CN107064336A - 一种柱前衍生化分析分离科立内酯二醇对映异构体的方法 - Google Patents

一种柱前衍生化分析分离科立内酯二醇对映异构体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过柱前衍生分析科立内酯二醇对映异构体的HPLC方法。本发明采用的柱前衍生化，所得科立内酯二醇衍生物分子增加了生色团，提高紫外吸收强度，增加了紫外波长处的可检测性；所得科立内酯二醇衍生物分子极性降低，手性固定相对其选择性增加，提高了其对映异构体的分离度。本发明能够简单、准确、高效分析分离科立内酯二醇对映异构体，进而实现对科立内酯二醇的质量控制。

Description

一种柱前衍生化分析分离科立内酯二醇对映异构体的方法
技术领域
本发明涉及一种高效液相色谱分析分离方法，尤其是通过柱前衍生化分析分离科立内酯二醇对映异构体的方法。
技术背景
前列腺素(Prostaglandins，缩写PGs)是一类重要的具有内源性生理活性的物质，在体内各个组织中广泛存在，是多种生理过程的重要介质。由于在人体中含量极低，临床上前列腺素类药物主要是通过人工合成而来。科立内酯二醇(Corey Lactone Diol)是合成PGF2α前列腺素药物的关键中间体，分子式为C8H12O4，化学名为：六氢-5-羟基-4-羟甲基-2H-环戊并[B]呋喃-2-酮，结构式为：
通常科立内酯二醇化合物分子中含有一对对映异构体，即(3aS,4R,5S,6aR)-六氢-5-羟基-4-羟甲基-2H-环戊并[B]呋喃-2-酮((+)-科立内酯二醇)和(3aR,4S,5R,6aS)-六氢-5-羟基-4-羟甲基-2H-环戊并[B]呋喃-2-酮((-)-科立内酯二醇)，二者互为对映异构体杂质在后续合成中继续参与反应，进而形成多种对应杂质，难以分析分离和去除，严重影响前列腺素类药物的质量。
在众多分析分离光学异构体的方法中，应用手性固定相的液相色谱法较为常见。但科立内酯二醇分子极性较强，且紫外吸收较弱，直接应用手性固定相的液相色谱分析分离科立内酯二醇较为困难。
因此，如何建立一种能够简单、高效的分析分离科立内酯二醇对映异构体的方法，进而实现对其质量的控制，是目前需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供了一种采用柱前衍生的方法，使其能够应用手性固定相的液相色谱法进行分析，进而实现对科立内酯二醇的质量控制。
本发明提供一种通过柱前衍生分析分离科立内酯二醇对映异构体的HPLC方法，采用多糖衍生物类手性色谱柱，使用正相混合溶剂为流动相的正相色谱法进行分析分离。
本发明所述的柱前衍生分析分离科立内酯二醇对映异构体的方法，所使用的衍生化试剂为三苯氯甲烷、苯甲酰氯或1,4-联苯甲酰氯。
进一步地，柱前衍生科立内酯二醇对映异构体的方法，包括以下步骤：
(1)将科立内酯二醇供试品及其对照品分别与衍生化试剂按摩尔比例1:1～1:2溶解到适量吡啶中，恒温0℃～30℃反应1～12h，得反应液；
(2)将反应液与水按体积比为1:5～1:20混合，得混合液；
(3)将混合液用适量乙酸乙脂萃取，分液，浓缩乙酸乙酯层，得到粗品；
(4)将粗品与异丙醚按照质量/体积比为1:2～1:10混合，加热搅拌0.5～1h，冷却至室温，过滤，干燥制得科立内酯二醇衍生物供试品及其对照品。
进一步地，本发明所述的柱前衍生科立内酯二醇对映异构体的方法，所制得的科立内酯二醇衍生物是三苯氯甲烷衍生物、苯甲酰氯衍生物或1,4-联苯甲酰氯衍生物，其结构式分别如下：
图中A是三苯氯甲烷与科立内酯二醇的衍生物，即三苯氯甲烷衍生物；B是苯甲酰氯与科立内酯二醇的衍生物，即苯甲酰氯衍生物；C是1,4-联苯甲酰氯与科立内酯二醇的衍生物，，即1,4-联苯甲酰氯衍生物。由于不同衍生化试剂反应活性不同，所得的科立内酯二醇衍生物有所不同。三苯氯甲烷与科立内酯二醇的伯醇羟基容易发生烷基化反应，得到科立内酯二醇单羟基衍生物；而苯甲酰氯，1,4-联苯甲酰氯与科立内酯二醇的伯醇和仲醇容易同时发生酰化反应，得到科立内酯二醇双羟基衍生物。
本发明所述的一种通过柱前衍生分析分离科立内酯二醇对映异构体的HPLC方法，所使用的多糖衍生物类手性柱可以是硅胶表面涂覆有纤维素类手性色谱柱，硅胶表面涂覆有直链淀粉类手性色谱柱中的一种，具体为硅胶表面涂覆有纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)，硅胶表面涂覆有直链淀粉-三(s)-α-甲基苯基氨基甲酸酯。
