CN107050043B - 一种玉米须多糖联合药物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种玉米须多糖联合药物制剂，属于药物应用技术领域。解决的问题是如何发挥玉米多粮的抗丙肝病毒功能，提供一种玉米须多糖联合药物制剂，包括以下重量份的成分：玉米须多糖：1.3～1.8；2‑脱氧‑D‑葡萄糖：0.3～0.7；明胶：5～15；药学上可接受的载体：0～8。使能够起到诱生IFN、下调细胞膜胆固醇的含量和影响Jak‑STAT抗病毒信号通路及肿瘤凋亡相关的BAX‑Bcl2通路和通过上调凋亡相关蛋白和抑制抗凋亡蛋白，从而起到双重的引起HCV感染细胞的调亡。

Description

一种玉米须多糖联合药物制剂
技术领域
本发明涉及一种玉米须多糖联合药物制剂，属于药物应用技术领域。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)是丙型肝炎的病原体，是导致输血后肝炎和急慢性非甲、非乙型肝炎的主要至病因子。虽然，近年来，随着基因工程技术的发展和应用，核酸疫苗、合成肽疫苗等新型疫苗的研制日益成为医学领域的一大研究热点，但是，对于核酸疫苗效果的稳定性和确定性方面还尚存在不足。
虽然，目前市场上对于佐剂的种类较多，但真正能够应用在临床上的药物还是少之又少。因此，对于抗丙肝类药物的研究和开发是具有很好的市场价值的。
目前，对于植物提取中多糖类物质的研究也是一个比较热的话题。主要是由于多肽和多糖是常见的具有增强免疫作用的活性物质，活性多肽和多糖被开发成多种药物制剂，在用于自身免疫性疾病、感染性疾病及炎症介导的疾病辅治疗，取得了一定的研究成果。部分植物多糖在临床上也有应用，如香菇多糖、紫芝多糖等等，但主要是用于治疗免疫功能不良所致的疾病或辅助治疗。
而玉米须多糖是玉米须中所含重要的成分之一，现有的文献研究表明玉米须多糖具有护肝、降糖、调节免疫、抗菌和抗肿瘤等作用。但是，目前的研究都还没有明确表明其具体是通过哪种方式来达到相应的功能，且基本上都仅仅是单独研究多糖本身的功能而很少去研究其与其它药物之间的联合药效来进行研究，主要原因还是由于现有文献中都还不能明确其具体的作用靶向。
如中国专利申请(公开号：CN104961842A)公开了一种具有免疫调节作用的玉米须超滤多糖的制备方法，且具有公开了玉米须多糖在免疫调节方面的作用主要是提高刺激淋巴细胞增殖作用来实现调节免疫的功能，也仅是单独研究了玉米须多糖的免疫作用机制。
发明内容
本发明针对以上现有技术中存在的缺陷，提出一种玉米须多糖联合药物制剂，解决的问题是如何使玉米须多糖在抗丙肝病毒中发挥功能及作用。
本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的，一种玉米须多糖联合药物制剂，该药物制剂包括以下重量份的成分：
玉米须多糖：1.3～1.8；2-脱氧-D-葡萄糖：0.3～0.7；明胶：5～15；药学上可接受的载体：0～8。
本发明人经过研究发现通过采用玉米须多糖和2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)联合用药，能够起到诱生IFN、下调细胞膜胆固醇的含量和影响Jak-STAT抗病毒信号通路及肿瘤相关的PI3K-AKT通路，从而引起HCV病毒在感染细胞中复制的下调；同时，还能够通过上调凋亡相关蛋白和抑制抗凋亡蛋白，从而起到双重的引起HCV感染细胞的调亡。加入的明胶能够有效的将活性药物包裹有利于制成缓释型的制剂，而药学上可接受的载体则可以采用药物制剂中常用的材料即可，这里载体的选择对药物的活性成分影响并不是太大，主要是根据药物制剂的剂型进行适当的调整即可。
