CN107047481A - 一种基于高营养性培养基制备高活性果蝇蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于高营养性培养基制备高活性果蝇蛋白质的方法，该方法采用人工制备的培养基，此培养基富含各种氨基酸、蛋白质、可溶性纤维、维生素、多糖以及矿物质等成分，是一种营养均衡全面的果蝇培养基，由本发明培养基所培养的果蝇经过蛋白质提取后所得蛋白质的收率达到36.9％；本发明采用的蛋白质提取方法结合了三步酶解过程、超滤提纯以及脱腥增香过程，一方面通过控制水解的程度、精确控制水解的产物可以获得更高含量的蛋白质，另一方面通过初滤‑精滤的提取工艺，有利于水解过程中产生的带苦味多肽、氨基酸的分离获得高纯度的蛋白质，而脱腥增香处理，能够得到香味浓郁、腥味消失的高质量产品。
Description
技术领域
本发明属于制备高含量果蝇蛋白质的方法，具体涉及一种基于高营养性培养基制备高活性果蝇蛋白质的方法。
背景技术
果蝇英文称“fruit fly”或“vinegar fly”分类地位是双翅目(Diptera)果蝇科(Drosophilidae)果蝇属昆虫。果蝇属约有4555多个物种，用于模式生物的一般是常见的黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)。果蝇类昆虫在温带和热带地区广泛分布，适应性极强；不同物种食性有别，常在成熟瓜果或腐败植物上舐吸糖蜜物质获得营养，也可以树液或花粉为食，而其主要食物是在有氧与无氧条件下都可以生存的酵母菌。人们之所以在果园、菜场、食堂的残羹桶和家庭厨房等处，特别是腐烂水果处发现果蝇，主要是由于酵母菌滋生的缘故。
研究发现，昆虫体内存在有多种功能蛋白包括抗冻蛋白、储存蛋白、热休克蛋白、抗菌肽、干扰素、类免疫球蛋白、甾体载体蛋白-2、信息素结合蛋白、滞育关联蛋白、昆虫几丁质酶等(田华和王莉，2011)。昆虫蛋白具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤作用；通过促进淋巴细胞增殖，刺激抗体分泌，调节特异性免疫应答；通过产生或增加免疫因子(凝集素、溶菌酶、抗菌蛋白、抗菌肽等)，促进巨噬细胞的吞噬作用，调节非特异性免疫；另外，可促进免疫器官的发育，从而提高动物机体免疫力(李奕冉等，2010)。一些特殊的生物活性成分，如免疫活性物质和几丁质，可显著降低鸡血清及蛋黄中胆固醇含量，提高饲料报酬和产蛋性能(方洛云等，2009)。
果蝇幼虫即为蝇蛆，能在杂菌丛生的物料中快速生长，自身却不犯病。蝇蛆体内蛋白质含量高，食性杂，养殖设备投资小，养殖技术简单，且体内还含有多种活性物质，已被列为新型昆虫蛋白源之首。蝇蛆蛋白营养价值的高低与蝇蛆饲料有关。吴建伟等(2001)研究表明，猪粪饲养的蝇蛆幼虫除产量高外，含粗蛋42.36％～52.33％，必需氨基酸含量占总氨基酸的45.10％，必需氨基酸与非必需氨基酸总量的比值为0.82，脂肪酸含量13.73％～16.83％，油酸、亚油酸及亚麻酸等必需脂肪酸含量分别为36.99％、7.61％和0.35％，Fe含量:291.5mg/kg，Cu含量87.55mg/kg，Zn含量246.8mg/kg，Mn含量249.45mg/kg，比麦麸饲养的幼虫更接近参考蛋白模式，营养价值优于鱼粉。陈艳等(2004)的研究也显示，用猪粪饲养蝇蛆，其体内所含的微量元素(Ca、Fe、Cu、Zn、Se)高于用人工饲料饲养的蝇蛆。因此，开发一种能够获得高含量高品质的果蝇蛋白质具有非常重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于高营养性培养基制备高活性果蝇蛋白质的方法，尤其是提供一种培养高蛋白质含量果蝇的方法以及提取该蛋白质的方法。
