CN107050014A - 青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤药的应用 - Google Patents

Abstract

青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤药的应用涉及医疗卫生领域。将青蒿琥酯作为白血病肿瘤靶向抑制STAT3的化疗药物。可以快速、有效的抑制STAT3的表达水平，从而实现对白血病的治疗，青蒿琥酯对THP‑1细胞增殖有很强的抑制作用，ART能诱导THP‑1细胞凋亡，进一步还证明了ART能显著降低STAT3蛋白水平，同时激活Caspase8、Caspase3蛋白从而诱导细胞凋亡。通过对THP‑1细胞移植瘤鼠模型腹腔注射ART后发现ART能明显抑制肿瘤的生长，并且下调肿瘤组织中的STAT3表达水平。实验表明，ART通过下调STAT3的表达，同时激活凋亡蛋白Caspase8、Caspase3从而发挥对THP‑1的抗肿瘤效应。

Description

青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤药的应用

技术领域

本发明涉及医疗卫生领域，具体涉及对人体基本无毒副作用且效果极佳的药物，该药物是指将青蒿琥酯作为白血病肿瘤靶向抑制STAT3的化疗药物。

背景技术

近年来，随着工作压力大、环境、食物、放射性物质等各类内外因素，肿瘤的患者群体数量一直呈高速增长的趋势。白血病（ leukemia）是造血干/祖细胞恶性疾病。以骨髓与外周血中原始和幼稚细胞异常增生为主要特征，临床表现为贫血、出血、感染和发热、脏器浸润、代谢异常等，多数病例病情急重，预后凶险，如不及时治疗常可危及生命。有化疗、诱导分化（全反式维甲酸）、骨髓移植等疗法。

现有治疗方法，多采用放/化疗及骨髓移植，但骨髓移植对人体的损伤极大，不仅还会产生移植物抗宿主等副作用，也即是说有明显的排异反应，即使这样，仍然有复发的可能，而放/化疗的过程不仅会杀死肿瘤细胞，还同时会杀死人体健康细胞，从而使患者体质虚弱免疫力下降，多数白血病患者体内的肿瘤细胞又会死灰复燃，无病生存率低。所以纯西医的方法治疗白血病存在极大的隐患，而治疗过程也极为痛苦，毒副作用比较大。

随着对普通民众对中医药认识的逐步加深，且中药的毒副作用小的特点（合理配伍的情况下，甚至可以做到没有副作用），越来越多的研究者开始研究中医药治疗肿瘤，但中医采用辩证的方法根据人体的不同症状施药治疗，不同的肿瘤，药方不同，药方中作为主治效果的君药也不同，所以就出现同一味药，不同病症的药方中作用不同。例如：甘草，如果是在咳嗽的患者药方中，甘草的作用是润肺止咳的效用，但在多数含有药性较烈的药方中，甘草起的作用是缓和药性、甚至是去除药方毒性的佐或使的作用。中医辩证的过程对医生的要求较高，如果辩证错误，甚至可能导致对人体的极大的损伤。

为解决西药规范化但对人体有害、而中药需一人一方推广有困难的技术问题，所以才有了将中药组方的君药或臣药有效成分提取物进行提取处理，在无极大毒副作用的前提下（微小、对人体无本质伤害的），作用于人体，摒弃君药或臣药中对人体有毒害的成分，可以使对相关病征的某些有效的抑制、灭杀成分直达病灶，这种做法既不会对患者造成较大的操作，还可以利用西医的规范化治疗方法对病征进行及时有效的治疗。这种思路下，既避免现有技术放/化疗手段的对身体的损伤，同时还保证了治疗的效果。将中医和西医结合起来，采用西医的快速精准诊断、标准化给药方式、中药提取物的有效成分区分，合力构成以中药提取物对各病征进行精准、有效治疗。

从西医的角度来讲，肿瘤属于局部组织细胞增生所形成的新生物（neogrowth），因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物。但同样是人，为什么有人患肺肿瘤，但有人却是患肝肿瘤，还有的人是白血病肿瘤。在西医里是不需要分析原因，把坏细胞杀死（可能治疗过程中，把好的细胞也一并杀死了），而中医则讲究究竟是人体的什么地方出了问题从而导致肿瘤的发生，而针对该问题采用什么样的药物，具体到中西医结合时，就是药物中哪些有效组分是起作用的，选用中药针对该病征的有效成分，忽略药物其它成分对人身体起其它作用的，并且应用西医的规范、标准化治疗应用于绝大多数的患者，并且取得较好的治疗效果。而具体采用哪些中药的哪些有效成分应用于哪种病症，就是创新点所在。