本发明所述的一种通过柱前衍生分析分离科立内酯二醇对映异构体的HPLC方法，选用正相色谱法所使用的流动相是正己烷/异丙醇或正己烷/无水乙醇的混合溶剂。
进一步地，所使用的流动相正己烷/异丙醇的体积比例为95:5～50:50；所使用流动相正己烷/无水乙醇的体积比例为95:5～50:50.
本发明所述的分析分离方法，可按照以下方法实现：
(1)科立内酯二醇衍生物对照品用无水乙醇溶解，分别配制成浓度为1μg/mL的科立内酯二醇衍生物的对照品溶液
(2)科立内酯二醇衍生物供试品用无水乙醇溶解，配制成1mL含科立内酯二醇的衍生物1～10μg的供试品溶液；
(3)设置正己烷/异丙醇或正己烷/无水乙醇流动相流速为0.2～1.5mL/min；检测波长为230±5nm；柱温为15-40℃；
(4)取步骤(1)和(2)所制溶液各2～20μL分别注入手性色谱柱(250×4.6mm,5.0μm)，完成科立内酯二醇衍生物对映异构体的分析与分离。
与以往技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明采用的柱前衍生化，所得科立内酯二醇衍生物分子增加了生色团，提高紫外吸收强度，增加了紫外波长处的可检测性；所得科立内酯二醇衍生物分子极性降低，手性固定相对其选择性增加，提高了其对映异构体的分离度；
(2)采用较优选的手性色谱柱，采用较优选的流动相，选用较优的进样量，选用较优的波长，从而确保了衍生物的稳定性，提高了色谱峰的对称性，并且有较好的分离效果；
(3)本发明能够使科立内酯二醇对映异构体适用于手性固定相的液相色谱法分析，进而实现对科立内酯二醇的质量控制。
可见，本发明克服了现有技术的不足，解决了科立内酯二醇对映异构体的分析分离问题，能够快速、准确和高效分析分离科立内酯二醇对映异构体，有效控制其质量，进而确保前列腺素类药物质量和安全性。
因此，本发明开发的一种通过柱前衍生分析分离科立内酯二醇对映异构体的HPLC方法是十分必要的。
附图说明
图1：三苯氯甲烷衍生物HPLC图，色谱条件：色谱柱：BC OD-H(250×4.6mm,5.0μm)；流动相：正己烷-无水乙醇(90:10)；柱温：30℃。
图2：苯甲酰氯衍生物HPLC图，色谱条件：色谱柱：BC AS-H(250mm×4.6mm,5.0μm)；流动相：正己烷-异丙醇(80:20)；柱温：35℃。
图3：1,4-联苯甲酰氯衍生物HPLC图，色谱条件：色谱柱：BC AS-H(250mm×4.6mm,5.0μm)；流动相：正己烷-无水乙醇(70:30)；柱温：30℃。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于具体实施例。
实施例1
1.三苯氯甲烷衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与三苯氯甲烷按摩尔比例1:1溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:5将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到三苯氯甲烷衍生物供试品及两种三苯氯甲烷衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
仪器与条件
色谱柱：BC OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-无水乙醇(95:5)
柱温：40℃
流速：1.5mL/min
检测波长：225nm
分别精密称取上述两种三苯氯甲烷衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取三苯氯甲烷衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为10μg/mL的供试品溶液；分别吸取三苯氯甲烷衍生物对照品及供试品溶液各2μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用三苯氯甲烷衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为14.5.
