CN107075447A - 细胞分离方法及细胞捕获过滤器 - Google Patents

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Abstract

本发明的细胞分离方法具有以下步骤：使受检液通过在厚度方向上具有多个贯通孔的细胞捕获过滤器，将受检液所含的作为分离对象的细胞捕获到细胞捕获过滤器的一个面上的细胞捕获步骤；将刺激响应性水凝胶导入至在细胞捕获步骤中捕获了细胞的细胞捕获过滤器的一个面上，利用该刺激响应性水凝胶将细胞包埋的凝胶包埋步骤；通过对包埋了细胞的刺激响应性水凝胶赋予刺激，使该刺激响应性水凝胶固化的凝胶固化步骤；和将在凝胶固化步骤中固化的刺激响应性水凝胶从细胞捕获过滤器上剥离的剥离步骤。

Description

细胞分离方法及细胞捕获过滤器
技术领域
本发明涉及细胞分离方法及该细胞分离方法中使用的细胞捕获过滤器。
背景技术
癌由于在世界各国中占据死因的上位，因此期待癌的早期发现及治疗。因癌导致的人的死亡基本都是因为癌的复发转移。癌的复发转移是由于癌细胞从原发灶经由血管或淋巴管锚定、浸润到其他脏器组织的血管壁上、形成微小转移灶而引起的。将这种通过血管或淋巴管的在人体内循环的癌细胞称作血中循环癌细胞(Circulating Tumor Cell，以下根据情况称作“CTC”)。
若能够对可能引起癌转移复发的血管中的癌细胞(CTC)的有无及其量进行测定，则能够对癌治疗有很大的贡献。作为捕获血液中的癌细胞的现有技术，例如已知专利文献1中记载的构成。专利文献1记载的技术利用过滤器将血液中的癌细胞捕获，其中给出了使用了过滤器的半导体技术的制造方法、收纳有过滤器的cell unit的形状及流过血液和处理液的流路的结构。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第2011/0053152号说明书
发明内容
发明要解决的技术问题
但是，近年来，从更为准确地把握血管中的癌细胞状况的目的出发，有期望对癌细胞的个体分别进行观察的要求。但是，即便是例如使用专利文献1记载的技术将癌细胞捕获到过滤器上，也难以对癌细胞个体进行观察。另外，由于过滤器上的癌细胞易于弹性变形，因此处理困难，而若使其损伤，则无法适当地进行细胞的观察。
本发明鉴于上述事实而完成，其目的在于提供能够在不使细胞捕获过滤器上所捕获的癌细胞损伤的情况下进行分离的细胞分离方法及该细胞分离方法中使用的细胞捕获过滤器。
用于解决技术问题的方法
为了达成上述目的，本发明一个方式的细胞分离方法的特征在于包含以下步骤：使受检液通过在厚度方向具有多个贯通孔的细胞捕获过滤器，将所述受检液所含的作为分离对象的细胞捕获到细胞捕获过滤器的一个面上的细胞捕获步骤；将刺激响应性水凝胶导入至在所述细胞捕获步骤中捕获了所述细胞的所述细胞捕获过滤器的一个面上，利用该刺激响应性水凝胶将所述细胞包埋的凝胶包埋步骤；通过对包埋了所述细胞的所述刺激响应性水凝胶赋予刺激，使该刺激响应性水凝胶固化的凝胶固化步骤；和将在所述凝胶固化步骤中固化的所述刺激响应性水凝胶从所述细胞捕获过滤器上剥离的剥离步骤。
上述细胞分离方法中，将刺激响应性水凝胶导入至在细胞捕获步骤中捕获了细胞的细胞捕获过滤器2的一个面上，在利用该刺激响应性水凝胶将细胞包埋之后，通过对刺激响应性水凝胶赋予刺激，使该刺激响应性水凝胶固化，将固化的刺激响应性水凝胶从细胞捕获过滤器上剥离。如此，通过使用刺激响应性水凝胶对细胞进行分离，以细胞被刺激响应性水凝胶包埋的状态对细胞进行操作，因此与对分离对象的细胞进行直接操作的情况相比，处理性提高，能够在不损害细胞的情况下进行分离。
这里，可以是在所述凝胶固化步骤中、仅使包埋了所述细胞的所述刺激响应性水凝胶中的分离对象的所述细胞周围局部地固化的方式。
如此，在凝胶固化步骤中，当为仅使分离对象的所述细胞周围局部地固化的构成时，由于能够分别对每个细胞操作经固化的水凝胶，因此处理性进一步提高。
