KR101953376B1

KR101953376B1 - 돌연 변이된 아스퍼질러스 아쿠레아투스 균주 및 이를 이용한 바이오매스유래 유용산물 제조방법

Info

Publication number: KR101953376B1
Application number: KR1020170123663A
Authority: KR
Inventors: 배현종; 웽?안; 조은진
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2017-09-25
Filing date: 2017-09-25
Publication date: 2019-02-28

Abstract

본 발명은 바이오매스유래 유용산물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 바이오매스를 처리하기에 적합한 효소 생산량이 증가하도록 돌연 변이된 아스퍼질러스 아쿠레아투스 균주 및 이를 이용한 바이오매스유래 유용산물 제조방법에 관한 것이다.

Description

돌연 변이된 아스퍼질러스 아쿠레아투스 균주 및 이를 이용한 바이오매스유래 유용산물 제조방법{Mutants of Aspergillus aculeatus, method for producing the same, and production method of biomass derived products}

본 발명은 바이오매스유래 유용산물 제조기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 바이오매스를 처리하기에 적합한 효소 생산량이 증가하도록 돌연 변이된 아스퍼질러스 아쿠레아투스 균주 및 이를 이용한 바이오매스유래 유용산물 제조방법에 관한 것이다.

아스퍼질러스종(Aspergillus species)은 식물 리그노셀룰로오스 분해에 관여하는 가수 분해 및 산화 효소들의 다양한 어레이와 함께 토양에서 발견되는 미생물 군집의 통상 구성원으로서 중요한 효소원이며 전 지구 탄소순환에 중요한 역할을 한다. 중요한 탄소 플럭스 유전자의 비 암호화 영역에서 조절 도메인의 발견은 탄소 순환에 관여하는 "회로"를 확인하고 특성화하는데 도움이 될 것이다. 또한, 아스퍼질러스 종은 진핵 세포 단백질 분비, 다양한 바이오매스 분해 효소의 송달을 억제 또는 발동에 대한 다양한 환경 요인의 영향, 발효 공정 개발에 중요한 분자 메커니즘 및 곰팡이 형태의 조절과 관련된 메커니즘의 연구 위한 중요한 모델이다.

아스퍼질러스 아쿠레아투스(Aspergillus aculeatus)는 일반적으로 토양과 썩은 과일에서 분리되는 유비쿼터스 종이다. 다른 검은 포자가 있는 아스퍼질러스종과 마찬가지로, 색깔, 모양, 크기 및 분생과 같은 형태학적 기준이 균주를 분류하는 데 사용되어왔다. 그러나 검은 아스퍼질러스들(aspergilli)는 형태학적 및 생리학적 특성이 크게 다르며 단리물을 모호하지 않게 식별하려면 분자 및 생화학적 식별 기술이 필요하다.

아스퍼질러스 아쿠레아투스(A. aculeatus) 분리균은 식물 세포벽을 빠르게 분해 할 수 있기 때문에 식품 및 사료 산업에서 상업적으로 사용되는 여러 가지 중요한 산업효소(셀룰라아제, 헤미셀룰라제, 프로테아제)를 생산하는 데 사용되었다. 그것의 산업적 가치 때문에 아스퍼질러스 아쿠레아투스(A. aculeatus)로부터 유래된 여러 엑소셀룰라제 즉 세포외 글리코실 가수분해 효소의 생화학적 및 촉매적 특성이 상세히 연구되었다. 또한 여러 A. aculeatus 다당 분해 효소는 X 선 결정학에 의해 구조적 수준에서 연구되어왔다.

이와 같이, 균주로부터 생산되는 효소는 산업적으로 많이 이용되고 있는데, 산업적으로 이용되는 효소를 저비용으로 대량생산 한다면 생산단가를 낮출 수 있기 때문에 많은 연구가 진행되고 있다. 배양 조건의 변화 그리고 유전자의 변형 등을 이용하여 효소 생산을 증가 시킬 수 있는데 배양 조건의 변화를 통한 생산량을 증가시키는 방법도 중요하지만 증가량의 한계가 있기 때문에 유전자 변형을 통한 균주 개량 방법이 많이 사용되고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 펙티나제(pectinase) 생산균주로 알려진 아스퍼질러스 아쿠레아투스(Aspergillus aculeatus)의 효소 생산량을 증가시킬 수 있는 염기서열을 갖도록 돌연변이시켜 펙틴분해활성, CMC분해활성 및 자일란(xylan)분해활성 중 하나 이상이 강화된 아스퍼질러스 아쿠레아투스 변이균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 아스퍼질러스 아쿠레아투스 변이균주를 이용하여 제조된 바이오매스유래 유용산물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 creA유전자인 서열번호 1 및 creB유전자인 서열번호 2 중 하나 이상이 돌연 변이된 아스퍼질러스 아쿠레아투스 변이균주를 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 돌연변이는 상기 creA유전자인 서열번호 1 및 상기 creB유전자인 서열번호 2 중 하나 이상이 결실되어 이루어진다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 균주는 펙틴분해활성, CMC분해활성 및 자일란(xylan)분해활성 중 하나 이상이 증가된 것이다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 균주는 상기 creA유전자인 서열번호 1 및 상기 creB유전자인 서열번호 2가 모두 결실된 아스퍼질러스 아쿠레아투스 BRI4(Aspergillus aculeatus BRI4 - 기탁번호 : KCCM12079P)이다.

또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 아스퍼질러스 아쿠레아투스 변이균주를 배양한 후 상기 변이균주를 제거하여 얻어진 분해효소포함배양액을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 배양은 상기 아스퍼질러스 아쿠레아투스 변이균주를 배지에 접종한 후 25℃~40℃ 온도에서 교반하면서 7~15일간 수행된다.