据报道，我国各地区白血病的发病率在各种肿瘤中占第六位。尽管目前已使用包括强化疗和造血干细胞移植等治疗方案，其复发率仍接近40-50%，总体预后差，3年无病生存率仅30%。因此研发新的安全、有效且低毒性的药物来改善白血病的预后是非常重要的。

白血病的中医辩证结论如下：（1）气阴两虚症状：神疲乏力，低热，五心烦热，自汗盗汗，衄血或紫斑，时隐时现，面色不华。舌嫩红，苔薄白，脉细数无力。多见于贫血为主的白血病。证候分析：体弱久病或饮食失调而致元气不足，脏腑虚衰，故神疲乏力，面色不华；气虚表卫不固，则自汗；气虚不能统摄，血因之而外溢，或见衄血，或紫斑时隐时现；虚火内扰，可见低热，五心烦热，盗汗等；舌嫩红，苔薄白，脉细数无力，为气阴两虚之征。辨证施治：益气养阴，泻火解毒。（2）热毒炽盛症状：起病急，壮热口渴，骨节疼痛，肌肤灼热，周身出现瘀点，时有肌衄，鼻衄，齿衄，小便黄赤，大便秘结。舌苔垢腻，脉滑数。多见于以发热为主的白血病。证候分析：正气不足，毒邪易侵，热毒由表入里，伤及营阴，营血热炽，故起病急，壮热口渴，肌肤灼热；阴精受损，内热熏蒸，热伤血络，迫血妄行，故见周身瘀点，肌衄，鼻衄，齿衄；累及于肾，而肾主骨，故有关节疼痛；；小便黄赤，大便秘结，舌苔垢腻，脉滑数均为热毒炽盛之象。辨证施治：清热解毒，凉血泻火。（3）痰瘀阻结症状：身微热，面色不华，神疲乏力，颌下、颈部、腋窝痰核，不红不痛，或腹内疤积，骨节疼痛。舌淡紫，苔薄，脉弦滑或弦数。多见于淋巴细胞性白血病。证候分析：精气内虚，毒邪乘虚而入，耗伤气阴，故见身微热，神疲乏力，面色不华；病程稍久，气血亏虚汽滞血瘀，脉络阻塞，结于胁下，形成疤块，留于肢节，可见骨节疼痛；气不化津，聚液成痰，与瘀血交阻，而见颌下、颈部、腋窝痰核；舌淡紫，苔薄，脉弦滑为痰瘀互结之征。辨证施治：清热行瘀，消痰散结。

青蒿琥酯（Artesµnate，ART）是从菊科植物黄花蒿（ArteMisia annua L）中提取出来的一种半合成衍生物，是一线的抗疟药物，不良反应轻微，临床应用安全性高。它不仅具有显著的抗疟效应，而且还具有抗病毒、抗炎、抗血管生成、抗癌等多种生物功能。近年来，关于ART抗癌作用的研究较多,发现ART对多种癌细胞有抗癌效应。ART能抑制食管鳞状细胞癌和肝癌细胞HepG2的增殖和迁移；诱导人恶性胶质瘤细胞LN-229和人神经鞘瘤细胞死亡；诱导人乳腺癌细胞自我吞噬；诱导胰腺癌细胞和人肾癌细胞胀亡等。青蒿琥酯是青蒿素衍生物，与青蒿素相比，具有水溶性好、抗疟疗效更强的特点。目前，还有研究表明青蒿素及其衍生物以其独特的抗肿瘤机制，可以选择性地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞只有轻微影响，与传统化疗药物不存在交叉耐药；还可通过抑制谷胱甘肽转移酶的活性而逆转肿瘤细胞的多药耐药性，与传统化疗药物同时应用可起到协同增效的作用。