另外，本发明一个方式的细胞捕获过滤器是上述细胞分离方法中使用的细胞捕获过滤器，其特征在于，所述一个面侧中相邻的所述贯通孔间的距离为80μm以上。
上述细胞分离方法中使用的细胞捕获过滤器2通过为在一个面侧中相邻的贯通孔间的距离为80μm以上的构成，能够防止被相邻的贯通孔捕获的细胞被水凝胶暂时地固化，因此能够适当地进行细胞的分离。
发明效果
根据本发明，提供能够在不损害细胞捕获过滤器上所捕获的细胞的情况下进行分离的细胞分离方法及该细胞分离方法中使用的细胞捕获过滤器。
附图说明
图1为细胞捕获器件的概略构成图。
图2为细胞捕获器件的分解立体图。
图3为对细胞捕获过滤器进行说明的图。
图4为对细胞捕获过滤器进行说明的图。
图5为对细胞分离方法进行说明的图。
图6为对PEGDA进行说明的图。
图7为对固化后的PEGDA的结构进行说明的图。
图8为分离后的PEGDA的SEM图像。
具体实施方式
以下参照附图，详细地对用于实施本发明的方式进行说明。其中，附图的说明中相同要素使用相同符号并省略重复的说明。
图1为用于说明包含本发明一个方式的细胞分离方法中使用的细胞捕获过滤器的细胞捕获器件的构成的图，图2为细胞捕获器件的分解立体图。另外，图3及图4为对细胞捕获过滤器进行说明的图。
细胞捕获器件是通过用细胞捕获过滤器将成为受检液的细胞分散液过滤，将受检液中所含的细胞捕获的装置。另外，通过用以下实施方式中说明的分离方法对被细胞捕获过滤器捕获的细胞进行分离，进行细胞的鉴定及细胞个数的计数等。作为成为受检液的细胞分散液，例如可举出血液及将血液稀释而成的液体。细胞捕获器件适用于例如通过从含有被称作CTC的循环癌细胞等稀少细胞的血液中使血液中所含的红细胞、血小板及白细胞(以下将它们总称为“血球成分”)通过而对稀少细胞进行捕获的目的。稀少细胞的种类并不限定于CTC。例如，循环内皮细胞(Circulating endothelial cells：CEC)及血管循环内皮祖细胞(Circulating endothelial progenitor cells：CEP)等也可作为捕获对象的稀少细胞进行处理。
如图1及图2所示，细胞捕获器件1在厚度方向上形成有多个贯通孔的细胞捕获过滤器2的上方设置有框材3，同时在下方形成有排出流路。
作为细胞捕获过滤器2的材质，只要是尽量硬质的材料即可，特别优选金属。金属由于加工性优异，因而可以提高过滤器的加工精度。由此，还可以进一步提高成为捕获对象的成分的捕获率。另外，金属与塑料等其他材料相比，由于更为刚直，因此即便从外部施加力量、也维持其尺寸及形状。因此，当使比贯通孔稍大的成分变形、通过时，能够进行更为高精度的分离-浓缩。
作为金属的主成分，优选镍、银、钯、铜、铱、钌、铬中的任一种或者它们的合金。其中，作为金属的主成分，特别优选使用铜或镍。
作为细胞捕获过滤器2，本实施方式中对使用了厚25μm的镍基板的情况进行说明，但厚度可以适当变更，例如可以为10μm～100μm。细胞捕获过滤器2如图3所示，形成了在中央形成有多个贯通孔21的过滤器区域22。
细胞捕获过滤器2的过滤器区域22如图4(A)所示，从上方观察时，设有多个直径为8μm的圆形贯通孔21。贯通孔21按照与相邻的贯通孔21的间隔达到125μm的方式配置成方格状，在过滤器区域22内配置63×63＝3969个贯通孔21。另外，从截面进行观察时，如图4(B)所示，在上表面侧(导入受检液的一侧)、在贯通孔21的周围形成有深2μm的凹部23。另外，按照贯通孔21的孔径从上表面侧朝向下表面侧(排出受检液的一侧)慢慢增大的方式进行倾斜。
贯通孔21的形状及配置可以适当变更，本实施方式的细胞捕获过滤器2优选与相邻的贯通孔21的距离为80μm以上。通过使贯通孔21间的距离为上述范围，所捕获的细胞的分离变得容易。
返回至图1及图2，细胞捕获过滤器2的上方的框材3在较细胞捕获过滤器2的过滤器区域22更靠外侧处按照将细胞捕获过滤器2包围的方式设置。框材3例如优选由树脂等与细胞捕获过滤器2具有密合性的材料构成。另外，在较框材3更靠上方的位置，为了对细胞捕获器件1导入受检液或处理液，还可以为设置具有导入流路的导入构件等的构成。