또한, 본 발명은 바이오매스 전처리단계; 및 상기 전처리바이오매스에 제 5 항의 분해효소포함배양액 및 셀룰라아제를 처리하여 상기 전처리바이오매스를 가수 분해시키는 당화단계; 및 상기 당화단계에서 얻어진 당화액을 발효시키는 발효단계;를 포함하는 기능성 당 및 바이오에탄올 제조방법을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서,상기 바이오매스가 커피찌꺼기이고, 상기 기능성 당이 D-mannose이다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 전처리단계는 커피찌꺼기를 알코올에 침지하는 단계; 및 침지된 상태로 100 내지 150℃의 온도에서 일정시간 반응시키는 단계;를 포함하여 수행된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 당화단계는 상기 전처리바이오매스를 버퍼에 첨가하여 일정농도의 반응물을 준비하는 단계; 상기 반응물에 상기 분해효소포함배양액 및 셀룰라아제를 처리하여 가수분해를 수행하는 단계; 상기 가수분해액을 가열하여 효소반응을 종결하는 단계; 및 상기 가수분해액을 원심분리하여 상등액을 얻는 단계;를 포함한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 반응물 10중량% 농도 당 상기 분해효소포함배양액 14.4 IU/mg및 상기 셀룰라아제 0.22 FPU/mg가 처리된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 발효단계는 pH가 5~9인 조건에서 수행된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 발효단계에서 얻어진 발효액을 바이오에탄올과 D-만노스로 분리하는 분리단계;를 더 포함한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 발효단계에서 얻어진 발효액에 포함된 D-만노스의 색소를 제거하는 색소제거단계;를 더 포함한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 색소제거단계는 상기 발효액에 활성탄을 첨가하여 교반하는 단계; 및 상기 첨가된 활성탄을 제거하는 단계;를 포함한다.

먼저, 본 발명에 의하면 펙티나제(pectinase) 생산균주로 알려진 아스퍼질러스 아쿠레아투스(Aspergillus aculeatus)의 효소 생산량을 증가시킬 수 있어 펙틴분해활성, CMC분해활성 및 자일란(xylan)분해활성 중 하나 이상이 강화된 아스퍼질러스 아쿠레아투스 변이균주를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면 아스퍼질러스 아쿠레아투스 변이균주를 이용하여 바이오매스 특히 버려지는 커피찌꺼기로부터 매우 효율적으로 바이오에탄올과 D-만노스를 제조할 수 있다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 돌연변이체 제작시 사용된 pUC-pyrGΔ의 제작 모식도이다.
도 2는 wild type A. aculeatus에서 Homologous recombination을 이용한 pyrG 제거에 대한 모식도이다.
도 3은 pFlox vector의 구조도이다.
도 4a Homologous recombination을 이용한 creA와 creB의 제거에 대한 모식도이고, 도 4b는 형질전환 균주의 배양사진이다.
도 5는 PCR을 통한 creA와 creB의 돌연변이 균주의 선별 결과사진이다.
도 6은 Cre-loxP recombination system을 이용한 selectable maker의 제거에 대한 모식도이다.
도 7a 및 도 7b는 PCR을 통한 creA, creB 돌연변이 균주의 선별결과 사진이다.
도 8a는 wild type과 돌연변이균주들의 단백질생산량을 나타낸 결과그래프이고, 도 8b는 wild type과 돌연변이균주들의 pectin 분해활성을 나타낸 결과그래프이며, 도 8c는 wild type과 돌연변이균주들의 CMC 분해활성을 나타낸 결과그래프이며, 도 8d는 wild type과 돌연변이균주들의 자일란 분해활성을 나타낸 결과그래프이다.
도 9는 각 균주들의 양파 분해 활성을 나타낸 결과그래프이다.
도 10은 본 발명의 돌연변이균주를 만드는 과정을 도시한 흐름도이다.
도 11은 본 발명의 돌연변이균주를 이용하여 커피찌꺼기로부터 유용산물을 얻는 공정을 도시한 개략도이다.
도 12a는 본 발명의 전처리단계로 전처리된 커피찌꺼기의 표면을 현미경관찰하여 찍은 결과사진이고, 도 12b는 전처리되지 않은 커피찌꺼기의 당화효율을 조사한 결과 그래프이며, 도 12c는 전처리된 커피찌꺼기의 당화효율을 조사한 결과 그래프이다.
도 13a 내지 도 13c는 본 발명의 발효단계에서 사용된 효모종류에 따른 에탄올과 D-만노스의 생산효율을 보여주는 결과그래프이다.
도 14는 본 발명의 색소제거단계 후 얻어진 발효액의 특성을 보여주는 결과사진이다.
도 15는 본 발명의 에탄올과 D-만노스 분리단계에서 공급액(In-feed solution)과 트랩 내부 투과액(In-product solution)의 농도를 HPLC를 이용하여 분석한 결과 그래프이다.
도 16은 본 발명의 에탄올과 D-만노스 분리단계에서에서 얻어진 D-만노스의 성분분석결과 그래프이다.

본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.

이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

본 발명의 기술적 특징은 펙티나제(pectinase) 생산균주로 알려진 아스퍼질러스 아쿠레아투스(Aspergillus aculeatus)의 효소 생산량이 증가될 수 있도록 염기서열에 돌연변이를 일으켜 펙틴분해활성, CMC분해활성 및 자일란(xylan)분해활성 중 하나 이상이 강화된 아스퍼질러스 아쿠레아투스 변이균주를 개발한 것에 있다.

따라서, 본 발명은 creA유전자인 서열번호 1 및 creB유전자인 서열번호 2 중 하나 이상이 돌연 변이된 아스퍼질러스 아쿠레아투스 변이균주를 제공한다.