在上述玉米须多糖联合药物制剂中，作为优选，所述药物缓释微球的载药量为9.0wt％～10wt％。通过控制载药量的含量，相当于使具有活性成分的药物之间达到较好的联合作用，从而更好的抑制HCV感染细胞的作用，达到抗丙肝的效果。
在上述玉米须多糖联合药物制剂中，作为优选，所述药物制剂能够促进HCV细胞凋亡。主要可能是由于在玉米须多糖和2-DG的联合作用下，下调了细胞膜脂筏胆固醇的含量，从而抑制HCV与细胞脂筏的融合及HCV感染细胞的细胞膜相关复合体的形成，进而影响HCV的穿入、复制和释放，并能够通过诱导细胞凋亡、加速HCV感染细胞的凋亡，从而达到具有抗HCV感染的功能和清除癌变细胞的功能。
在上述玉米须多糖联合药物制剂中，作为优选，所述药物制剂中2-脱氧-D-葡萄糖：玉米须多糖的质量比为1.0：3.0～3.2。通过联合用药后，能够更好的激活药物对HepG2细胞的作用，从而抑制HepG2细胞及HCV感染后HepG2所形成的瘤组织增长，达到兼具抗丙肝病毒和清除癌变细胞的功能，有效防止了丙肝炎症引发的癌变风险，起到较好的预防或治疗的功能。
在上述玉米须多糖联合药物制剂中，作为优选，所述玉米须多糖主要包括以下质量比的单糖：
葡萄糖：半乳糖：甘露聚糖：木糖：阿拉件糖和鼠李糖的质量比为18～20：12～15：3～1：1～1.5：0.8～1.0：0.7～0.8。使具有较好的抗丙肝病毒功能，一般最好使玉米须糖中的多糖含量≥95％。
在上述玉米须多糖联合药物制剂中，作为优选，所述药学上可接受的载体选自填充剂、赋形剂、矫味剂和粘合剂中的一种或几种。这些载体均是较易得到的辅助材料，有利于药物制剂的成型和提高稳定性。其中的填充剂如乳糖、微晶纤维素等；赋形剂如聚维酮；粘合剂如PVP K30等等，矫味剂如柠檬香精等类似材料，一般最好使药学上可接受的载体的重量份在2.0～5.0，有利于药物制剂的成型等。
在上述玉米须多糖联合药物制剂中，作为优选，所述药物制剂的剂型为缓释微球。通过使药物制成相应的缓释微球，能够延长活性药物的释放速度，使具有更好的药物作用时效。
综上所述，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
本发明的玉米须多糖联合药物制剂，通过采用玉米须多糖和2-DG联合用药，使能够起到诱生IFN、下调细胞膜胆固醇的含量和影响Jak-STAT抗病毒信号通路及肿瘤凋亡相关的BAX-Bcl2通路；同时，还能够通过上调凋亡相关蛋白和抑制抗凋亡蛋白，从而起到双重的引起HCV感染细胞的调亡。
附图说明
图1是本发明玉米须多糖联合药物制剂对HeP G2细胞作用的荧光免疫分析图。
图2是本发明玉米须多糖联合药物制剂对HeP G2细胞作用的细胞凋亡分析图。
图3是本发明玉米须多糖联合药物制剂中不同玉米须多糖浓度对细胞膜中胆固醇含量的影响分析图。
图4是本发明玉米须多糖联合药物制剂中不同玉米须多糖浓度的Realtime PCR分析图。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。
实施例1
以下实施例中用到的玉米须多糖可以通过以下方法制备得到：
采集新鲜的玉米须，洗净切碎，用80％食用酒精浸泡2-4次，除去色素和醇溶性物质后，烘干，再进行粉碎得到玉米须干粉，过60目筛；取玉米须干粉按液料体积比1:60加水，相当于1g玉米须干粉加入60mL的水，然后升温将体系温度升温至95℃左右回流并在搅拌状态下提取3h，提取结束后，控制转速在2500r/min的条件下进行离心30min，重复提取2次，合并提取液；用旋转蒸发仪减压浓缩至稠,得到相应的浓缩液；再加入该浓缩液体积1/5的氯仿-正丁醇(5:1)溶液震荡30min，经9000rpm离心去除蛋白沉淀，重复多次至无明显的沉淀产生；然后用截留分子量为3500D的透析袋对其透析2天，去掉小分子单糖；剩余液体置3倍体积95％乙醇充分搅拌后经4800r/min离心20min得到白色沉淀；经无水乙醇反复洗涤，冻干后即得玉米须多糖。