在细胞捕获过滤器2的下方，通过框材5及流路构件6设置有用于将从上方至下方通过细胞捕获过滤器2的贯通孔21的受检液排出至外部的排出流路61、和使受检液向排出流路61移动的排出区域62。
具体而言，在流路构件6上形成有排出流路61。在流路构件6的上部隔着密封构件7设有框材5。框材5是在内侧形成了对应于过滤器区域22的开口的环状构件。被该框材5包围的区域成为排出区域62。在细胞捕获过滤器2与框材5之间设有密封构件8。
框材5及流路构件6可以由树脂等构成。框材5例如可以由PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)构成。另外，流路构件6例如可以通过用硅管形成排出流路61、用PDMS(聚二甲基硅氧烷)将其周围覆盖，从而进行成形的构成。密封构件7、8分别优选由与细胞捕获过滤器2、框材5及流路构件6具有密合性的材料构成。另外，作为框材3、密封构件7、8，例如可以使用insitu PCR seal(Bio-Rad Laboratories公司制)。
如此形成的细胞捕获器件1通过将排出流路61连接在泵等上，利用泵产生的吸引力对受检液等进行吸引，受检液在通过细胞捕获过滤器2的贯通孔21的同时，将无法通过的细胞捕获到细胞捕获过滤器2的上表面侧。
另外，在导入受检液之前，例如通过用PBS(0.5％BSA(N,O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺)、2mM EDTA(乙二胺四乙酸))等预先将细胞捕获器件1内充满，可以适当地将受检液导入。另外，在将细胞捕获之后，也优选用PBS等对所捕获的细胞进行洗涤处理。其中，对捕获后的细胞，还可使用固定液、染色液等进行所期望的处理。此时，可以使用向细胞捕获器件1内导入固定液、染色液等静置规定时间之后，利用PBS进行洗涤的方法。
接着，一边参照图5一边对从细胞捕获器件1的细胞的分离方法进行说明。图5是用于说明使用了细胞捕获器件1的细胞的分离方法的图。首先，如图5(A)所示，通过使受检液通过细胞捕获过滤器2的贯通孔21，将例如CTC等捕获对象的细胞捕获到贯通孔21上(细胞捕获步骤)。此时，除了作为捕获对象的CTC91之外，有时作为血中成分的红细胞92及白细胞93等其他细胞也会被捕获到细胞捕获过滤器2上。
接着，将刺激响应性水凝胶导入至细胞捕获过滤器2的捕获了细胞的上表面侧，对被刺激响应性水凝胶31捕获的细胞进行包埋(凝胶包埋步骤)。刺激响应性水凝胶31是指对温度、电场、光等外部环境的稍微变化进行响应、亲/疏水性等物理化学特性剧烈地发生变化的水凝胶。本实施方式的细胞分离方法中，优选使用对刺激进行响应、发生固化的凝胶。
作为这种刺激响应性水凝胶，例如可以使用聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)。PEGDA如图6所示，可通过紫外线照射获得交联结构。另外，作为其他的刺激响应性水凝胶，可举出聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)、壳聚糖凝胶等。
使用PEGDA时，例如可以使用将添加有2-羟基-2-甲基苯基丙酮的溶液导入至细胞捕获过滤器2上、从框材3上层叠盖玻璃的方法。
使用PEGDA时，刺激响应性水凝胶的导入量只要是能够将分离对象的细胞包埋的量则无特别限定，例如优选按照导入至细胞捕获过滤器2上的刺激响应性水凝胶的高度达到100μm～600μm左右的方式进行导入。通过为这样的范围，可以适当地将10μm～数10μm左右大小的分离对象的细胞包埋。另外，固化后的水凝胶的处理性提高。高度为100μm以下时，固化后的水凝胶的处理变难。另外，高度高于600μm时，有可能难以适当地控制发生固化的区域的大小。关于刺激响应性水凝胶的导入量，更优选高度为200μm～300μm左右。
