β-葡糖苷酶所分割，释放对硝基苯酚。
芳基β-葡糖苷酶活性的一种单位定义为每分钟由PNPG产生1 μmol的对硝基苯酚所需的酶的量，且以IU/mL表达。
为确定β-木糖苷酶活性所使用的基质为对硝基苯基-ß-D-吡喃木糖苷，根据相同的原理。
这些参数由测量确定。
已经观察到，在该方法过程中，β-葡糖苷酶的浓度增加，达到最大然后降低。同时，已经观察到生物质丸粒减少。
举例而言，已经注意到通常释放的液体的量相当于经分离的浆的原始重量的至少10%，且最经常为30-40%，且关于β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶活性测量的蛋白质的浓度增至3倍。
基于该信息确定冷却时间在本领域技术人员的能力之内。
在冷却步骤之后，可将酶鸡尾酒（液体部分）与残留固体分离或不分离；优选将其分离。
分离手段是之前描述的那些。
已经注意到，当在培养刚结束时未分离浆时，该分离更为困难、更需谨慎处理。
此外，在一个非常优选的方式中，浆的分离在冷却步骤之前进行，优选使用压滤器。优选地，至少95%的浆被分离且在还更优选的方式中全部的浆与液体分离。在此将“全部”理解为与所使用的分离方法有关。
优选地，将源自冷却步骤的所述酶鸡尾酒与源自酶生产步骤的酶混合，所述鸡尾酒以全部或部分混合。
所述鸡尾酒（经混合或未经混合）用于酶促水解中。
残留的浆可经受新的冷却步骤，任选但优选地，随后分离新的酶鸡尾酒。
这些步骤的条件为之前描述的那些。
在此说明一个附加的冷却步骤，但其数量不受限制。
因此，本发明还涉及执行前述步骤的方法，其中所述残留的浆经受冷却步骤，且在冷却步骤结束时获得与残留的浆分离或未分离的酶鸡尾酒。优选地，所述鸡尾酒与在所述冷却步骤结束时获得的残留的浆分离。
优选地，将源自冷却步骤的酶鸡尾酒混合。优选地，将它们与源自酶生产步骤的酶混合。
通常，可将各鸡尾酒彼此混合和/或与源自酶生产步骤的酶混合。混合物的各组分的比例根据所述混合物的用途来确定。优选地，鸡尾酒和酶以它们的全部混合。
至少一种鸡尾酒（经混合或未经混合）用于酶促水解中。
从图1至6将更好地理解本发明。图7至13关于实施例。
图1描述了在酶生产步骤和冷却步骤之间具有分离步骤的优选实施方案。图2是对不具有浆的分离的表述。在图3和图4中，将附加的冷却步骤分别添加到图1和图2中。
图5显示了合并存在或不存在分离的一个实施方案。
图6显示了在冷却步骤之前和/或之后的浆分离步骤的一个优选实施方案。
根据图1，将碳源和诱导源（管道1），以及产生纤维素酶和/或半纤维素酶的纤维素水解微生物（管道3）和所需的营养物（管道4）引入酶生产步骤（酶生产区域2）。
将获得的产物分离（分离区域5）成含有酶的液体（管道6）并回收含有真菌和其中保持的酶的浆（管道7）。
使浆经受冷却步骤（冷却区域8）。
在一个实施方案中，将液体从酶生产区域（反应器）抽出，且浆保留在所述区域中，在其中所述浆被冷却。
在另一优选实施方案中，将培养基从酶生产区域抽出，并以分离手段（过滤/挤压，离心等）分离，优选在沉降并抽出液体之后，以获得浆。将该浆引入冷却区域，其可为酶生产区域的反应器（在非连续过程的情况下）或另一反应器（在连续过程的情况下）。
将经冷却的浆（管道9）分离（区域10）成含有酶鸡尾酒的液体（管道11）和为残留的浆的固体（管道12）。
将管道6和11的流中的酶混合并送至（管道13）酶促水解区域(14)。
图3重复了该图示，增加了冷却步骤。
使残留的浆（浆12）经受附加的冷却步骤（冷却区域15）。
以与之前相同的方式，送入附加的冷却步骤（区域15）的浆在第一冷却步骤（区域8）之后可能未在区域10中分离。
将经冷却的浆（管道16）分离（区域17）成含有酶鸡尾酒的液体（管道19）和为残留的浆的固体（管道18）。
将管道19的流中的酶与源自酶生产步骤（管道6）、第一冷却步骤（管道11）的流的酶混合并送至（管道20）酶促水解区域(14)。
图1的附图标记将在图2中得到识别。将酶生产步骤之后的分离步骤（区域5）省略。
上述情况也适用于基于图2的图4，且图4包括附加的冷却步骤，关于该增加的附图标记取自图3。