将得到的玉米须多糖进行相应的性能测试，即将该多糖先后经过低压层析系统过DEAE-SepharoseFast Flow离子交换柱和SephadexG-150柱,：以葡聚糖为标准品，红外光谱及凝胶渗透色谱法(GPC)证实所提取的产物为约987761Da的多糖；采用苯硫酸法测得所提取产物的糖含量＞95％；分光光度计检测显示蛋白含量<8％，LAL分析证实无LPS污染。
再采用HPLC Agilent carbohydrate柱,分析多糖水解样品的单糖组成,结果表明本玉米须多糖的主要单糖成分是葡萄糖：半乳糖：甘露聚糖：木糖：阿拉伯糖和鼠李糖的质量比为18：12：3：1：0.8：0.7,且具有较高的糖醛酸含量。实验所获得的玉米须多糖为白色粉末,不溶于酒精、甲醇等有机溶剂,在水中的溶解度最高在39mg/mL左右,高于此浓度多糖水溶液失去流动性成果冻状。该糖有较强的粘性和吸湿性,易霉变,不易保存。用水将其溶解后粘度较高,流动性较差,不利于扩散。一般使玉米须多糖的主要单糖成分葡萄糖、半乳糖、甘露聚糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖的质量比为18～20：12～15：3～1：1～1.5：0.8～1.0：0.7～0.8均可。
实施例2
本实施例中的药物制剂的剂型为缓释微球，且该药物缓释微球包括以下重量份的成分：
玉米须多糖：1.5；2-脱氧-D-葡萄糖：0.5；明胶：10。
该缓释微球的具体制备方法可以采用以下方法得到：
按照100mL的体积进行制备，采用乳化交联法进行加工，以明胶为载体包裹玉米须多糖和2-DG。
按照上述各原料的重量份比例选取原料，选取少量的明胶于60℃溶于适量水中，再将玉米须多糖和2-DG进行充分混合，通过加入水的量来调整混合液的体积到100mL，并使混合液中明胶的含量为100mL混合液中含有10g的明胶，使玉米须多糖的浓度为15mg/mL，2-DG的浓度为5mg/mL，得到相应的活性药物的水相溶液；再在液体石蜡中加入1％S-80乳化剂混合均匀后作为油相连续相，并最好设置W/O为1：4。然后，保持体系温度在60℃的条件下，将上述活性药物的水相溶液缓慢加入液体石蜡中并在磁力搅拌器下充分搅拌，待充分乳化后迅速冷却至4℃以下，并保持搅拌，最后加入1％的戊二酸进行固化2h，最后，离心，取固体物，用异丙醇或丙醇进行洗涤去除残留的油质和戊二酸，冻干，得到相应的缓释微球。该缓释微球的载药量达到9.73％，药物包封率为93％。
实施例3
本实施例中的药物制剂的剂型为缓释微球，且该药物缓释微球包括以下重量份的成分：
玉米须多糖：1.8；2-脱氧-D-葡萄糖：0.4；明胶：12。
其中玉米须多糖中主要包括以下质量比的单糖组成：
葡萄糖：半乳糖：甘露聚糖：木糖：阿拉件糖和鼠李糖的质量比为18：12：3：1：0.8：0.7。
使上述缓释微球中的药物载药量为9.0％。
该缓释微球的具体制备方法同实施例2一致，这里不再赘述。
实施例4
本实施例中的药物制剂的剂型为缓释微球，且该药物缓释微球包括以下重量份的成分：
玉米须多糖：1.3；2-脱氧-D-葡萄糖：0.3；明胶：5.0；药学上可接受的载体：8.0，其中，药学上可接受的载体为微晶纤维素。
使上述缓释微球中的药物载药量为9.48％。
该缓释微球的具体制备方法同实施例2一致，这里不再赘述。
实施例5
本实施例中的药物制剂的剂型为缓释微球，且该药物缓释微球包括以下重量份的成分：
玉米须多糖：1.8；2-脱氧-D-葡萄糖：0.7；明胶：15；药学上可接受的载体：2。其中，药学上可接受的载体为填充剂、赋形剂、矫味剂和粘合剂中的一种或几种混合。