实施例2
1.三苯氯甲烷衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与三苯氯甲烷按摩尔比例1:1溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:5将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到三苯氯甲烷衍生物供试品及两种三苯氯甲烷衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
仪器与条件
色谱柱：BC OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-无水乙醇(50:50)
柱温：15℃
流速：0.2mL/min
检测波长：230nm
实验步骤
分别精密称取上述两种三苯氯甲烷衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取三苯氯甲烷衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为10μg/mL的供试品溶液；分别吸取三苯氯甲烷衍生物对照品及供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用三苯氯甲烷衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为4.8。
实施例3
1.三苯氯甲烷衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与三苯氯甲烷按摩尔比例1:1溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:5将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到三苯氯甲烷衍生物供试品及两种三苯氯甲烷衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
仪器与条件
色谱柱：BC OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-无水乙醇(90:10)
柱温：30℃
流速：0.8mL/min
检测波长：235nm
实验步骤
分别精密称取上述两种三苯氯甲烷衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取三苯氯甲烷衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为5μg/mL的供试品溶液；分别吸取三苯氯甲烷衍生物对照品及供试品溶液各10μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：见附图1，用三苯氯甲烷衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为9.2。
实施例4
1.三苯氯甲烷衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与三苯氯甲烷按摩尔比例1:1溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:5将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到三苯氯甲烷衍生物供试品及两种三苯氯甲烷衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
仪器与条件
色谱柱：BC OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(95:5)
柱温：40℃
流速：1.5mL/min
检测波长：235nm
实验步骤
分别精密称取上述两种三苯氯甲烷衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取三苯氯甲烷衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的供试品溶液；分别吸取三苯氯甲烷衍生物对照品及供试品溶液各20μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用三苯氯甲烷衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为12.1。
实施例5
1.三苯氯甲烷衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与三苯氯甲烷按摩尔比例1:1溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:5将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到三苯氯甲烷衍生物供试品及两种三苯氯甲烷衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
仪器与条件
色谱柱：BC OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(50:50)
柱温：15℃
流速：0.2mL/min
检测波长：230nm
实验步骤
分别精密称取上述两种三苯氯甲烷衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取三苯氯甲烷衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为10μg/mL的供试品溶液；分别吸取三苯氯甲烷衍生物对照品及供试品溶液各2μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用三苯氯甲烷衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为11.1。
实施例6
1.三苯氯甲烷衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与三苯氯甲烷按摩尔比例1:1溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:5将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到三苯氯甲烷衍生物供试品及两种三苯氯甲烷衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
仪器与条件
色谱柱：BC OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(80:20)
柱温：30℃
流速：0.8mL/min
检测波长：235nm
实验步骤
分别精密称取上述两种三苯氯甲烷衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取三苯氯甲烷衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为5μg/mL的供试品溶液；分别吸取三苯氯甲烷衍生物对照品及供试品溶液各10μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用三苯氯甲烷衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为10.9。
实施例7
1.苯甲酰氯衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与苯甲酰氯按摩尔比例1:2溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:10将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到苯甲酰氯衍生物供试品及两种苯甲酰氯衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
色谱柱：BC OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(90:10)
柱温：30℃
流速：1.0mL/min
检测波长：235nm
