CN103356724A

CN103356724A - 刺五加水提取物在缓解果蝇肠道炎症中的应用

Info

Publication number: CN103356724A
Application number: CN2012102997792A
Authority: CN
Inventors: 金丽华; 张玮钰; 李文佳
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2012-08-22
Filing date: 2012-08-22
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2032-08-22
Also published as: CN103356724B

Abstract

本发明是刺五加水提取物在缓解果蝇肠道炎症中的应用，涉及果蝇天然免疫技术领域。本发明通过给果蝇喂食肠道刺激因子，如Micrococcus luteus、Beauveria bassiana孢子、E.cloacae、L.monocytogenes、表面活性剂（SDS）、盐离子（NaCl）和重金属（CuSO₄）的同时喂食刺五加水提取物，发现果蝇生存率、肠道内抗菌肽的表达量都有所提高，肠道上皮凋亡的细胞数量下降，肠道形态得到改善。说明刺五加水提取物能够缓解果蝇肠道炎症。本发明将刺五加水提取物用于果蝇肠道炎症研究，为刺五加新的药用方向奠定基础。

Description

刺五加水提取物在缓解果蝇肠道炎症中的应用

技术领域

本发明是刺五加水提取物应用于缓解果蝇肠道炎症，涉及果蝇天然免疫技术领域。

背景技术

果蝇不具有获得性免疫系统，只能通过天然免疫系统对病原微生物的侵染做出快速有效的应答。肠道免疫作为天然免疫的重要组成部分，是对抗细菌、毒素、食物抗原和潜在的有害生物的生理和免疫屏障。当肠道受到外界环境刺激时，肠道上皮细胞会作出一系列的应答，如合成抗菌肽（Antibactieral peptide）和活性氧(ROS)，这些分子能杀死入侵的病原微生物，以此来维持肠道内环境的稳态。

刺五加[Acanthopanax senticosus(Rupr.et Maxim.)Harms]为五加科植物，根、茎、果实均可入药。经过研究分析其主要成份包含多种糖类、氨基酸、脂肪酸、维生素A、B1、B2及大量的胡萝卜素；另含有芝麻脂素、甾醇、香豆精、黄酮、木栓酮、非芳香性不饱和有机酸、及多种微量矿物质。有研究表明刺五加具有抗疲劳、抗衰老、抗癌、增强机体免疫力等多种作用。本发明分析刺五加水提取物对果蝇肠道免疫功能的影响，为刺五加应用于肠道免疫研究提供依据，为刺五加新的药用方向奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于揭示出刺五加水提取物能应用于缓解果蝇肠道炎症。给果蝇喂食Micrococcus luteus和Beauveria bassiana孢子两种微生物，以及表面活性剂（SDS）、盐离子（NaCl）和重金属（CuSO₄）的同时喂食刺五加水提取物，结果表明，刺五加水提取物能提高果蝇的生存率和肠道内抗菌肽的表达量，降低肠道上皮内凋亡的细胞数量，改善肠道的形态，说明刺五加能缓解果蝇肠道炎症，这为刺五加应用于肠道免疫奠定基础。

本发明所采用的技术方案包括如下步骤：

（1）刺五加提取液的制备方法

称取经过粉碎的刺五加根、果实药材各20g于200mL去离子水中，浸泡24h，加热煮沸3h后用纱布过滤，在滤渣中加入200mL去离子水再提取一次，将两次提取液混匀后浓缩至200mL，使其浓度为10%（即100mg/mL），4℃备用。

（2）果蝇培养基的配制方法

正常培养基：每200mL去离子水中加入玉米粉14.2g、琼脂1.1g、酵母粉3.3g、大豆粉1.9g、白糖17g和丙酸0.94mL。

刺五加培养基：正常培养基中的去离子水换成等体积的10%刺五加提取液。

（3）菌液的配制方法

M.luteus菌菌液：过夜培养的细菌菌液按1:100比例加入到LB液体培养基中扩大培养，37℃振荡培养14h后测其OD₆₀₀值，离心后弃上清，在收集到的菌体中加入蔗糖，用10%刺五加水提取物定容，使蔗糖浓度达到5%，M.luteus菌菌液浓度达到OD₆₀₀=180，此组为实验组；用去离子水定容的含5%蔗糖的M.luteus菌菌液（OD₆₀₀=180）为对照组，4℃备用。

真菌孢子溶液：将B.bassiana涂布到LB固体培养基上，25℃静置培养7天，用无菌的PBS收集平板上的孢子过滤后，测其浓度，配成OD₆₀₀=6的孢子溶液，4℃备用（配制方法同细菌菌液配制方法）。