여기서, 돌연변이는 상기 creA유전자인 서열번호 1 및 상기 creB유전자인 서열번호 2 중 하나 이상이 결실되어 이루어지는데, 이와 같이 염기서열에 돌연변이가 일어난 균주는 펙틴분해활성, CMC분해활성 및 자일란(xylan)분해활성 중 하나 이상이 증가되는 특성을 나타낸다.

본 발명에서 변이균주를 얻기 위해 wild type으로 사용된 아스퍼질러스 아쿠레아투스 균주는 아스퍼질러스 아쿠레아투스 균주이기만 하면 제한되지 않으나, Aspergillus aculeatus (ATCC 16872)를 입수하여 사용하였다.

본 발명에서의 돌연변이를 유발시키는 방법은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 creA유전자 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 creB유전자 중 하나 이상을 결실시키는 것인데, 결실 돌연변이를 일으킬 수 있는 공지된 모든 기술적 구성이 사용될 수 있다. 본 발명에서는 일 구현예로서 A. aculeatus에 사용 가능한 새로운 vector를 제작하여 돌연변이를 수행하였다.

본 발명에서는 특히 creA유전자인 서열번호 1 및 creB유전자인 서열번호 2가 모두 결실된 아스퍼질러스 아쿠레아투스를 제작하고, 아스퍼질러스 아쿠레아투스 BRI4(Aspergillus aculeatus BRI4)로 명명하여 한국미생물보존센터에 2017년 7월 13일자로 기탁번호 KCCM12079P로 기탁하였다.

또한, 본 발명의 분해효소포함배양액은 전처리된 바이오매스를 당화시키기 위해 사용될 수 있는데, 상술된 creA유전자인 서열번호 1 및 creB유전자인 서열번호 2 중 하나 이상이 돌연 변이된 아스퍼질러스 아쿠레아투스 변이균주를 배양한 후 배양액으로부터 변이균주를 제거하여 얻어진 것이다. 여기서, 배양은 아스퍼질러스 아쿠레아투스 변이균주를 배지에 접종한 후 25℃~40℃ 온도에서 교반하면서 7~15일간 수행될 수 있는데, 배양조건은 실험적으로 결정된 것이다.

다음으로, 본 발명의 기능성 당 및 바이오에탄올 제조방법은 바이오매스 전처리단계; 상기 전처리바이오매스에 제 5 항의 분해효소포함배양액 및 셀룰라아제를 처리하여 상기 전처리바이오매스를 가수 분해시키는 당화단계; 및 상기 당화단계에서 얻어진 당화액을 발효시키는 발효단계;를 포함할 수 있다. 필요한 경우 발효단계에서 얻어진 발효액에 포함된 D-만노스의 색소를 제거하는 색소제거단계 및 발효단계에서 얻어진 발효액을 바이오에탄올과 D-만노스로 분리하는 분리단계가 하나 이상 더 수행될 수 있다.

특히, 본 발명의 제조방법에서 사용되는 바이오매스가 커피찌꺼기이고, 얻어지는 기능성 당이 D-mannose인 경우 전처리 단계, 당화단계, 발효단계, 색소제거단계 및/또는 분리단계는 다음과 같이 수행될 수 있다.

전처리단계는 커피찌꺼기를 알코올에 침지하는 단계; 및 침지된 상태로 100 내지 150℃의 온도에서 일정시간 반응시키는 단계;를 포함하여 수행될 수 있다.

당화단계는 상기 전처리바이오매스를 버퍼에 첨가하여 일정농도의 반응물을 준비하는 단계; 상기 반응물에 상기 분해효소포함배양액 및 셀룰라아제를 처리하여 가수분해를 수행하는 단계; 상기 가수분해액을 가열하여 효소반응을 종결하는 단계; 및 상기 가수분해액을 원심분리하여 상등액을 얻는 단계;를 포함하여 수행될 수 있다. 여기서, 당화단계의 일구현예로서 반응물 10중량% 농도 당 분해효소포함배양액 14.4 IU/mg 및 셀룰라아제 0.22 FPU/mg가 처리될 수 있다.

발효단계는 사용되는 효모가 생존할 수 있는 pH조건이기만 하면 제한되지 않지만, 실험적으로 pH가 5~9인 조건에서 에탄올과 만노스의 생산 효율이 높았다.

색소제거단계는 발효액에 활성탄을 첨가하여 교반하는 단계; 및 상기 첨가된 활성탄을 제거하는 단계;를 포함할 수 있는데, 사용되는 활성탄의 입자크기는 5-15μm일 수 있고, 활성탄 제거는 활성탄의 입자크기보다 작은 직경의 구멍을 갖는 여과필터를 사용하여 이루어질 수 있다.

분리단계는 바이오에탄올과 D-만노스가 포함된 발효액을 투과막 증발 방법으로 분리할 수 있다.

본 발명에서 바이오매스로 커피찌꺼기를 사용하는 이유는 중국을 비롯한 여러 나라에서 커피소비량이 점차로 늘어남에 따라 커피찌꺼기의 배출량 또한 현저히 증가하고 있고, 커피찌꺼기는 생활폐기물로 분류되어 매립 또는 소각하므로 그 처리비용과 환경적 문제가 함께 대두되고 있는데, 커피찌꺼기는 바이오에너지 생산 원료의 수급이 어려운 우리나라 상황을 고려해봤을 때 원료의 확보성이 용이하고 원료 생산비용이 들지 않는다는 장점을 지니고 있을 뿐만 아니라 버려지는 커피찌꺼기를 확보하여 에너지로 재활용한다는 측면에서 친환경적이라 할 수 있기 때문이다.