为解决上述问题，本发明采用的技术方案为：
一种基于高营养性培养基制备高活性果蝇蛋白质的方法，包括如下步骤：
(1)取40-60份大豆粉、40-60份的玉米粉和5-10份琼脂加入100-150份去离子水，加热搅拌一段时间获得糊状混合料；
(2)按重量份取步骤(1)的糊状混合料40-60份，蜂王浆20-30份，红枣泥50-80份，香蕉泥50-80份以及20-40份去离子水放入球磨机中研磨20-40min，将所得的研磨物放入烧杯中，随后把烧杯置于紫外灯下杀菌消毒，然后向烧杯中加入10-20份的酵母粉，混合均匀后，得高营养性培养基；
(3)将上述所得的高营养性培养基均匀铺撒在玻璃板上，铺撒厚度为4-6cm，取铺撒的高营养性培养基6-9wt％的果蝇卵，均匀接种于铺撒后的培养物表面，再使用培养物对果蝇卵进行覆盖，覆盖厚度为2-3cm；
(4)将上述玻璃板在适宜的培养环境中培养至幼虫出现后继续培养3-5天后收集幼虫；
(5)将步骤(4)的幼虫收集后采取蛋白酶水解法提取果蝇幼虫蛋白质。
其中，所述步骤(1)的加热温度为70-90℃。
所述步骤(4)适宜的培养环境是温度24-28℃，相对湿度约为60％。
另外，所述步骤(5)蛋白酶水解法提取果蝇蛋白质的具体步骤包括：
(1)将果蝇幼虫经过消毒和洗涤，然后将干净果蝇幼虫加入一定体积水中进行胶磨破碎得到果蝇幼虫浆料，其中干净果蝇幼虫与水的质量体积比(g/mL)为1：20-25；
(2)将步骤(1)的浆料升温至50-60℃，并加入2790碱性蛋白酶进行水解一定的时间，待到浆料pH降到8.5左右时加入胰蛋白酶进行水解一段时间，之后待到浆料pH降至7.5左右时加入AS1398中性蛋白酶继续进行水解一段时间，其中，所述蛋白酶的添加量均为步骤(1)浆料的1-2wt％，且蛋白酶的酶活为3-5万单位/g；
(3)将步骤(2)水解完毕后的浆料进行灭酶处理，然后进行初滤处理，得滤液，初滤后的滤液继续送入超滤膜进行精滤处理，精滤处理后的滤液备用；所述超滤膜精滤处理中滤膜的孔径约为50nm，跨膜压差为0.1MPa，膜面流速为4-5m/s；
(4)将步骤(3)精滤得到的滤液加入一定量的氨基酸和葡萄糖，在100-120℃的温度下反应约60min的时间以进行滤液的脱腥增香处理；所述氨基酸和葡萄糖的加入量分别为滤液质量的0.3-0.6％以及0.4-0.6％；
(5)最后将步骤(4)的反应液进行浓缩后进行喷雾干燥即得所述果蝇蛋白质。
所述初滤是采取本领域常规的过滤技术。
本发明的技术效果为：(1)本发明采用人工制备的培养基，此培养基富含各种氨基酸、蛋白质、可溶性纤维、维生素、多糖以及矿物质等成分，是一种营养均衡全面的果蝇培养基，由本发明培养基所培养的果蝇经过蛋白质提取后所得蛋白质的收率达到36.9％；(2)本发明采用的蛋白质提取方法结合了三步酶解过程、超滤提纯以及脱腥增香过程，一方面通过控制水解的程度、精确控制水解的产物可以获得更高含量的蛋白质，另一方面通过初滤-精滤的提取工艺，有利于水解过程中产生的带苦味多肽、氨基酸的分离获得高纯度的蛋白质，而脱腥增香处理，能够得到香味浓郁、腥味消失的高质量产品。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的阐述：
实施例1
一种基于高营养性培养基制备高活性果蝇蛋白质的方法，包括如下步骤：
(1)取50份大豆粉、50份的玉米粉和8份琼脂加入120份去离子水，在温度80℃加热搅拌一段时间获得糊状混合料；
(2)按重量份取步骤(1)的糊状混合料50份，蜂王浆25份，红枣泥60份，香蕉泥60份以及30份去离子水放入球磨机中研磨30min，将所得的研磨物放入烧杯中，随后把烧杯置于紫外灯下杀菌消毒，然后向烧杯中加入15份的酵母粉，混合均匀后，得高营养性培养基；