分别精密称取上述两种苯甲酰氯衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取苯甲酰氯衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为5μg/mL的供试品溶液；分别吸取苯甲酰氯衍生物对照品及供试品溶液各10μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用苯甲酰氯衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为2.0。
实施例8
1.苯甲酰氯衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与苯甲酰氯按摩尔比例1:2溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:10将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到苯甲酰氯衍生物供试品及两种苯甲酰氯衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
色谱柱：BC OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(70:30)
柱温：35℃
流速：0.5mL/min
检测波长：225nm
分别精密称取上述两种苯甲酰氯衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取苯甲酰氯衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的供试品溶液；分别吸取苯甲酰氯衍生物对照品及供试品溶液各20μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用苯甲酰氯衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为2.5。
实施例9
1.苯甲酰氯衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与苯甲酰氯按摩尔比例1:2溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:10将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到苯甲酰氯衍生物供试品及两种苯甲酰氯衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
色谱柱：BC OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(80:20)
柱温：35℃
流速：0.5mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述两种苯甲酰氯衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取苯甲酰氯衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为10μg/mL的供试品溶液；分别吸取苯甲酰氯衍生物对照品及供试品溶液各2μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用苯甲酰氯衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为2.4。
实施例10
1.苯甲酰氯衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与苯甲酰氯按摩尔比例1:2溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:10将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到苯甲酰氯衍生物供试品及两种苯甲酰氯衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
色谱柱：BC OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-无水乙醇(90:10)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述两种苯甲酰氯衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取苯甲酰氯衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的供试品溶液；分别吸取苯甲酰氯衍生物对照品及供试品溶液各20μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用苯甲酰氯衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为1.7。
实施例11
1.苯甲酰氯衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与苯甲酰氯按摩尔比例1:2溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:10将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到苯甲酰氯衍生物供试品及两种苯甲酰氯衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
色谱柱：BC OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-无水乙醇(70:30)
柱温：30℃
流速：0.5mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述两种苯甲酰氯衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取苯甲酰氯衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为5μg/mL的供试品溶液；分别吸取苯甲酰氯衍生物对照品及供试品溶液各10μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用苯甲酰氯衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为2.0。
实施例12
1.苯甲酰氯衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与苯甲酰氯按摩尔比例1:2溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:10将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到苯甲酰氯衍生物供试品及两种苯甲酰氯衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
色谱柱：BC OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-无水乙醇(80:20)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：225nm
分别精密称取上述两种苯甲酰氯衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取苯甲酰氯衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为10μg/mL的供试品溶液；分别吸取苯甲酰氯衍生物对照品及供试品溶液各2μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用苯甲酰氯衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为1.6。
实施例13