发明内容

为解决现有技术采用西医治疗的白血病肿瘤对人体的损伤、放/化疗效果不佳，治疗后普遍生存时间短的技术问题，本发明提供青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤药的应用，可以大大提高治疗过程中对白血病肿瘤的抑制，提高患者的有治疗有效率、治愈率，延长患者的生存时间，减少治愈后的复发率。

青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤药的应用，其特征在于：所述的青蒿琥酯作为白血病肿瘤靶向抑制STAT3的化疗药物。

本发明采用青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤靶向抑制的化疗药物，可以快速、有效的抑制STAT3的表达水平，从而实现对白血病的治疗，青蒿琥酯对THP-1细胞增殖有很强的抑制作用，通过流式细胞术检测发现ART能诱导THP-1细胞凋亡，进一步用Western Blot方法证明了ART能显著降低STAT3蛋白水平，同时激活Caspase8、Caspase3蛋白从而诱导细胞凋亡。通过对THP-1细胞移植瘤鼠模型腹腔注射ART后发现ART能明显抑制肿瘤的生长，并且下调肿瘤组织中的STAT3表达水平。这些实验结果表明，ART通过下调STAT3的表达，同时激活凋亡蛋白Caspase8、Caspase3从而发挥对THP-1的抗肿瘤效应。

附图说明

图1、STAT3蛋白水平在白血病患者中增高实验结果图。

图2、ART对THP-1细胞增殖呈剂量依赖性（图中A部分）及时间依赖性（图中B部分）抑制作用实验结果图。

图3、ART抑制THP-1细胞中STAT3蛋白的表达，同时激活Caspase8、Caspase3的表达实验结果图。

图4、ART通过Caspae8和Caspase3的活化诱导凋亡实验结果图。

图5、ART对STAT3在THP-1细胞裸小鼠致瘤性中的抑制作用活体实验解剖的小鼠的肿瘤体积图。

图6、ART对STAT3在THP-1细胞裸小鼠致瘤性中的抑制作用试验结果统计图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明：

青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤药的应用，其特征在于：所述的青蒿琥酯作为白血病肿瘤靶向抑制STAT3的化疗药物。

进一步，所述的青蒿琥酯作为白血病肿瘤靶向抑制STAT3的化疗药物时，与青蒿琥酯联合用药的还包括化疗药如如阿糖胞苷、柔红霉素、去甲氧柔红霉素、阿霉素、高杉尖酯碱、门冬酰胺酶、培门冬酰胺酶、全反式维甲酸、三氧化二砷、地塞米松，，选用上述的一类或几类与青蒿琥酯形成联合药物。

进一步的，青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤药的应用，其特征在于：所述的抗白血病肿瘤药为一组中药提取物组方，还包括熊果酸。

熊果酸是存在于天然植物中的一种三萜类化合物。研究表明，熊果酸具有镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗溃疡、降低血糖等多种生物学效应。近年来，还发现熊果酸还具有抗致癌、抗促癌、诱导F9畸胎瘤细胞分化和抗血管生成作用。将熊果酸与青蒿琥酯联合用作白血病肿瘤药时，熊果酸起“臣”药的辅助治疗作用，可以有效的延长青蒿琥酯的药物作用时间及效果，减少治疗时间，延长无病生存率有极好的效果。

进一步的，青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤药的应用，其特征在于：所述的抗白血病肿瘤药为一组中药提取物组方，还包括大黄素。

大黄，大黄是多种蓼科大黄属的多年生植物的合称，也是中药材的名称。茎红色，气清香，味苦而微涩，嚼之粘牙，有砂粒感。秋末茎叶枯萎或次春发芽前采挖。除去细根，刮去外皮，切瓣或段，绳穿成串干燥或直接干燥。大黄具有攻积滞、清湿热、泻火、凉血、祛瘀、解毒等功效。大黄素，英文名称：EModin 别名：朱砂莲甲素 化学名：1'3'8-三羟基-6-甲基蒽醌 分子式：C15H10O5 分子量：270.23，大黄素是从蓼科植物虎杖的干燥根茎和根、掌叶大黄的根茎中提取而得的。大黄也被称为药中的猛张飞因其药性峻烈，也被称为药中将军，在抗白血病过程中，以大黄的刚猛峻烈，迅速发挥清热、泻火的作用。当白血病发病初期，快速的清热、泻火是治疗各型白血病的首要任务。