(3)将上述所得的高营养性培养基均匀铺撒在玻璃板上，铺撒厚度为约5cm，取铺撒的高营养性培养基7wt％的果蝇卵，均匀接种于铺撒后的培养物表面，再使用培养物对果蝇卵进行覆盖，覆盖厚度为约2.5cm；
(4)将上述玻璃板在温度25℃，相对湿度约为60％的环境中培养至幼虫出现后继续培养4天后收集幼虫；
(5)将步骤(4)的幼虫收集后采取蛋白酶水解法提取果蝇幼虫蛋白质。
实施例2
一种基于高营养性培养基制备高活性果蝇蛋白质的方法，包括如下步骤：
(1)取40份大豆粉、40份的玉米粉和5份琼脂加入100份去离子水，在温度70℃加热搅拌一段时间获得糊状混合料；
(2)按重量份取步骤(1)的糊状混合料40份，蜂王浆20份，红枣泥50份，香蕉泥50份以及20份去离子水放入球磨机中研磨20min，将所得的研磨物放入烧杯中，随后把烧杯置于紫外灯下杀菌消毒，然后向烧杯中加入10份的酵母粉，混合均匀后，得高营养性培养基；
(3)将上述所得的高营养性培养基均匀铺撒在玻璃板上，铺撒厚度为约4cm，取铺撒的高营养性培养基6wt％的果蝇卵，均匀接种于铺撒后的培养物表面，再使用培养物对果蝇卵进行覆盖，覆盖厚度为约2cm；
(4)将上述玻璃板在温度26℃，相对湿度约为60％培养环境中培养至幼虫出现后继续培养3天后收集幼虫；
(5)将步骤(4)的幼虫收集后采取蛋白酶水解法提取果蝇幼虫蛋白质。
实施例3
一种基于高营养性培养基制备高活性果蝇蛋白质的方法，包括如下步骤：
(1)取60份大豆粉、60份的玉米粉和10份琼脂加入150份去离子水，在温度90℃加热搅拌一段时间获得糊状混合料；
(2)按重量份取步骤(1)的糊状混合料60份，蜂王浆30份，红枣泥80份，香蕉泥80份以及40份去离子水放入球磨机中研磨40min，将所得的研磨物放入烧杯中，随后把烧杯置于紫外灯下杀菌消毒，然后向烧杯中加入20份的酵母粉，混合均匀后，得高营养性培养基；
(3)将上述所得的高营养性培养基均匀铺撒在玻璃板上，铺撒厚度为约6cm，取铺撒的高营养性培养基9wt％的果蝇卵，均匀接种于铺撒后的培养物表面，再使用培养物对果蝇卵进行覆盖，覆盖厚度为约3cm；
(4)将上述玻璃板在温度28℃，相对湿度约为60％的培养环境中培养至幼虫出现后继续培养5天后收集幼虫；
(5)将步骤(4)的幼虫收集后采取蛋白酶水解法提取果蝇幼虫蛋白质。
实施例4
一种基于高营养性培养基制备高活性果蝇蛋白质的方法，包括如下步骤：
(1)取55份大豆粉、45份的玉米粉和9份琼脂加入130份去离子水，在温度75℃加热搅拌一段时间获得糊状混合料；
(2)按重量份取步骤(1)的糊状混合料55份，蜂王浆25份，红枣泥70份，香蕉泥60份以及35份去离子水放入球磨机中研磨35min，将所得的研磨物放入烧杯中，随后把烧杯置于紫外灯下杀菌消毒，然后向烧杯中加入15份的酵母粉，混合均匀后，得高营养性培养基；
(3)将上述所得的高营养性培养基均匀铺撒在玻璃板上，铺撒厚度为约5cm，取铺撒的高营养性培养基8wt％的果蝇卵，均匀接种于铺撒后的培养物表面，再使用培养物对果蝇卵进行覆盖，覆盖厚度为约2.5cm；
(4)将上述玻璃板在温度25℃，相对湿度约为60％的培养环境中培养至幼虫出现后继续培养4天后收集幼虫；
(5)将步骤(4)的幼虫收集后采取蛋白酶水解法提取果蝇幼虫蛋白质。
实施例5
本发明实施例1-4以及以下对比例1-2所述步骤(5)蛋白酶水解法提取果蝇蛋白质的具体步骤包括：
(1)将果蝇幼虫经过消毒和洗涤，然后将干净果蝇幼虫加入一定体积水中进行胶磨破碎得到果蝇幼虫浆料，其中干净果蝇幼虫与水的质量体积比(g/mL)为1：24；
(2)将步骤(1)的浆料升温至55℃，并加入2790碱性蛋白酶进行水解一定的时间，待到浆料pH降到8.5左右时加入胰蛋白酶进行水解一段时间，之后待到浆料pH降至7.5左右时加入AS1398中性蛋白酶继续进行水解一段时间，其中，所述蛋白酶的添加量均为步骤(1)浆料的1.5wt％，且蛋白酶的酶活为4万单位/g；