使上述缓释微球中的药物载药量为9.53％。
该缓释微球的具体制备方法同实施例2一致，这里不再赘述。
随机选取上述实施例2中的相应的玉米须多糖与2-DG联合用药在抗HCV感染方面的作用分析。
建立HCV感染的人肝癌细胞模型：
自台州市立医院收集丙肝病毒(HCV)mRNA阳性、血清抗体阴性的丙肝早期患者无菌血清。
取对数生长期的HepG2细胞以1×105细胞/孔的浓度种入6孔培养板并过夜培养，加入HCV阳性患者血清0.5mL(以正常人血清做对照)体外感染HepG2细胞，并以含有10％胎牛血清DMEM补足培养液，感染4h后弃去培养上清液，且PBS清洗4次后，加入含有10％胎牛血清的DMEM完全培养液进行培养，分别于培养24、48和72h取培养细胞经免疫荧光及RT-PCR加以鉴定。
电镜分析：
将上述建立的HCV感染的HepG2细胞经3mg/L玉米须多糖、以及采用3mg/L玉米须多糖和1mg/L2-DG联合用药后进行共孵育48h后进行具体的电镜分析。具体分析结果表明，用药前这个病毒颗粒大量存在于线粒体部位，大小30-80nm；而通过单独采用玉米须多糖药物使用共孵育48小时后，明显显示病毒颗粒减少；而通过采用玉米须多糖和2-DG联合用药后其病毒颗粒完全消失。通过上述对比数据表明本发明通过采用玉米须多糖与2-DG联合用药后具有较好的抗HCV病毒感染的作用效果。
进行荧光免疫分析和细胞凋亡分析：
将上述建立HCV感染的HepG2细胞经单独采用3mg/L玉米须多糖、以及采用3mg/L玉米须多糖和1mg/L的2-DG联合用药后进行共孵育48h后，以建立HCV感染的HepG2细胞为空白进行对照。
按照常规方法制备细胞爬片，免疫荧光染色后共聚焦分析。具体分析结果如图1所示，其中，图1A Hep细胞为对照的荧光免疫分析图，图1B是经浓度为3mg/mL的玉米须多糖与HepG2细胞共孵育48小时后的荧光免疫分析图，图1C是经本发明玉米须多糖联合药物制剂(浓度为3mg/mL的玉米须多糖和1mg/mL的2-DG)与HepG2细胞共孵育48小时后的荧光免疫分析图。从图1中可以看出，单独采用玉米须多糖只能部分抑制HCV NS1蛋白表达(图1B)；而通过采用本发明的玉米须多糖和2-DG联合作用后，能够使HCV基因表达完全受抑制(图1C)，所以说本发明经过研究通过采用玉米须多糖与2-DG联合用药具有很好的抗丙肝病毒的效果。采用流式细胞分析仪检测细胞凋亡，检测结果如图2所示，其中，图2A是以Hep细胞为对照的细胞凋亡分析图；图2B是经浓度为3mg/mL的玉米须多糖与HepG2细胞共孵育48小时后的细胞凋亡分析图；图2C是经本发明玉米须多糖联合药物制剂(浓度为3mg/mL的玉米须多糖和1mg/mL的2-DG)与HepG2细胞共孵育48小时后的细胞凋亡分析图；图2D以HCV感染后HepG2细胞为对照的细胞凋亡分析图；图2E是经浓度为3mg/mL的玉米须多糖与HCV感染后的HepG2细胞共孵育48小时后的细胞凋亡分析图；图2F是经本发明玉米须多糖联合药物制剂(浓度为3mg/mL的玉米须多糖和1mg/mL的2-DG)与HCV感染后的HepG2细胞共孵育48小时后的细胞凋亡分析图。从图2中可以看出，玉米须多糖与2-DG联合作用这两种用药方式均对肝癌细胞或HCV感染后的肝癌细胞具有凋亡诱导作用，且对HCV感染细胞的促凋亡作用更明显。如图2B所示，玉米须多糖单独应用能够诱导肝癌细胞的凋亡，当采用本发明玉米须多糖和2-DG联合作用后则肝癌细胞凋亡比例明显增加(图2C)，即本发明抗肝癌作用更明显。玉米须多糖单独应用能够诱导HCV感染细胞的凋亡(图2E)，而通过采用本发明的玉米须多糖和2-DG联合作用后能够达到很好的凋亡诱导作用(图2F)。因此，本发明即具备抗HCV感染细胞的作用，又具备抗HCV感染后引起的肝癌的作用。