还可将存在一个分离且不存在其它分离合并于一个图示中。这例如在图5中得到例示。其显示了在酶生产步骤结束时存在分离（区域5），在第一冷却步骤（区域8）结束时和在附加的冷却步骤之前不存在分离，以及在附加的冷却步骤之后存在分离（区域17）。
图6显示在冷却步骤之前和/或之后的浆分离步骤的一个优选实施方案。
参照图1，其为区域5和/或区域10的一个实施方案。
在酶生产区域2结束时，在沉降步骤（区域30）中将培养基分离，真菌位于沉降的淤渣中（管道31）并使获得的浑浊液体（管道32）经过离心步骤（离心区域33）。这产生含有真菌的膏状物（管道34）和澄清液体（管道35）。为了实现分离，使澄清液体经过微滤步骤（区域36），渗余物（管道37）含有真菌，且渗透物（管道38）含有酶。
可将含有真菌的不同的流（淤渣、膏状物、渗余物）混合并构成将送至冷却步骤的浆或构成将经受或不经受新的冷却步骤的残留的浆。
为了浓缩酶，使渗透物经过超滤步骤。然后获得经浓缩的酶的渗余物（管道40），以及可在方法中再利用的渗透物（管道41）。
将注意到全部沉降和离心步骤可被一个过滤/挤压（压滤器）替代。
实施例
实施例1：针对图7至9
图7是分离后和冷却步骤前的里氏木霉CL847浆的照片。
图8显示培养上清液中蛋白质浓度的变化。
图9显示在生产步骤结束时和在4℃下冷却真菌72小时之后测量的β-葡糖苷酶活性。
纤维素酶的生产在机械搅拌下的20 L生物反应器（其12中 L可用）中进行。矿物培养基具有以下组成：KOH 1.66 g/L、H3PO4 85% 2 mL/L、(NH4)2SO4 2.8 g/L、MgSO4·7 H2O0.6 g/L、CaCl2 0.6 g/L、MnSO4 3.2 mg/L、ZnSO4·7 H2O 2.8 mg/L、CoCl2 10 4.0 mg/L、FeSO4·7 H2O 10 mg/L、玉米浆 1.2 g/L、消泡剂0.5 mL/L。
将含有矿物培养基的生物反应器在120℃下消毒20分钟，将葡萄糖含碳源在120℃下单独消毒20分钟，然后无菌添加至生物反应器内以具有30 g/L的最终浓度。
在10% (v/v)下用里氏木霉CL847的菌株的预培养物来接种生物反应器。预培养物的矿物培养基与生物反应器的矿物培养基相同，除了以5 g/L添加酞酸钾以缓冲pH。真菌在预培养物中的生长使用在30 g/L浓度下的葡萄糖作为含碳基质进行。接种物的生长持续2至3天并在28℃下在搅拌的培育器中进行。如果残留的葡萄糖浓度小于15 g/L，进行转移至生物反应器。
在生物反应器中进行的生产实验包括两个阶段：
-在27℃的温度下和在4.8的pH下（用5.5 M氨调节）在葡萄糖含碳基质（初始浓度=30 g/L）上的生长阶段。充气在0.5 vvm下且根据pO2（溶解氧压力）（保持其高于30%）搅拌在200和800 rpm之间增强。
-酶生产阶段。当发酵器的原始基质被耗尽时，在每克细胞和每小时35至45毫克的流量下连续注入250 g/L下的乳糖溶液直至164小时。温度降低至25℃且pH降低至4直到培养结束。通过添加5.5 N氨溶液来调整pH，所述氨供应合成分泌蛋白质（excreted protein）所需的氮。通过充气和搅拌作用保持溶解氧含量高于15至20%。
酶生产之后进行在分离菌丝体（通过过滤）或形成的细胞后的通过Lowry法和BSA标准进行的细胞外蛋白质的测定。获得的蛋白质的最终浓度等于45 g/L。
该生产步骤之后进行将真菌浆与培养上清液分离。挤压该浆以提取最大量的上清液（图7）并称重。将后者置于4℃下的密闭容器中72小时。
每24小时取在真菌的自溶后释放的上清液样品直至72小时。
在72小时后确定液体重量。其相当于浆重量的30%。蛋白质浓度的测定示于图8中。可以看到相对于酶生产结束时浓度以及β-葡糖苷酶活性增至3倍（图9）。
实施例2：针对图10至13
图10显示在培养结束时和在4℃和20℃下真菌自溶72小时后测量的β-葡糖苷酶活性。
图11显示在两个分离系列之后获得的β-葡糖苷酶比活性(IU/mg)。
图12显示在两个分离系列之后获得的滤纸酶比活性(IU/mg)。
图13对应于在分离步骤中对酶的确认。
该方法在6m3试验装置中执行。将真菌里氏木霉CL847在与实施例1中描述的相同条件下培养。在生产阶段结束时，以4个步骤将酶分离：沉降步骤，离心步骤，微滤步骤和超滤步骤。