(3)将步骤(2)水解完毕后的浆料进行灭酶处理，然后进行初滤处理，得滤液，初滤后的滤液继续送入超滤膜进行精滤处理，精滤处理后的滤液备用；所述超滤膜精滤处理中滤膜的孔径约为50nm，跨膜压差为0.1MPa，膜面流速为4.5m/s；
(4)将步骤(3)精滤得到的滤液加入一定量的氨基酸和葡萄糖，在110℃的温度下反应约60min的时间以进行滤液的脱腥增香处理；所述氨基酸和葡萄糖的加入量分别为滤液质量的0.5％以及0.4％；
(5)最后将步骤(4)的反应液进行浓缩后进行喷雾干燥即得所述果蝇蛋白质。
对比例1
一种基于高营养性培养基制备高活性果蝇蛋白质的方法，包括如下步骤：
(1)取50份的玉米粉和8份琼脂加入120份去离子水，在温度80℃加热搅拌一段时间获得糊状混合料；
(2)按重量份取步骤(1)的糊状混合料50份，蜂王浆25份，红枣泥60份，香蕉泥60份以及30份去离子水放入球磨机中研磨30min，将所得的研磨物放入烧杯中，随后把烧杯置于紫外灯下杀菌消毒，然后向烧杯中加入15份的酵母粉，混合均匀后，得高营养性培养基；
(3)将上述所得的高营养性培养基均匀铺撒在玻璃板上，铺撒厚度为约5cm，取铺撒的高营养性培养基7wt％的果蝇卵，均匀接种于铺撒后的培养物表面，再使用培养物对果蝇卵进行覆盖，覆盖厚度为约2.5cm；
(4)将上述玻璃板在温度25℃，相对湿度约为60％的环境中培养至幼虫出现后继续培养4天后收集幼虫；
(5)将步骤(4)的幼虫收集后采取蛋白酶水解法提取果蝇幼虫蛋白质。
对比例2
一种基于高营养性培养基制备高活性果蝇蛋白质的方法，包括如下步骤：
(1)取50份大豆粉、50份的玉米粉和8份琼脂加入120份去离子水，在温度80℃加热搅拌一段时间获得糊状混合料；
(2)按重量份取步骤(1)的糊状混合料50份，蜂王浆25份以及30份去离子水放入球磨机中研磨30min，将所得的研磨物放入烧杯中，随后把烧杯置于紫外灯下杀菌消毒，然后向烧杯中加入15份的酵母粉，混合均匀后，得高营养性培养基；
(3)将上述所得的高营养性培养基均匀铺撒在玻璃板上，铺撒厚度为约5cm，取铺撒的高营养性培养基7wt％的果蝇卵，均匀接种于铺撒后的培养物表面，再使用培养物对果蝇卵进行覆盖，覆盖厚度为约2.5cm；
(4)将上述玻璃板在温度25℃，相对湿度约为60％的环境中培养至幼虫出现后继续培养4天后收集幼虫；
(5)将步骤(4)的幼虫收集后采取蛋白酶水解法提取果蝇幼虫蛋白质。
对实施例1-4及对比例1-2获得的果蝇蛋白质的性能进行评价测定，测定方法采用现有技术CN10355798的测定技术进行测试：
1.提取蛋白质的含量：采用凯式定氮法测定。
2.脂肪的含量：采用索氏提取法测定。
3.灰分：照GB/T5009.4-2003灼烧恒重法测定。
4.水分：照GB/T5009.4-2003直接干燥法测定。
5.苦味：采用感观评定法，随机选取10名参评人员(均为不吸烟者)，取待测液1-2m1于口中，5秒后吐出。待测液是将提取所得的蛋白按重量比1:20混合于水中制得。将待测液的苦味设定为4个级别：无苦味、苦味小、苦味一般、苦味重。
6.收率：提取的蛋白质重量/果蝇幼虫初重×100％。
表1：实施例1-4和对比例1-2的性能测试结果：
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 对比例1 | 对比例2 | |
| 蛋白质含量％ | 95.3 | 93.1 | 94.9 | 93.7 | 89.5 | 90.7 |
| 脂肪含量％ | 2.7 | 2.8 | 2.7 | 2.6 | 3.2 | 3.9 |
| 水分％ | 1.4 | 1.6 | 1.7 | 1.8 | 2.1 | 1.9 |