进一步的，青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤药的应用，其特征在于：含有大黄素的药在白血病肿瘤治疗中的前5天使用，而不含大黄素，只含熊果酸的中药组方用于后续的常规。大黄素相较于大黄，尽管药性相对温和，但不宜长期使用。

进一步的，所述的中药提取物组方中，青蒿琥酯、熊果酸、大黄素的重量比为1:（0.25-0.45）：（0.05-0.25）。

进一步的，所述的中药提取物组方组方中，青蒿琥酯、熊果酸、大黄素的重量比为1:0.35:0.15。

进一步的，所述的中药提取物组方组方在需要时，可加入药学上可接受的载体，载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂等，制成最终的药物形态为片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸剂、注射剂、输液剂等。

STAT3蛋白是一类由750~800个氨基酸组成的DNA结合蛋白,有αβγ三种亚型,它因可介导细胞的恶性转化而被确认为癌基因,STAT3在早期胚胎发育和骨髓细胞的分化中发挥着不可缺少的重要作用,此外它还参与了肿瘤的增殖、分化、血管生成、侵袭转移和免疫逃避等生理功能的调控。与STAT3相关的几条信号转导通路特别是Jak-STAT信号转导通路在白血病肿瘤中呈激活状态,体内外阻断或抑制肿瘤细胞中STAT3的信号通路可抑制细胞恶性增殖和存活,并诱导细胞凋亡,而对正常细胞却无影响。

一、体外抗白血病肿瘤活性实验：

实验目的：确定选取青蒿琥酯作为抑制白血病肿瘤成分时的作用原理、机制及效果。

下面的实现中会出现STAT3/GAPDH，GAPDH是（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。因为GAPDH 作为管家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。

材料和方法

主要试剂及仪器

ART购自桂林南药股份有限公司；RPMI 1640培养液及胎牛血清均购自美国Gibco公司;CCK- 8试剂盒购自于日本同仁化学试剂研究所；FITC Annexin V凋亡试剂盒购于BDPharMingen公司；STAT3、Caspase3、Caspase8抗体均购自美国abcaM公司，GAPDH抗体购自Proteintech公司。

1.1研究对象

选取2015年1月-2016年1月间在我院就诊的治疗前白血病患者30例，其中男性18例，女性12例；中位年龄30（1-45）岁。对照组标本20例，均取自同期住院的非血液系统疾病病人，男性14例，女性6例，中位年龄28（5-50）岁。

1.2细胞培养

人单核细胞白血病细胞系THP-1细胞由馈赠。培养条件：以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养于37℃、5% CO2的培养箱中，每2-3天换液1次。实验时取对数生长期细胞。

1.3细胞增殖的CCK-8实验

取对数生长期的THP-1细胞以5×104/孔接种于96孔板，培养液100µl/孔。分别以0、10、25、50、100、200µM 干预THP-1细胞。实验分为三组：加药物干预的为实验组、不加药物而加等量药物稀释剂的为对照组、只加RPMI 1640培养基的为空白组。培养24h、48h、72h后加入CCK-8试剂10µl/孔，继续培养箱中孵育1-2小时，酶标仪450nM波长读取吸光度值。实验均重复3次，取平均值。按下列公式计算生长抑制率：

抑制率=[1-（实验组0D值/对照组OD值）]× 100%

1.4细胞凋亡检测

收集经不同浓度的ART处理48h的THP-1细胞，用预冷的PBS洗涤2次，重悬细胞调整细胞浓度为5×105个/Ml，移入5Ml流式管中，分别加入5µl Annexin V-FITC和5µl 碘化啶（PI），轻轻涡旋细胞，室温下避光孵育15Min，然后加入200µl结合缓冲液，上流式细胞仪分析。

Annexin V －/PI －为有活力细胞，Annexin V + /PI －为早期凋亡细胞，Annexin V + /PI + 为晚期凋亡细胞。

1.5裸鼠成瘤

4周龄雌性裸鼠（AALB/c-nµ）购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2014-0004，饲养于SPF（specific-pathogen free）级动物实验室内。饲养1周后，取对数生长期的THP-1细胞，PBS漂洗2次，调整细胞浓度为1×107个/Ml，每只裸鼠颈部皮下注射细胞量2×10⁶个，对照组注射0.2MlPBS。接种细胞4周后，注射部位成瘤，随机将裸鼠分为3组，生理盐水对照组、ART100µM组、ART200µM组。待肿瘤大小约0.5cM时开始腹腔注射给药。ART粉剂120Mg/支，5%NaHCO3溶液溶解药物后，加入生理盐水稀释至合适浓度，每周给药3次，共4周。