또한, 커피찌꺼기에는 D-만노스(D-Mannose)가 다른 바이오매스에 비해 다량포함 되어 있는데, D-만노스는 밀접 포도당이나 과당 등과 같은 단당류에 속하며 요즘 각광 받고 있는 당으로써, E. coli(대장균)에 달라붙어 방광과 신장 속 E. coli(대장균)를 배출 시켜준다고 하며, 항생제와 달리 몸에 어떠한 해도 없으며, 꾸준하게 복용할 경우 예방도 된다고 알려 있다.

한편, 이와 같이 유용한 기능성 당인 D-만노스를 전처리된 커피찌꺼기를 당화시켜 얻어진 당화액으로부터 분리하려면 그 정제가 매우 어려운데, 본 발명의 제조방법에 의하면 이러한 문제점을 해결하여 당화액을 발효시킨 발효액에서 분리함으로써 매우 용이하게 정제된 D-만노스를 얻을 수 있는 장점이 있다. 필요한 경우 발효액에서 에탄올과 D-만노스를 분리하기 전에, 발효액 상태에서 D-만노스의 색소를 활성탄을 이용하여 제거함으로써 상품성이 우수한 D-만노스를 생산할 수 있다.

실시예 1. 아스퍼질러스 아쿠레아투스BRI4(Aspergillus aculeatus BRI4 : A. aculeatus BRI4 )제조

도 10에 도시된 바와 같이 다음과 같은 방법으로 A. aculeatus BRI4를 제조하였다.

1.pUC-pyrGΔ 벡터제작

먼저, 도 1에 도시된 바와 같이 돌연변이체를 선별할 selectable marker는 uracil 합성에 관련된 효소인 orotidine-5'-decarboxylase의 유전자(pyrG)를 사용하기로 하고, wild type A. aculeatus는 pyrG 유전자를 가지고 있기 때문에 이 유전자를 homologous recombination을 이용하여 제거하기로 했다. A. aculeatus pyrG의 upstream과 downstream 부분을 PCR을 이용하여 증폭시켰고 두 부분을 연결하여 pUC18 vector에 삽입, pUC-pyrGΔ를 만들었다.

2. A. aculeatus BRI(ΔpyrG) 제작

도 2에 도시된 바와 같이 pUC-pyrGΔ를 주형으로 사용하여 PCR로 upstream과 downstream이 연결된 pyrGΔ를 증폭하였다. pyrGΔ의 transformation은 protoplast법을 사용하였으며 A. aculeatus BRI(ΔpyrG)를 만들었다.

3. pFlox vector 제작

도 3에 도시된 바와 같이 creA와 creB를 제거하기 위해서 vector의 selectable marker는 A. nidulans의 pyrG 유전자를 사용하였고 pyrG 의 양쪽 끝에 loxP site를 삽입하여 Cre-loxP recombination system을 이용할 수 있게 고안한 pFlox vector를 만들었다.

4. pFlox-creAΔ 및 pFlox-creBΔ 제작

creA와 creB, 두 유전자의 upstream과 downstream 부분을 각각 PCR로 증폭하였고 두 부분을 연결하여 pFlox vector에 삽입, pFlox-creAΔ와 pFlox-creBΔ를 만들었다.

5. 형질전환을 통해 A. aculeatus BRI1(ΔcreA) 및 A. aculeatus BRI2(ΔcreA) 제작

도 4a에 도시된 바와 같이 두 vector를 XbaI으로 절단하여 선형 DNA 가닥을 만들어준 후 protoplast 법을 사용하여 A. aculeatus BRI에 형질전환 시켰다. 선별된 균주의 돌연변이 유무를 확인하기 위하여 각각 creA id와 creB id primer 그리고 pFlox id primer를 사용하여 PCR을 하였고 도 5에 도시된 바와 같이 A. aculeatus BRI1(ΔcreA)와 A. aculeatus BRI2(ΔcreA)를 최종선별하게 되었다. 도 5에서 1,2: creA 돌연변이 균주, 3,6: wild type, 4: creB돌연변이 실패균주, 5: creB 돌연변이 균주이다.

6. A. aculeatus BRI3 제작

도 6에 도시된 바와 같이 creA와 creB, 두 유전자를 동시에 제거된 균주를 만들기 위해서 A. aculeatus BRI1에 형질전환된 selectable maker(pyrG) 유전자를 제거하기로 했다. Cre recombinase 유전자가 삽입된 pCREX를 protoplast 법을 사용하여 A. aculeatus BRI1에 형질전환 시켰고 Cre-loxP recombination system을 이용하여 selectable maker를 제거된 A. aculeatus BRI3를 만들었다.

7. A. aculeatus BRI4((ΔcreA, ΔcreB) 제작

도 7a 및 도 7b에 도시된 바와 같이 pFlox-creBΔ를 XbaI으로 절단하여 protoplast 법을 사용하여 A. aculeatus BRI3에 형질전환 시켰고 creB id primer와 pFlox id primer를 사용하여 PCR을 하여 A. aculeatus BRI4((ΔcreA, ΔcreB)를 최종 선별하였다. 그 후 A. aculeatus BRI4로 명명된 변이균주를 한국미생물보존센터에 2017년 7월 13일자로 기탁하여 KCCM12079P의 기탁번호를 부여받았다. 도 7a는 creA id+pFlox id primer로 PCR한 결과이고, 도 7b는 creB id+pFlox id primer로 PCR한 결과이며, 1~5: 선별 배지에서 나타난 colony이다.

실시예 2.

실시예 1에서 제작된 A. aculeatus BRI4를 하기 표 1의 조성에 따라 100ml씩 만들어진 배지에 접종한 후 30℃에서 200RPM으로 10일간 배양하였다. 그 후 원심분리를 이용하여 A. aculeatus BRI4 균주가 제거된 상등액을 분해효소포함배양액으로 얻었다.