| 灰分％ | 0.16 | 0.15 | 0.18 | 0.14 | 0.18 | 0.19 |
| 苦味 | 小 | 小 | 小 | 小 | 小 | 小 |
| 收率％ | 36.9 | 36.6 | 35.8 | 36.4 | 25.6 | 24.7 |
从上表1可以看出，本发明的提取工艺所提取的蛋白质的综合性能较好，特别是蛋白质收率达到了较高水平，且优于对比例。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种基于高营养性培养基制备高活性果蝇蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取40-60份大豆粉、40-60份的玉米粉和5-10份琼脂加入100-150份去离子水，加热搅拌一段时间获得糊状混合料；
(2)按重量份取步骤(1)的糊状混合料40-60份，蜂王浆20-30份，红枣泥50-80份，香蕉泥50-80份以及20-40份去离子水放入球磨机中研磨20-40min，将所得的研磨物放入烧杯中，随后把烧杯置于紫外灯下杀菌消毒，然后向烧杯中加入10-20份的酵母粉，混合均匀后，得高营养性培养基；
(3)将上述所得的高营养性培养基均匀铺撒在玻璃板上，铺撒厚度为4-6cm，取铺撒的高营养性培养基6-9wt％的果蝇卵，均匀接种于铺撒后的培养物表面，再使用培养物对果蝇卵进行覆盖，覆盖厚度为2-3cm；
(4)将上述玻璃板在适宜的培养环境中培养至幼虫出现后继续培养3-5天后收集幼虫；
(5)将步骤(4)的幼虫收集后采取蛋白酶水解法提取果蝇幼虫蛋白质。
2.根据权利要求1所述基于高营养性培养基制备高活性果蝇蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(1)的加热温度为70-90℃。
3.根据权利要求1所述基于高营养性培养基制备高活性果蝇蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(4)适宜的培养环境是温度24-28℃，相对湿度约为60％。
4.根据权利要求1所述基于高营养性培养基制备高活性果蝇蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(5)蛋白酶水解法提取果蝇蛋白质的具体步骤包括：
(1)将果蝇幼虫经过消毒和洗涤，然后将干净果蝇幼虫加入一定体积水中进行胶磨破碎得到果蝇幼虫浆料，其中干净果蝇幼虫与水的质量体积比(g/mL)为1：20-25；
(2)将步骤(1)的浆料升温至50-60℃，并加入2790碱性蛋白酶进行水解一定的时间，待到浆料pH降到8.5左右时加入胰蛋白酶进行水解一段时间，之后待到浆料pH降至7.5左右时加入AS1398中性蛋白酶继续进行水解一段时间，其中，所述蛋白酶的添加量均为步骤(1)浆料的1-2wt％，且蛋白酶的酶活为3-5万单位/g；
(3)将步骤(2)水解完毕后的浆料进行灭酶处理，然后进行初滤处理，得滤液，初滤后的滤液继续送入超滤膜进行精滤处理，精滤处理后的滤液备用；所述超滤膜精滤处理中滤膜的孔径约为50nm，跨膜压差为0.1MPa，膜面流速为4-5m/s；
(4)将步骤(3)精滤得到的滤液加入一定量的氨基酸和葡萄糖，在100-120℃的温度下反应约60min的时间以进行滤液的脱腥增香处理；所述氨基酸和葡萄糖的加入量分别为滤液质量的0.3-0.6％以及0.4-0.6％；
(5)最后将步骤(4)的反应液进行浓缩后进行喷雾干燥即得所述果蝇蛋白质。
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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