接着，如图5(C)及图5(D)所示，使刺激响应性水凝胶31固化(凝胶固化步骤)。刺激响应性水凝胶31为光固化性时，通过仅对捕获对象的细胞的周围照射来自光源的光，可以仅使细胞周围固化。其中，作为刺激响应性水凝胶31使用PEGDA时，通过照射紫外线激光，可以使细胞周围的PEGDA固化。通过选择性地使细胞周围的刺激响应性水凝胶固化，可以与其他细胞分开地使该细胞固化。
之后，如图5(E)所示，将固化后的刺激响应性水凝胶32从细胞捕获过滤器2上剥离(剥离步骤)。由此，可以将分离对象的细胞(CTC91)个别地取出。剥离后，也可以将细胞从水凝胶中个别地取出、直接用于分析。
这里，示出了对作为刺激响应性水凝胶使用PEGDA的情况进行详细研究的结果。
作为细胞捕获过滤器2，准备直径为8μm的贯通孔21以125μm的间隔配置成方格状的Ni基板。另外，将在健康者血液及PBS(0.5％BSA、2mM EDTA)1ml中添加有100或1000个细胞作为捕获对象的细胞的NCI－H1975细胞或HCC827细胞的溶液作为受检液。
首先，向细胞捕获器件1中导入PBS 1ml，将细胞捕获器件1内用PBS充满。接着，向细胞捕获器件1内导入受检液，使用蠕动泵以150－1750μl/分钟的流量进行送液。之后，为了流过受检液中的血球成分，导入PBS 1ml进行洗涤，利用蠕动泵对溶液进行吸引操作，从而将细胞捕获器件1内的PBS除去，同时将细胞捕获在细胞捕获过滤器2的贯通孔21上。之后，将流量变更为200μm/分钟，作为细胞固定处理导入4％多聚甲醛(PFA)的PBS溶液(4％paraformaldehyde(PFA)in PBS)，静置15分钟。用PBS在细胞捕获器件1内将PFA的PBS溶液(PFA in PBS)洗涤，置换成0.2％TritonX-100的PBS溶液(0.2％TritonX-100in PBS)，静置15分钟，由此进行透过处理。接着，使用PBS洗涤之后，置换成染色液(FITC标记抗细胞角蛋白(cytokeratin)抗体、PE标记抗CD45抗体、Hoechst33342)，静置30分钟，由此进行染色。之后，用PBS进行洗涤。
之后，制作在Mn 250、575、700的PEGDA中以1.0％的比例添加有2-羟基-2-甲基苯基丙酮的溶液，导入至细胞捕获器件1的细胞捕获过滤器2上，在其上表面层叠盖玻璃。之后，将细胞捕获器件1设置在共聚焦激光扫描型显微镜(FV1000-D IX81；Olympus公司制)中，使用10倍物镜选择基板上的分离对象细胞。切换成物镜100倍油镜之后，使镜头与盖玻璃接触，照射激光强度为1.4mW、波长为405nm的激发光180秒钟，使PEGDA局部地固化。之后，将盖玻璃剥离，将固化的水凝胶从细胞捕获过滤器2上剥离，可以将水凝胶中包埋的细胞分离。
图7是示意地表示在细胞捕获过滤器2上被盖玻璃51覆盖之后、在光作用下发生固化的水凝胶32形状的图。水凝胶31中，由虚线表示的光线L包围的区域发生固化。另外，图8表示所剥离的水凝胶(PEGDA)的用扫描型电子显微镜(SEM)拍摄的结果的图。图8(A)是经剥离的水凝胶的整体像。另外，图8(B)是用虚线表示所剥离的水凝胶存在的区域的图像。另外，图8(C)是与细胞捕获过滤器2的贯通孔21周边对应的水凝胶的放大图像，表示捕获了细胞。
固化后的水凝胶32的宽(与细胞捕获过滤器2相面对的面的大小)为100μm～400μm左右、高为100μm～500μm左右。另外，当对PEGDA照射激光时，固化后的水凝胶如图7所示，中央部分成为具有线对称的中间变细部分的形状。此时的中间变细部分S(参照图7)认为是物镜的聚焦面。其中，中间变细部分S的有无等水凝胶的形状随激光光照射条件或水凝胶的高度等而改变。固化后的水凝胶在具有中间变细部分S时，由于易于用小钳子等保持水凝胶，因此处理性提高。另外，包埋有细胞的水凝胶与细胞单体相比充分地变大，因此即便是肉眼也可识别。因而，与处理细胞单体时相比，处理性进一步提高。
使固化后的水凝胶(PEDGA)高度为200μm～300μm时，对于通过激光产生的固化区域，在面对细胞捕获过滤器2的一侧的面(分离对象的细胞存在的一侧的面)上可以使半径为250μm以下。若减小固化区域的面积，则细胞的分离精度能够提高，因而优选PEDGA的高度为200μm～300μm。而在为了在维持其位置关系的情况下将多个细胞从细胞捕获过滤器2上剥离的情况下，PEDGA高度等条件可以适当变更。