1.6 Western Blot检测患者骨髓及THP-1细胞中STAT3的表达

实验分为两部分：白血病组和对照组分别取300µl骨髓，加入IP裂解液裂解细胞500µl；ART作用于THP-1细胞分为5组：对照组、ART10µM组、ART25µM组、ART50µM组、ART100µM组。ART作用48h后，离心1000rpM 5Min，弃上清，加IP裂解液裂解细胞，12000g 4℃离心25Min，取出上清，BCA法蛋白定量。调整各组蛋白为相同浓度，加入上样缓冲液。配制10%的聚丙烯酰胺凝胶分离，采用Bio-Rad湿转系统进行转膜。5%脱脂奶粉室温封闭3小时，TBST稀释一抗，GAPDH:1：5000;STAT3：1:2000,4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜后，加入辣根过氧化物标记的特异性二抗，1:5000比例稀释，摇床孵育1h，TBST洗膜后加入ECL化学发光检测，凝胶成像仪扫描。

实验的结果是基于本段的统计学处理原则：所有数据用SPSS 13.0软件进行统计学处理，数据以均数±标准差( x ± s) 表示，两两比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

图1中表示：STAT3蛋白水平在白血病患者中增高。

Western Blot检测白血病组及对照组骨髓标本中STAT3蛋白的表达，采用灰度分析法计算STAT3蛋白的相对表达量，结果发现30例白血病患者STAT3蛋白的相对表达量较对照组显著升高（P＜0.05）。

图2中表示：ART对THP-1细胞增殖呈剂量依赖性（图中A部分）及时间依赖性（图中B部分）抑制作用实验结果图。

ART通过CCK-8测定（A和B）分析的THP-1细胞诱导剂量和时间依赖性细胞毒性。ART以剂量 - （A）和时间 - （B）依赖的方式降低细胞活力。 将THP-1细胞分别暴露于各种浓度的ART（0µ-200M）24h，48h和72h。 白色泳道组表示用溶剂（生理盐水和碳酸氢钠注射，等体积的50μMART）处理，溶剂处理的细胞用作随后的实验中的对照，无指示。 * P <0.05和** P <0.01，与未处理的细胞相比（0M面板中的第一个条）。

用不同浓度的ART（0、10、25、50、100、200M）作用于THP-1细胞24h后，细胞活力明显下降，呈剂量依赖性。空白框表示溶剂组，即加入了50µl溶解青蒿琥酯的溶剂（包括5%碳酸氢钠注射液和生理盐水）组，实验结果显示与未加药组相比较，溶剂组细胞活力并没有明显的下降。于是在随后的实验中，我们将溶剂组设为实验组的对照组。24h半数抑制浓度（halfmaximal inhibitory concentration，IC50）约等于27.5M。

图3中表示：ART抑制THP-1细胞中STAT3蛋白的表达，同时激活Caspase8、Caspase3的表达实验结果图。

为了研究ART诱导THP-1细胞凋亡的机制，将不同浓度的ART 10M、25M、50M、100M分别作用于THP-1 48小时，对照组加青蒿琥酯溶剂处理48h，采用Western Blot方法检测STAT3的表达情况，如图3所示。药物组STAT3蛋白水平均较对照组显著下降，药物剂量越大，降低水平越明显（P＜0.05）。这些结果显示，ART可能是通过抑制STAT3蛋白表达从而诱导细胞凋亡。

图4中表示：ART通过Caspae8和Caspase3的活化诱导凋亡实验结果图。

将THP-1（2×10⁶细胞/孔）接种到6孔板上后，未经处理或用10,25,50M的ART处理48h。 然后，将细胞固定并用流式细胞仪分析。 用指定浓度的ART处理THP-1细胞（2×10⁶细胞/孔）48小时。 此后，用免疫印迹试验对Caspase-8和Caspase-3的特异性抗体通过Western印迹分析等量的裂解物。 相同的印迹被条纹化并用GAPDH抗体重新编码以验证相等的蛋白质含量。