성분	조성
NaNO₃	0.6%
KH₂PO₄	0.2%
MgSO₄ㅇ7H₂O	0.03%
CaCl₂	0.03%
trace element	0.2%
corn steep	4%
Onion	2%

실험예 1. 돌연변이균주들의 특성비교

실시예 1에서 제작된 3가지의 돌연변이균주들과 wild type의 특성을 다음과 같이 비교하고 그 결과를 도 8a 내지 도 8d에 나타내었다. 3가지 돌연변이균주들은 실시예2와 동일한 방법으로 얻어진 분해효소포함배양액을 실험에 사용하였다.

단백질 생산량은 Bradford 단백질 정량법을 통해 측정되었다.bradford시약 200㎕와 효소 배양액 50㎕ 그리고 증류수 750㎕를 넣어 혼합한 후 실온에서 5분간 반응시킨다. 반응이 끝난 반응액을 ELISA를 이용하여 590nm에서 측정하였고 BSA를 이용한 standard curve를 그려 정확하게 배양액의 단백질량을 정량하였다. pectin 분해활성은 pH 5.0 buffer에 녹인 pectin 50㎕와 균주 배양액 50㎕를 혼합한 후 50℃에서 30분간 반응 시켰다. 반응이 끝난 후 환원당 측정법인 DNS 방법을 사용하였다. 반응액에 DNS시약 300㎕를 넣어 혼합한 후 100℃로 5분간 반응 시킨다. 효소의 반응에 의해 생성된 galacturonic acid의 농도가 높을수록 DNS의 색이 진한 갈색으로 변하고 이를 ELISA를 이용하여 550nm에서 측정하였다. galacturinic acid standard curve를 이용하여 효소가 생산한 galacturonic acid의 양을 정량 하였고 효소의 활성은 계산 하였다.

CMC 분해활성은 pH 5.0 buffer에 녹인 CMC 50㎕와 균주 배양액 50㎕를 혼합한 후 50℃에서 30분간 반응 시켰다. 반응이 끝난 후 환원당 측정법인 DNS 방법을 사용하였다. 반응액에 DNS시약 300㎕를 넣어 혼합한 후 100℃로 5분간 반응 시킨다. 효소의 반응에 의해 생성된 glucose의 농도가 높을수록 DNS의 색이 진한 갈색으로 변하고 이를 ELISA를 이용하여 550nm에서 측정하였다. glucose standard curve를 이용하여 효소가 생산한 glucose의 양을 정량 하였고 효소의 활성은 계산 하였다.

xylan 분해활성은 pH 5.0 buffer에 녹인 beech wood xylan 50㎕와 균주 배양액 50㎕를 혼합한 후 50℃에서 30분간 반응 시켰다. 반응이 끝난 후 환원당 측정법인 DNS 방법을 사용하였다. 반응액에 DNS시약 300㎕를 넣어 혼합한 후 100℃로 5분간 반응 시킨다. 효소의 반응에 의해 생성된 xylose의 농도가 높을수록 DNS의 색이 진한 갈색으로 변하고 이를 ELISA를 이용하여 550nm에서 측정하였다. xylose standard curve를 이용하여 효소가 생산한 xylose의 양을 정량 하였고 효소의 활성은 계산 하였다.

도 8a에 도시된 바와 같이 단백질 생산량은 BRI2가 wild type보다 약 66%증가하였고 pectin 분해활성은 도 8b에 도시된 바와 같이 BRI4가 wild type 보다 약 56%증가하였다. 도 8c 및 도 8d에 각각 도시된 바와 같이 CMC와 xylan 분해활성은 BRI2와 BRI4가 비슷한 경향을 보였고 두 돌연변이체가 wild type 보다 CMC는 약 66%, xylan은 약 76% 증가하였다.

실험예 2

각 균주들의 양파 분해활성을 다음과 같이 측정하고 그 결과를 도 9에 나타내었다.

양파분해활성은 양파를 갈아서 착즙하여 양파 착즙액을 제거한 양파찌꺼기를 얻었다. 양파찌꺼기에 소량의 당이 포함되어 있기 때문에 물로 여러 번 씻어서 당들을 제거하였고 동결건조를 해서 수분을 모두 제거하였다. 건조된 양파찌꺼기 50㎎, 효소액 200㎕, 2M sodium acetate buffer (pH 5.0) 50㎕, 증류수 4700㎕를 혼합한 후 45℃ 진탕 배양기에서 24시간 반응 시켰다. 양파의 분해 정도는 DNS 환원당 측정법을 사용하였다. 반응액 100㎕와 DNS시약 300㎕를 넣어 혼합한 후 100℃로 5분간 반응 시킨다. ELISA를 이용하여 550nm에서 OD값을 측정하였고 glucose standard curve를 이용하여 glucose의 양을 정량, 양파의 분해정도를 측정하였다.

도 9에 나타난 결과로부터, 본 발명에서 얻어진 돌연변이균주들이 wild type과 비교하여 적어도 20%이상 상승된 결과를 나타내었는데, 특히 A. aculeatus BRI4는 wild type과 비교하여 약 두 배 높은 것으로 나타났다

실시예 2

도 11에 도시된 바와 같이 커피찌꺼기로부터 D-만노스 및 에탄올을 다음과 같이 제조하였다.

1.바이오매스 전처리단계

준비된 20g의 커피찌꺼기에 60% 에탄올 100mL을 첨가한 후 150도에서 2시간 반응시켜 전처리를 수행하였다.