1.苯甲酰氯衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与苯甲酰氯按摩尔比例1:2溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:10将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到苯甲酰氯衍生物供试品及两种苯甲酰氯衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
色谱柱：BC AS-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(80:20)
柱温：35℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述两种苯甲酰氯衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取苯甲酰氯衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的供试品溶液；分别吸取苯甲酰氯衍生物对照品及供试品溶液各20μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：见附图2，用苯甲酰氯衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为2.2。
实施例14
1.苯甲酰氯衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与苯甲酰氯按摩尔比例1:2溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:10将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到苯甲酰氯衍生物供试品及两种苯甲酰氯衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
色谱柱：BC AS-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(60:40)
柱温：30℃
流速：0.5mL/min
检测波长：235nm
分别精密称取上述两种苯甲酰氯衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取苯甲酰氯衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为5μg/mL的供试品溶液；分别吸取苯甲酰氯衍生物对照品及供试品溶液各10μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用苯甲酰氯衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为1.5。
实施例15
1.苯甲酰氯衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与苯甲酰氯按摩尔比例1:2溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:10将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到苯甲酰氯衍生物供试品及两种苯甲酰氯衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
色谱柱：BC AS-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(70:30)
柱温：30℃
流速：1.0mL/min
检测波长：225nm
分别精密称取上述两种苯甲酰氯衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取苯甲酰氯衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为10μg/mL的供试品溶液；分别吸取苯甲酰氯衍生物对照品及供试品溶液各2μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用苯甲酰氯衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为1.7。
实施例16
1.苯甲酰氯衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与苯甲酰氯按摩尔比例1:2溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:10将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到苯甲酰氯衍生物供试品及两种苯甲酰氯衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
色谱柱：BC AS-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-无水乙醇(90:10)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述两种苯甲酰氯衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取苯甲酰氯衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的供试品溶液；分别吸取苯甲酰氯衍生物对照品及供试品溶液各15μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用苯甲酰氯衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为3.7。
实施例17
1.苯甲酰氯衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与苯甲酰氯按摩尔比例1:2溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:10将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到苯甲酰氯衍生物供试品及两种苯甲酰氯衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
色谱柱：BC AS-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-无水乙醇(80:20)
柱温：30℃
流速：1.0mL/min
检测波长：235nm
分别精密称取上述两种苯甲酰氯衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取苯甲酰氯衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为5μg/mL的供试品溶液；分别吸取苯甲酰氯衍生物对照品及供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用苯甲酰氯衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为2.6。
实施例18
1.苯甲酰氯衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与苯甲酰氯按摩尔比例1:2溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:10将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到苯甲酰氯衍生物供试品及两种苯甲酰氯衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
色谱柱：BC AS-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-无水乙醇(70:30)
柱温：30℃
流速：0.5mL/min
检测波长：235nm