THP-1细胞分别使用ART 10M、25M、50M处理48h，对照组加水处理48h。采用WesternBlot方法检测Caspase3及裂解的Caspase3、Caspase8蛋白表达水平。我们的数据显示ART处理THP-1细胞后，Caspase3及裂解的Caspase3均增加，且随ART浓度增加表达量上调。因此，ART诱导THP-1细胞凋亡可能也通过了内在的线粒体介导凋亡通路。

ART作用THP-1细胞48h后使用Annexin V-FITC和5µl 碘化啶（PI）双染法进行细胞凋亡分析。结果显示ART对THP-1细胞具有诱导凋亡的作用。Western Blot方法检查Caspase3、Caspase8蛋白表达证实ART有诱导THP-1细胞凋亡的作用。

图5中表示：ART对STAT3在THP-1细胞裸小鼠致瘤性中的抑制作用活体实验解剖的小鼠的肿瘤体积图；

在HTP-1、THP-1细胞（1×10⁶细胞/小鼠）诱导的裸小鼠人髓样白血病细胞中的ART皮下注射到小鼠的侧腹中。 根据肿瘤体积，将THP-1细胞注射4周后，将裸鼠随机分为3组。 给予I组无菌水（0.2ml，ip三次/周），组Ⅱ给予ART（50mg / kg体重，ip，三次/周），组III给予ART（200mg / kg体重，ip，三次 /周）。皮下植入骨髓性白血病肿瘤的小鼠的尸检照片。 使用游标卡尺在尸体解剖实验的最后一天测量小鼠的肿瘤体积，并使用公式V = 4 /3πr3（n = 5）计算。治疗4周后，检测各组裸鼠皮下瘤块的大小，发现与对照组相比，实验组ART100M组、ART200M组瘤块明显小于对照组（P＜0.05），提示ART在裸鼠体内有抑制THP-1细胞生长的作用。

图6中表示：ART对STAT3在THP-1细胞裸小鼠致瘤性中的抑制作用试验结果统计图；

为了研究其机制，在结束ART腹腔注射后，将对照组、实验组的瘤块研磨，提取总蛋白，进行Western Blot实验检测STAT3表达水平。结果发现与对照组相比，ART100M和ART200M组的STAT3蛋白水平均有下降（P＜0.05）。

白血病患者中STAT3表达情况，明确了在大部分白血病患者中，不管是儿童还是成人，确实存在有STAT3的高表达。随后，我们研究了ART是否能通过靶向影响STAT3从而对单核细胞白血病细胞THP-1发挥抗肿瘤效应。我们采用了体外细胞实验和异种移植小鼠模型来验证这个假设。实验数据表明，在体外，ART对THP-1细胞增殖有很强的抑制作用，通过流式细胞术检测发现ART能诱导THP-1细胞凋亡，进一步用Western Blot方法证明了ART能显著降低STAT3蛋白水平，同时激活Caspase8、Caspase3蛋白从而诱导细胞凋亡。通过对THP-1细胞移植瘤鼠模型腹腔注射ART后发现ART能明显抑制肿瘤的生长，并且下调肿瘤组织中的STAT3表达水平。这些实验结果表明，ART通过下调STAT3的表达，同时激活凋亡蛋白Caspase8、Caspase3从而发挥对THP-1的抗肿瘤效应。

白血病细胞耐药的发生是白血病治疗成功的一个障碍。近年来，有研究报道持续激活的STAT3信号与白血病的恶性程度和药物抵抗有关，抑制STAT3信号会在一定程度上缓解白血病和促进白血病细胞的凋亡，因此，在临床上，靶向抑制STAT3已成为治疗白血病的一种策略。

M. Ilamathi发现ART能靶向抑制肝癌细胞中的STAT3激活从而发挥抗癌作用。我们的研究首次发现ART能明显抑制THP-1细胞的增殖，并且促进THP-1细胞的凋亡，为了进一步阐明ART抗白血病细胞的潜在机制，我们研究了ART对THP-1细胞中STAT3表达的影响，结果发现ART能显著降低STAT3的表达，其作用与剂量呈正比，这提示ART可能是通过影响STAT3信号通路从而发挥抗白血病效应。同样，我们采用相同的实验方法检测了ART对ALL中Jurkat细胞的影响，结果发现虽然ART能抑制Jurkat细胞的增殖，但并不能干扰Jurkat细胞中STAT3的表达，由此说明ART可能是一种针对白血病中STAT3的靶向药物。