该四个步骤图示显示于图6中。头三个步骤用于去除真菌且最后一个步骤（超滤）用于浓缩所生产的酶。
将回收的全部真菌级分（沉降器淤渣，离心机膏状物和微滤渗余物）置于生物反应器中，在8℃下冷却72小时并用水稀释至等于4m3的最终体积。浆经历第二分离系列：离心机，微滤和超滤。
在第二分离系列结束时回收的酶的量类似于在第一分离系列结束时获得的量，即在第一分离系列之后为大约70 kg蛋白质且在第二分离系列之后为64 kg。
相比之下，令人关注的是注意到针对获得的酶鸡尾酒的β-葡糖苷酶活性（图11）和滤纸酶活性（图12）在冷却步骤（真菌自溶）之后大20%。回收的酶鸡尾酒因此有效得多。
进行双向电泳以观察在分离步骤过程中是否存在对酶鸡尾酒的组成的显著更改。起始于使用FPLC[快速蛋白质液体色谱]预先脱盐的样品，在2D凝胶上200 µg沉积物以及考马斯亮蓝染色的情况下，根据蛋白质的分子量和它们的等电点对其进行分离。
经扫描的凝胶示于图13中；图13a对应于膏状物且图13b对应于澄清液体。
在离心步骤中在澄清液体和膏状物中确认主要的酶。注意到凝胶特征（profile）的显著不同。离心膏状物显示β-木糖苷酶。在pnp-木糖上测量该活性以用于确认，且发现在膏状物中的比活性为在生产结束时获得的酶鸡尾酒中的比活性的大约3倍（在膏状物中为1.2 IU/mg，且在来自发酵器的最终样品中为0.4 IU/mg）。

Claims (23)

1.用于由生产纤维素酶和/或半纤维素酶的纤维素水解微生物生产酶鸡尾酒的方法，所述方法包括：
-用于生产酶的步骤，其中获得含有酶和微生物浆的培养基；将所述浆与含有所述酶的液体分离或不分离，
-冷却所述浆至4至20℃之间的温度的步骤，所述温度是低于酶生产步骤温度的温度，持续12-90个小时的一定时间使得：
-源自冷却步骤的液体的β-葡糖苷酶或β-木糖苷酶浓度大于源自酶生产步骤的液体的β-葡糖苷酶或β-木糖苷酶浓度，
和/或
-固体体积/总体积比率小于酶生产步骤的所述比率，
-和在冷却步骤结束时获得酶鸡尾酒。
2.根据权利要求1的方法，其中所述冷却步骤的持续时间为24-72个小时。
3.根据权利要求1-2任一项的方法，其中在酶生产步骤结束时，将浆与液体分离。
4.根据权利要求1-2任一项的方法，其中用水稀释所述经分离的浆。
5.根据权利要求1或2的方法，其中在酶生产阶段结束时，不将浆与液体分离。
6.根据权利要求1-2任一项的方法，其中在冷却步骤后，将源自浆的酶鸡尾酒分离并获得残留的浆。
7.根据权利要求3的方法，其中分离借助至少一个离心或过滤/挤压或微滤进行，任选之前进行沉降。
8.根据权利要求4的方法，其中分离借助至少一个离心或过滤/挤压或微滤进行，任选之前进行沉降。
9.根据权利要求6的方法，其中分离借助至少一个离心或过滤/挤压或微滤进行，任选之前进行沉降。
10.根据权利要求6的方法，其中将经分离的液体的酶浓缩。
11.根据权利要求6的方法，其中将经分离的液体的酶通过超滤浓缩。
12.根据权利要求1-2和7-11任一项的方法，其中冷却步骤在3.5至5.5之间的pH下进行。
13.根据权利要求1-2和7-11任一项的方法，其中冷却步骤在贫氧气氛中进行。
14.根据权利要求1-2和7-11任一项的方法，其中冷却步骤在无氧气氛中进行。
15.根据权利要求1-2和7-11任一项的方法，其中注入中性气体。
16.根据权利要求1-2和7-11任一项的方法，其中注入二氧化碳或氮气。
17.根据权利要求1-2和7-11任一项的方法，其中所述微生物属于木霉属。
18.根据权利要求1-2和7-11任一项的方法，其中所述微生物属于里氏木霉。
19.根据权利要求1-2和7-11任一项的方法，其中所述微生物为菌株CL847。
20.根据权利要求6的方法，其中所述残留的浆经受冷却步骤，且在冷却步骤结束时获得与残留的浆分离或未分离的酶鸡尾酒。
21.根据权利要求20的方法，其中所述酶鸡尾酒与所述冷却步骤的残留的浆分离。
22.根据权利要求1-2和7-11任一项的方法，其中将源自浆的酶鸡尾酒混合。
23.根据权利要求1-2和7-11任一项的方法，其中将至少一种酶鸡尾酒与含有酶的和源自酶生产步骤的经分离的液体混合。
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