2. 당화단계

전처리된 커피찌꺼기(coffee residue waste:CRW)시료를 50 mM sodium citrate buffer (pH 4.8)에 첨가하여 10%(w/w) 농도로 준비 후 autoclave하였다. 여기에 cellulase 0.22 FPU/mg와 분해효소포함배양액 14.4 IU/mg을 각각 첨가하였다. 여기서, enzymatic conversion rate(%)는 각 시료에 함유된 당의 초기 구성에 대해 총 발효 가능당(포도당, 갈락토오스, 만노스)의 비율을 기준으로 계산하였다. 효소 가수 분해가 끝나면 10분간 끓여 효소 반응을 종결하였다. 그 후 centrifuge를 이용하여 분리한 후 상등액을 발효에 사용할 당화액으로 얻었다.

3. 발효단계

발효단계 수행 하루 전 yeast(S. cerevisiae ATCC 36858)의 colony를 3mL의 YPD medium에 넣고 30도에서 200rpm으로 shaking 한 후 100mL의 YPD medium을 포함하고 있는 500 mL 플라스크에 옮겨 30도 조건에서 200rpm으로 shaking 하며 배양하였다. 이때 광학 밀도가 600 nm에서 0.5ㅁ0.1범위가 될 때까지 배양한다. 요구된 OD값에 도달하기 위해 S. cerevisiae는 4시간이 소요되었다. 셀은 4도에서 10분 동안 원심분리하고, 초기 yeast cell 농도(1 g L^-1)를 발효 매개체인 당화액에 resuspend 하여 9시간 동안 발효시켜 발효액1을 얻었다. 이 때 발효는 pH5인 조건에서 수행되었다.

4. 색소제거단계

발효액1로부터 색소 제거를 위해 15(w/v))의 fermented broth에 5-15μm파티클 사이즈의 활성탄을 첨가하여 300rpm으로 0-120 분 저어주었다. 이후 0.25μm 멤브레인 필터를 이용하여 활성탄을 제거하였다.

5. 에탄올과 D-만노스 분리

에탄올과 D-만노스 분리를 위해 polydimethylsiloxane (PDMS) membrane을 이용하여 투과막 증발 방법을 다음과 같이 실시하였다. 공급액측은 대기압에서 실험하였고, 분리막 투과측의 진공은 진공펌프를 이용하여 5 mmHg 로 유지하였다. 투과된 투과 증기는 액체 질소를 사용하여 포집하였다. 고농도의 에탄올 함량을 얻기 위해 12시간동안 처리하였으며, 동일한 조건하에서 5배치 연속으로 실시함으로써 효과적으로 정제된 에탄올과 D-만노스를 얻었다.

실시예 3

발효단계에서 yeast를 cerevisiae KCTC 7906를 사용하고, pH가 7인 조건에서 발효가 9시간 동안 수행된 것을 제외하면, 실시예 2와 동일한 방법으로 에탄올과 D-만노스를 얻었다.

실시예 4

발효단계에서 yeast를 P. stipitis NRRL Y-7124를 사용하고, pH가 9인 조건 에서 발효가 24시간 동안 수행된 것을 제외하면, 실시예 2와 동일한 방법으로 에탄올과 D-만노스를 얻었다.

실험예 3

전처리된 커피찌꺼기의 특성을 분석하기 위해 현미경을 통해 표면을 분석하고 그 결과 사진을 도 12a에 나타내었다. 또한 화학성분을 분석하고 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

표 2로부터, 전처리된 커피찌꺼기의 당 함량 조사 결과 carbohydrate는 크게 변화가 없었으나 그 중 특징적으로 만노스가 19.3%에서 22.7%로 증가되었음을 알 수 있었다. 또한, 전처리 후 insoluble 리그닌의 함량이 29.1%에서 17.2%로 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 각각 12.0%, 7.4% 함유된 글루코스와 갈락토오스는 바이오 에탄올로 전환 가능하다.

도 12a는 에탄올 전처리 전 후 표면적을 비교한 결과 전처리 후 더 큰 구멍과 작은 양의 extractive 화합물을 나타내는 것을 알 수 있었다.

실험예 4

에탄올 전처리된 커피찌꺼기와 전처리되지 않은 커피찌꺼기를 대상으로 실시예2의 당화단계를 수행하고 그 결과를 도 12b 및 도 12c에 나타내었다.

도 12b 및 도 12c는 전처리된 커피찌꺼기를 대상으로 수행된 당화효율이 전처리되지 않은 커피찌꺼기를 대상으로 수행된 당화효율보다 약 3배 이상의 높은 것을 보여준다.

실험예 5

실시예2 내지 실시예4에서 사용된 S. cerevisiae ATCC 36858, cerevisiae KCTC 7906, 및 P. stipitis NRRL Y-7124 세 가지 효모를 이용하여 다양한 pH 조건에서 발효 효율을 조사하였고, 그 결과를 도 13a 내지 도 13c에 나타내었다.

도 13a 내지 도 13c로부터, P. stipitis NRRL Y-7124를 이용한 경우 24시간의 발효 시간이 걸린 반면 S. cerevisiae를 이용한 경우 4~9시간으로 짧은 시간 안에 발효가 가능했다. 또한 모든 효모들이 pH 5, 7와 9에서 전반적으로 에탄올과 만노스의 생산 효율이 높았다.

실험예 6

색소제거단계의 최적 조건을 찾기 위해 다음과 같은 실험을 수행하고 그 결과를 도 14에 나타내었다.

다양한 농도(0,5,10,15,20 (w/v))의 fermented broth에 5-15μm 파티클 사이즈의 활성탄을 첨가하여 300 rpm으로 0-120 분 저어주었다. 이후 0.25μm 멤브레인 필터를 이용하여 활성탄을 제거하고 brightness level을 확인하기 위해 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. sugar 농도는 HPLC를 이용하여 측정하였고, 브릭스 당도는 당도계를 이용하였다.