本研究表明ART不仅在体外对癌细胞有毒性作用，而且对裸鼠中人类移植瘤亦有明显的抗肿瘤活力，且副作用轻微。鉴于ART能在体外抑制THP-1细胞的生长，为了检测ART在体内抗白血病情况，我们成功地将THP-1在裸鼠颈部皮下成瘤，腹腔注射ART后发现与对照组相比，ART能明显抑制肿瘤的生长，且没有明显的不良反应。随后Western Blot证明ART下调了肿瘤组织中STAT3的表达，由此进一步说明ART的确具有抗白血病的效应。

细胞凋亡在肿瘤的发病机制中占有重要地位，抗凋亡是肿瘤细胞生存的关键因素。既往研究发现ART能在体外诱导多种肿瘤细胞凋亡，但诱导凋亡的机制并不相同。例如，ART通过刺激ROS（活性氧簇）从而激活白血病T细胞的线粒体凋亡途径；通过激活Caspase3和Caspase9，同时下调Bcl-2和Bax的比例从而诱导MDS（MDS骨髓异常综合征）的SKM-1（人骨髓增生异常综合征细胞株）细胞凋亡；通过激活Bax、P21以及Caspase3等诱导CML中KBM-5细胞凋亡。我们发现ART能诱导THP-1细胞凋亡，进一步研究结果提示ART能激活THP-1细胞中Caspase3和Caspase8两种凋亡蛋白。Caspase8参与细胞凋亡的起始，Caspase3参与细胞凋亡的执行。因此，我们的研究结果显示ART诱导THP-1细胞凋亡的机制可能是首先激活Caspase8启动凋亡，再进一步激活下游的Caspase3执行凋亡。

总之，上述实验结果表明ART在白血病细胞中的抗肿瘤效应主要是通过抑制STAT3的表达，同时激活Caspase8、Caspase3的表达实现的。ART可以成为白血病靶向抑制STAT3的化疗药物。通过实验，加入熊果酸、大黄素的组方药物，效果无病生存率提升10%以上。

本发明的保护范围，不仅限于具体实施方式所公开的技术方案，凡将青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤的主要成分，进一步的还包括熊果酸、大黄素作为抗白血病肿瘤的技术方案，以及在上述技术方案内容上的微小改进、等同替换，均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤药的应用，其特征在于：所述的青蒿琥酯作为白血病肿瘤靶向抑制STAT3的化疗药物。

2.根据权利要求1所述的青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤药的应用，其特征在于：与青蒿琥酯联合用药的还包括化疗药如阿糖胞苷、柔红霉素、去甲氧柔红霉素、阿霉素、高杉尖酯碱、门冬酰胺酶、培门冬酰胺酶、全反式维甲酸、三氧化二砷、地塞米松，选用上述的一类或几类与青蒿琥酯形成联合药物。

3.根据权利要求1或2所述的青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤药的应用，其特征在于：所述的抗白血病肿瘤药为一组中药提取物组方，还包括熊果酸。

4.根据权利要求3所述的青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤药的应用，其特征在于：还包括大黄素。

5.根据权利要求4所述的青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤药的应用，其特征在于：含有大黄素的药在白血病肿瘤治疗中的前5天使用，而不含大黄素，只含熊果酸的中药组方用于后续的常规。

6.根据权利要求4所述的青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤药的应用，其特征在于：所述的中药提取物组方中，青蒿琥酯、熊果酸、大黄素的重量比为1:（0.25-0.45）：（0.05-0.25）。

7.根据权利要求6所述的青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤药的应用，其特征在于：所述的中药提取物组方组方中，青蒿琥酯、熊果酸、大黄素的重量比为1:0.35:0.15。

8.根据权利要求1、2、4、5、6、7任一所述的青蒿琥酯作为抗白血病肿瘤药的应用，其特征在于：加入药学上可接受的载体，载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂，制成最终的药物形态为片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸剂、注射剂、输液剂。