将上述建立HCV感染的HepG2细胞2×107，100μl腹股沟注射裸鼠，6天后，喂食本发明的玉米须多糖联合药物制剂缓释微球，剂量按照玉米须多糖用药剂量为1～100mg/kg，2-DG用药剂量为1～50mg/kg，通过连续给药4天后，于注射HCV感染的HepG2细胞后第18天杀鼠取瘤进行称重，用4％多聚甲醛固定后，制备蜡块，免疫组化检测HCV NS1蛋白。结果表明，通过采用玉米须多糖和2-DG联合用药后，能够起到很好治疗效果，且使HCV感染细胞中HCVNS1能够完全转阴；同时，还一定程度上抑制HepG2细胞及HCV感染后HepG2细胞所形成的瘤组织增长的效果。
将本发明中的玉米须多糖与HepG2细胞共孵育48小时后，且使玉米须多糖的浓度不同进行比较说明。将共孵育结束后经过离心5min，PBS缓冲液洗细胞沉淀2次，再加入正已烷和异丙醇(体积比为3：2)0.5mL,在37℃条件下裂解细胞1小时，离心后将有机相液体移至另一离心管中，经氮气吹干。利用胆固醇测定试剂盒，借助荧光分光光度计检测荧光强度，激发波长为563nm，长射波长为584nm-590nm。具体检测结果如图3所示，横坐标表示玉米须多糖的浓度(μg/L)，纵坐标表示胆固醇水平(％)。从图3中可以看出本发明中的玉米须多糖能够下调肝癌细胞膜胆固醇水平，且胆固醇下调的幅度与多糖浓度正相关。
将本发明中的玉米须多糖与感染后HepG2细胞共孵育48小时后，且使玉米须多糖的浓度不同进行比较说明。提取细胞内mRNA逆转录后，以下表1中序列为引物，进行Realtime PCR分析。
表1：
Figure BDA0001308186900000101
具体的分析结果如图4所示，从图4中可以看出，本发明中的玉米须多糖与2-DG联合用药能够上调细胞内凋亡相关基因或病毒复制抑制基因STAT3、STAT5、IFN-γ、Caspase-3、Bax的表达，并下调抗凋亡相关基因Bcl-2的表达。作用的效果与其用药的剂量正相关。本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims (7)

1.一种用于抗丙型肝炎病毒感染的玉米须多糖联合药物制剂，其特征在于，该药物制剂包括以下重量份的成分：
玉米须多糖：1.3～1.8；2-脱氧-D-葡萄糖：0.3～0.7；明胶：5～15；药学上可接受的载体：0～8。
2.根据权利要求1所述玉米须多糖联合药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的载药量为9.0wt％～10wt％。
3.根据权利要求1所述玉米须多糖联合药物制剂，其特征在于，所述药物制剂能够促进HCV细胞凋亡。
4.根据权利要求1或2或3所述玉米须多糖联合药物制剂，其特征在于，所述药物制剂中2-脱氧-D-葡萄糖：玉米须多糖的质量比为1.0：3.0～3.2。
5.根据权利要求1或2或3所述玉米须多糖联合药物制剂，其特征在于，所述玉米须多糖主要包括以下质量比的单糖：
葡萄糖：半乳糖：甘露聚糖：木糖：阿拉件糖和鼠李糖的质量比为18～20：12～15：3～1：1～1.5：0.8～1.0：0.7～0.8。
6.根据权利要求1所述玉米须多糖联合药物制剂，其特征在于，所述药学上可接受的载体选自填充剂、赋形剂、矫味剂和粘合剂中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述玉米须多糖联合药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的剂型为缓释微球。
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