도 14로부터, 색소 제거 단계 전후 brightness level, ethanol 농도, mannose 농도, 브릭스 당도를 비교한 결과 색소 제거 후 brightness level 5.6 배 증가하였으며, ethanol과 mannose 농도는 각각 초기 input 용액의 약 93% (15.2 g/L^-1)와 85% (20.0 g/L^-1)의 높은 농도로 output 용액에 남아있었다.

또한, mannose 브릭스 농도는 색소 제거 단계 전(4.4 ㅀBx)의 약 75%인 3.3ㅀBx로 나타났다.

실험예 7

실시예 2의 에탄올과 D-만노스 분리단계에서 공급액(In-feed solution)과 트랩 내부 투과액(In-product solution)의 농도를 HPLC를 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15로부터, 투과막 증발에 의해 발효액에 포함된 에탄올과 D-만노스가 효과적으로 분리되었음을 알 수 있다.

실험예 8

시판 D-만노스와 실시예2에서 투과막 증발에 의해 분리된 커피찌꺼기로부터 얻어진 D-만노스를 대상으로 성분을 분석하고 그 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16으로부터, 분리된 D-만노스의 순도가 95.3%를 보였으며, 그 외 0.4% soluble lignin, 3.2%의 extractive 화합물, 1.1%의 unidentified 물질이 포함되어 있음을 확인하였다.

본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12079P

20170713

<110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> Mutants of Aspergillus aculeatus, method for producing the same, and production method of biomass derived products <130> DPP-2017-0099-KR <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1296 <212> DNA <213> Aspergillus aculeatus <400> 1 atgccgccac cggcctcttc agtggatttc tccaatctgc tgaatcctca gagcaattcg 60 actgagtcta ctccgtcctc acctaccacc cctgtggata gctcgagagg tccttctact 120 ccgtccagcg ctcaatccac ttctactatg gcttcgtccg tcagtcttct ccctcctttg 180 atgaagggta gccgtcctgc gaccgaagaa gtgcgccaag atcttcctcg gccgtacaag 240 tgcccgctgt gtgatcgtgc cttccaccgc ctggagcacc aaacgagaca tatccgcacc 300 cacacgggcg agaagcctca cgcgtgccag tttcccggct gcaccaagcg attcagtcgc 360 tctgacgaac tcactcgcca ctcgcgaatt cacaacaacc ccaactcgag gcgcagcaac 420 aaggctcagc atctcgctgc ggctgctgcg gccgcagctg gtcaggagaa tgcgatgccc 480 aacaatgcag gggccctgat gccccctccc agcaagccga tgactcgctc tgcgcctgtt 540 tcgcaagttg gctctcccga cgtttctcct ccccactctt tctccaacta tgccaaccac 600 atgcgctcca acttggcgcc ttacgcccgt aacgccgagc gggcatcttc gggcatggac 660 atcaatctcc ttgccaccgc tgcctcccag gtggagcggg acgaccactt cagcttccat 720 gccggccctc gcaatcacca cttgttcagc agctcccgcc accacggcag cggtcgtttg 780 ccttctctct cggcgtacgc gatcacgcat aacatgagcc ggtcgcactc gcatgaagaa 840 gacgacagct attctcatcg tgtgaagcgt tccaggccca attcgcccaa ctcgaccgct 900 ccatcctcgc ccaccttctc gcatgactcc ctttcaccta ctcctgacca cacgcctttg 960 gctacccccg cccactctcc gcggctgaga cctctgggat cgagcgatct acaccttccc 1020 tcaattcgtc atttgtcgct ccaccacacc cccgccctgg ctcccatgga gccacaaccg 1080 gagggtccca gttactacag ccccagtcag agtcatggtc cgagcatcac cgatattatg 1140 tccaaacccg atggcacaca gcgcaagcta cctgttcctc aggtaccgaa agtggcagtc 1200 caggatatgt tgaatcctgg cagtgggttt tcctcggtca cctcgtccac cgccaactca 1260 gtcgcgggcg gcgatttggc cgaccgtgcc ttttaa 1296 <210> 2 <211> 2298 <212> DNA <213> Aspergillus aculeatus <400> 2 atgaccccgc tagagaaaat gctccaggat ttgggatcga tccgagagga tggcagtgat 60 aagttctttg cgatggagaa tgtaagtctg cgtctaaaac atcttgctct tggaatcctt 120 gctgatagac ttctctcgtc tagttcggaa atacatggtg agttgttggc gcccggctgc 180 cggtctactt acctcaagtg atcgcataga ccccaagtga ctggatcact aatgcttgcg 240 aatagttact gtaactcgat attacaatgt ctctattatt cagtaccatt ccgagaagcc 300 gttataaact atcccaccag aacaccgata gagaacctgg aagccgcatt ggccaaaaac 360 cttcattacc aaaacccggc tgctaatatg gaagcggagg cacaagcaga gaagcagagg 420 gctgctacgc cacaacgtcc gggggcgccc ccgaatcagc cacaaaaacc cgaagataaa 480 gactcaccgg aatacaagaa gaagatggcc ttacagactc tcccccttct agaaaccacg 540 aacaattcag ccagctacgg aatgtcagag tcgctattca catcgctgaa ggatatattt 600 gagtcgatcg tggcgagtca ggctcgtctt ggtataacaa gaccacagcg cttgttggaa 660 ctcctccgtc gggaccatga gatgtttcgg actgccatgc atcaggatgc ccatgagttc 720 ttgatccttt tactgaacga ggtggtagcg aatgtcgaag cggaggccat gaagcagccc 780 gagaagagct tgccaccccc cgaaagcatg gaatcctcac aacaatcatt aagttctggt 840 tccaagaccc ccaacactac gcgatgggtg cacgagttgt tcgaaggaac tttaacgtcc 900 gaaacacaat gtctgacctg cgagaacgtc tctcagcgag atgagatctt cctagatcta 960 tcggtagatc ttgaacagca ttcgtcggtt acctcgtgtt tgaggaaatt ctccgcagaa 1020 gagatgctct gcgagcggaa taaattccac tgtgacaatt gtggcggtct gcaggaggca 1080 gaaaaacgga tgaaaatcaa acgtcttccc cgcatcttgg ctctccatct caagcgcttt 1140 aaatacacgg aggacttgca aaaactgcag aagttgtttc accgagtcgt ctacccgtat 1200 cacctgcgtc ttttcaacac aacggacgat gcggaggatc ccgaccgatt gtacgagctg 1260 tatgcagtcg tggtacatat tggaggcggt ccctaccacg gtcactatgt ggctattatc 1320 aagacgcagg atcgcggatg gttgctcttt gatgatgaga tggtggagcc tgtggacaag 1380 aactacgtgc gtaacttctt cggagataaa cccggactcg cctgcgccta cgttttgttc 1440 taccaggaaa ccactatgga ggctgttatg aaggaacaag aacaggagga tctcaatgcc 1500 accatggcag atctcaattt gaacgaggtc gccgtgaagc agaatggatt catctcaccg 1560 cccgcgctat ctcatgttca tagtgcatcg caaatcccct cgcaagagga ccctcaccga 1620 ttcacaggcc tgaaacgcgc cccgacggcg cctcagcttc cgactcacac cgagcacatc 1680 ggcgccgaag ccgttcctcc gcatagtccg gcagccgtgc cccctccggt gcccccgatt 1740 cctgaggtcc acacgcgacc actgagcccc aagaagagtg acgtccaatc taagaaggaa 1800 agggccaagg aggaaaagga acggaaagca gccgaaaaag agctagaaaa gcagcgccgg 1860 aaggagcaag aagctcggtt caaggagaac aaagagaacc agcggcgcga ggaagctgag 1920 attaaggctg cgatcgaggc cagccgagcg tctaaggccg atgaagaccg acgcaatgac 1980 agtggcaaga gtggtggatt gagccgactc aaacgaggca gcaagagctt cagccagaga 2040 ctgggcaagg acaaggaaag tcgggcgtca tcgtccggct cccccgcagt gcccaattcc 2100 gagacgtcca gttcaagcaa tatgccacct gagccactcc aacccttgtc tcctcagaag 2160 ataacgcctc ccgatacact tctggttcct cacgacgatg atccggattc tcttaagagc 2220 cctaagagcg atcgacagac tcatgggaaa tggcggagtt tcagcattag aaagaagtcc 2280 ttcagcattc tttcgtga 2298