分别精密称取上述两种苯甲酰氯衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取苯甲酰氯衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为10μg/mL的供试品溶液；分别吸取苯甲酰氯衍生物对照品及供试品溶液各2μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用苯甲酰氯衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为2.7。
实施例19
1.1,4-联苯甲酰氯衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与1,4-联苯甲酰氯按摩尔比例1:2溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:20将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到1,4-联苯甲酰氯衍生物供试品及两种1,4-联苯甲酰氯衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
色谱柱：BC AS-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-无水乙醇(80:20)
柱温：35℃
流速：1.0mL/min
检测波长：225nm
分别精密称取上述两种1,4-联苯甲酰氯衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取1,4-联苯甲酰氯衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的供试品溶液；分别吸取1,4-联苯甲酰氯衍生物对照品及供试品溶液各10μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用1,4-联苯甲酰氯衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为4.2。
实施例20
1.1,4-联苯甲酰氯衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与1,4-联苯甲酰氯按摩尔比例1:2溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:20将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到1,4-联苯甲酰氯衍生物供试品及两种1,4-联苯甲酰氯衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
色谱柱：BC AS-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-无水乙醇(50:50)
柱温：25℃
流速：0.5mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述两种1,4-联苯甲酰氯衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取1,4-联苯甲酰氯衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为5μg/mL的供试品溶液；分别吸取1,4-联苯甲酰氯衍生物对照品及供试品溶液各10μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用1,4-联苯甲酰氯衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为2.5。
实施例21
1.1,4-联苯甲酰氯衍生科立内酯二醇的方法：
将科立内酯二醇供试品、(+)-科立内酯二醇对照品、(-)-科立内酯二醇对照品分别与1,4-联苯甲酰氯按摩尔比例1:2溶解到适量吡啶中，恒温反应；按体积比1:20将反应液与水混合；将混合液用适量乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得粗品；粗品用适量异丙醚重结晶，得到1,4-联苯甲酰氯衍生物供试品及两种1,4-联苯甲酰氯衍生物对照品。
2.液相色谱分析方法
色谱柱：BC AS-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-无水乙醇(70:30)
柱温：30℃
流速：1.0mL/min
检测波长：235nm
分别精密称取上述两种1,4-联苯甲酰氯衍生物对照品分别用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为1μg/mL的对照品溶液；精密称取1,4-联苯甲酰氯衍生物供试品用无水乙醇溶解，稀释，配制成浓度为10μg/mL的供试品溶液；分别吸取1,4-联苯甲酰氯衍生物对照品及供试品溶液各2μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：见附图3，用1,4-联苯甲酰氯衍生的科立内酯二醇对映异构体能够有效分离，分离度为2.6。

Claims (7)

1.一种通过柱前衍生分析分离科立内酯二醇对映异构体的HPLC方法，采用多糖衍生物类手性色谱柱，使用正相混合溶剂为流动相的正相色谱法进行分析分离。
2.根据权利要求1所述的一种通过柱前衍生分析分离科立内酯二醇对映异构体的HPLC方法，其特征在于，所述的柱前衍生的方法所用的衍生化试剂可以是三苯氯甲烷、苯甲酰氯、或1，4-联苯甲酰氯；所制得的科立内酯二醇衍生物分别是三苯氯甲烷衍生物、苯甲酰氯衍生物、或1，4-联苯甲酰氯衍生物。
3.根据权利要求2所述的柱前衍生化方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)将科立内酯二醇供试品及对照品分别与衍生化试剂按摩尔比例1:1～1:2溶解到适量吡啶中，恒温0℃～30℃反应1～12h，得反应液；
(2)将反应液与水按体积比为1:5～1:20混合，得混合液；
(3)将混合液用适量乙酸乙脂萃取，分液，浓缩乙酸乙酯层，得到粗品；
(4)将粗品与异丙醚按照质量/体积比1:2～1:10混合，加热搅拌0.5～1h，冷却至室温，过滤，干燥得科立内酯二醇衍生物。
4.根据权利要求1和2所述的一种通过柱前衍生分析分离科立内酯二醇对映异构体的HPLC方法，其特征在于，所述的分析分离三苯氯甲烷衍生物所用的手性色谱柱填料为硅胶表面涂覆有纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；所用的流动相为正己烷/异丙醇混合溶剂或正己烷/无水乙醇混合溶剂；所用的正己烷/异丙醇或正己烷/无水乙醇混合溶剂的体积比例为95:5～50:50。
5.根据权利要求1和2所述的一种通过柱前衍生分析分离科立内酯二醇对映异构体的HPLC方法，其特征在于，所述的分析分离苯甲酰氯衍生物所用的手性色谱柱填料为硅胶表面涂覆有直链淀粉-三(s)-α-甲基苯基氨基甲酸酯或硅胶表面涂覆有纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；所用的流动相为正己烷/异丙醇混合溶剂或正己烷/无水乙醇混合溶剂；所用的正己烷/异丙醇混合溶剂的体积比例为90:10～60:40，正己烷/无水乙醇混合溶剂的体积比例为90:10～70:30。
6.根据权利要求1和2所述的一种通过柱前衍生分析分离科立内酯二醇对映异构体的HPLC方法，其特征在于，所述的分析分离1，4-联苯甲酰氯衍生物所用的手性色谱柱填料为硅胶表面涂覆有直链淀粉-三(s)-α-甲基苯基氨基甲酸酯；所用的流动相为正己烷/无水乙醇混合溶剂；所用的正己烷/无水乙醇混合溶剂的体积比例为80:20～50:50。
7.根据权利要求1所述的一种通过柱前衍生分析分离科立内酯二醇对映异构体的HPLC方法，其特征在于，所述的分析分离方法具体包括以下步骤：
(1)科立内酯二醇衍生物对照品用无水乙醇溶解，分别配制成浓度为1μg/mL的科立内酯二醇衍生物的对照品溶液
(2)科立内酯二醇衍生物供试品用无水乙醇溶解，配制成1mL含科立内酯二醇的衍生物1～10μg的供试品溶液；
(3)设置正己烷/异丙醇或正己烷/无水乙醇流动相流速为0.2～1.5mL/min，检测波长为230±5nm，柱温为15～40℃；
(4)取步骤(1)和(2)所制溶液各2～20μL分别注入手性色谱柱(250×4.6mm,5.0μm)，完成科立内酯二醇衍生物对映异构体的分析与分离。
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