其中，如上所述，对使用PEDGA分离的细胞进行全基因扩增反应的结果是，与不使用PEDGA地将细胞分离的情况同样，确认到将基因量扩增到了45－53万倍左右。即，未确认到因PEDGA的水凝胶导致的基因扩增障碍。其中，当细胞全部被PEDGA的水凝胶包埋时，由于与全基因扩增有关的酶等无法接近细胞，因此还确认到未发生基因量的扩增，因而只要是细胞的一部分露出至外部的状态，则可进行全基因扩增，因而能够实施与所分离的细胞有关的分析(基因突变分析等)等。
如上所示，本实施方式的细胞分离方法中，在细胞捕获步骤中捕获了细胞的细胞捕获过滤器2的一个面上导入刺激响应性水凝胶，在利用该刺激响应性水凝胶将细胞包埋之后，对刺激响应性水凝胶赋予刺激，由此使该刺激响应性水凝胶固化，将经硬化的刺激响应性水凝胶从细胞捕获过滤器上剥离。如此，通过使用刺激响应性水凝胶将细胞分离，由于以细胞被刺激响应性水凝胶包埋的状态对细胞进行操作，因此与对分离对象的细胞进行直接操作的情况相比，处理性提高，可以在不损害细胞的情况下进行分离。
特别是，在凝胶固化步骤中，当为在包埋了所述细胞的所述刺激响应性水凝胶中仅使分离对象的所述细胞周围局部地固化的构成时，由于可以对每个细胞个别地固化的水凝胶进行操作，因此处理性进一步提高。
另外，上述细胞分离方法中使用的细胞捕获过滤器2通过为在一个面侧中相邻的贯通孔21间的距离为80μm以上的构成，可以防止被相邻的贯通孔捕获的细胞被水凝胶暂时地固化，因而可以适当地进行细胞的分离。以往，为了提高细胞捕获的速度，例如使贯通孔间的距离为60μm左右。此时，虽然细胞的捕获本身适当地进行，但由于难以各个贯通孔个别地使水凝胶固化，因而难以使用水凝胶将细胞一个个地分离。与其相对，通过增大细胞捕获过滤器2的贯通孔21间的距离，可以适当地进行使用了水凝胶的每个细胞的分离。另外，当可以以多个细胞含有在1个水凝胶中的状态使水凝胶固化、取出时，贯通孔21间的距离可以小于80μm。此时，通过使用水凝胶，可以适当地进行捕获后的细胞的分离。
以上，对本实施方式的细胞分离方法及细胞捕获过滤器进行了说明，但本发明的细胞分离方法及细胞捕获过滤器并不限定于上述实施方式，可以进行各种变更。
例如，使用细胞捕获过滤器的细胞捕获器件并不限定于上述实施方式的结构，可以适当地进行变更。只要分离对象的细胞能够捕获至细胞捕获过滤器2的贯通孔21中，则其形状等并无限定。另外，细胞捕获过滤器2的贯通孔21的形状等也无特别限定，作为开口形状，可以例示出椭圆、正方形、长方形、圆角长方形、多边形等。其中，从细胞的捕获效率的观点出发，优选是圆、长方形或圆角长方形。圆角长方形是指2个等长的长边与2个半圆形构成的形状。
符号说明
1 细胞捕获器件
2 细胞捕获过滤器
3、5 框材
6 流路构件
7、8 密封构件
61 排出流路
62 排出区域

Claims (3)

1.一种细胞分离方法，其包含以下步骤：
使受检液通过在厚度方向上具有多个贯通孔的细胞捕获过滤器，将所述受检液所含的作为分离对象的细胞捕获到细胞捕获过滤器的一个面上的细胞捕获步骤；
将刺激响应性水凝胶导入至在所述细胞捕获步骤中捕获了所述细胞的所述细胞捕获过滤器的一个面上，利用该刺激响应性水凝胶将所述细胞包埋的凝胶包埋步骤；
通过对包埋了所述细胞的所述刺激响应性水凝胶赋予刺激，使该刺激响应性水凝胶固化的凝胶固化步骤；和
将在所述凝胶固化步骤中固化的所述刺激响应性水凝胶从所述细胞捕获过滤器上剥离的剥离步骤。
2.根据权利要求1所述的细胞分离方法，其中，在所述凝胶固化步骤中，仅使包埋了所述细胞的所述刺激响应性水凝胶中作为分离对象的所述细胞的周围局部地固化。
3.权利要求1或2所述的细胞分离方法中使用的细胞捕获过滤器，其中，所述一个面侧中相邻的所述贯通孔间的距离为80μm以上。
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