Claims

creA유전자인 서열번호 1 및 creB유전자인 서열번호 2가 모두 결실된 아스퍼질러스 아쿠레아투스 BRI4(Aspergillus aculeatus BRI4 - 기탁번호 : KCCM12079P)인 아스퍼질러스 아쿠레아투스 변이균주.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 균주는 펙틴분해활성, CMC분해활성 및 자일란(xylan)분해활성 중 하나 이상이 증가된 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스 아쿠레아투스 변이균주.
삭제
제 1 항 또는 제 3 항의 아스퍼질러스 아쿠레아투스 변이균주를 배양한 후 상기 변이균주를 제거하여 얻어진 분해효소포함배양액.
제 5 항에 있어서,
상기 배양은 상기 아스퍼질러스 아쿠레아투스 변이균주를 배지에 접종한 후 25℃~40℃ 온도에서 교반하면서 7~15일간 수행되는 것을 특징으로 하는 분해효소포함배양액.
바이오매스 전처리단계; 및
상기 전처리바이오매스에 제 5 항의 분해효소포함배양액 및 셀룰라아제를 처리하여 상기 전처리바이오매스를 가수 분해시키는 당화단계;
상기 당화단계에서 얻어진 당화액을 발효시키는 발효단계; 및
상기 발효단계에서 얻어진 발효액을 바이오에탄올과 D-만노스로 분리하는 분리단계;를 포함하는 단당류 및 바이오에탄올 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 바이오매스가 커피찌꺼기인 것을 특징으로 하는 단당류 및 바이오에탄올 제조방법.
제 8 항에 있어서,
상기 전처리단계는 커피찌꺼기를 알코올에 침지하는 단계; 및 침지된 상태로 100 내지 150℃의 온도에서 일정시간 반응시키는 단계;를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 하는 단당류 및 바이오에탄올 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 당화단계는 상기 전처리바이오매스를 버퍼에 첨가하여 일정농도의 반응물을 준비하는 단계; 상기 반응물에 상기 분해효소포함배양액 및 셀룰라아제를 처리하여 가수분해를 수행하는 단계; 상기 가수분해액을 가열하여 효소반응을 종결하는 단계; 및 상기 가수분해액을 원심분리하여 상등액을 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 단당류 및 바이오에탄올 제조방법.
제 10 항에 있어서,
상기 반응물 10중량% 농도 당 상기 분해효소포함배양액 14.4 IU/mg및 상기 셀룰라아제 0.22 FPU/mg가 처리되는 것을 특징으로 하는 단당류 및 바이오에탄올 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 발효단계는 pH가 5~9인 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 단당류 및 바이오에탄올 제조방법.
삭제
제 7 항에 있어서,
상기 발효단계에서 얻어진 발효액에 포함된 D-만노스의 색소를 제거하는 색소제거단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단당류 및 바이오에탄올 제조방법.
제 14 항에 있어서,
상기 색소제거단계는 상기 발효액에 활성탄을 첨가하여 교반하는 단계; 및 상기 첨가된 활성탄을 제거하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 단당류 및 바이오에탄올 제조방법.