（4）化学试剂的配制方法：

在10%SDS中加入蔗糖，用10%刺五加水提取物定容，使蔗糖终浓度达到5%，SDS终浓度为0.6%，此组作为实验组；用去离子水定容的含5%蔗糖的SDS（0.6%）为对照组，4℃备用。

0.4M的NaCl和6mM的CuSO₄溶液的配制方法同上。

（5）细菌和化学试剂的喂食方法

普通培养基中孵化出的果蝇作为对照组，刺五加培养基中孵化出的果蝇作为实验组，收集羽化3~4天的果蝇，随机分配雌、雄果蝇各15只，饥饿处理两小时后转移到放有5层滤纸的果蝇管中，滤纸预先加入420μL的菌液或化学试剂将其充分浸润，将浸润滤纸后多余的液体吸出。每24h更换一次滤纸，同时记录死亡果蝇的个数。

（6）肠道内抗菌肽表达量分析方法

给果蝇喂食M.luteus或B.bassiana孢子6h后分离肠道，提取总RNA，反转录成cDNA后，用半定量PCR方法检测抗菌肽的表达情况。

（7）免疫组织化学染色方法

取连续喂食SDS、NaCl或CuSO₄3-4天的果蝇，在显微镜下分离出完整的肠道置于载玻片上，用7-AAD染色30min，再用40g/L的多聚甲醛固定10min，DAPI染色10min，封片后在Zeiss荧光显微镜下观察并拍照。

本发明的效果：本发明通过给果蝇喂食菌液或化学试剂的同时喂食刺五加水提取物缓解了果蝇的肠道炎症。利用上述技术方案，以黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）为实验材料进行实验，结果表明：刺五加水提取物提高了果蝇的生存率和肠道内抗菌肽的表达量，降低了肠道上皮凋亡的细胞数量，改善了肠道的形态。说明刺五加水提取物能缓解果蝇肠道炎症。

需要强调的是：本发明是刺五加水提取物应用于缓解肠道炎症的首次发现，为刺五加新的药用方向提供依据。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明的有关内容作进一步说明：

图一为刺五加水提取物对喂食M.luteus或B.bassiana孢子后果蝇生存率的影响；

图二为刺五加水提取物对喂食SDS、NaCl或CuSO₄后果蝇生存率的影响；

图三为刺五加水提取物对喂食M.luteus或B.bassiana的孢子后肠道内抗菌肽表达量的影响；

图四为刺五加水提取物对喂食SDS、NaCl或CuSO₄后肠道上皮细胞凋亡的影响；

图五为刺五加水提取物对果蝇肠道的缓解作用。

具体实施方式

实施例1喂食刺五加水提取物对肠道炎症果蝇生存率的影响

实验过程如下：

收集羽化3~4天的果蝇，随机分配雌、雄果蝇各15只，饥饿处理两小时后转移到放有5层滤纸的果蝇管中，滤纸已预先被420μL的菌液或化学试剂充分浸润（将浸润滤纸后多余的液体吸出）。每24h更换一次滤纸，同时记录死亡果蝇的个数。

结果显示：喂食革兰氏阳性菌M.luteus后，对照组果蝇生存率是33.3%，而喂食刺五加根、果实的果蝇生存率是61.1%和71.1%，分别提高1.8倍和2.1倍，结果见图1A。喂食B.bassiana孢子，第9天对照组生存率是8.8%，而喂食刺五加根、果实的果蝇生存率是22.7%和51.3%，分别提高2.6倍和3.4倍，结果见图1B。喂食SDS、NaCl或CuSO₄的果蝇生存率结果见图2。

实施例2喂食刺五加水提取物对肠道炎症果蝇肠道内抗菌肽表达量的影响

实验过程如下：

从刺五加培养基中孵化出的果蝇喂食M.luteus或B.bassiana孢子6h后，在显微镜下分离出果蝇肠道组织，提取肠道总RNA，反转录成cDNA后利用半定量PCR方法检测肠道内抗菌肽的表达量。

结果显示：部分抗菌肽的表达量升高，结果见图3。

实施例3喂食刺五加水提取物对肠道炎症果蝇的肠道上皮凋亡细胞数量的影响

实验过程如下：

喂食SDS、NaCl或CuSO₄3-4天后，在显微镜下分离出完整的果蝇肠道组织，用7-AAD对果蝇肠道内凋亡的细胞进行染色。

染色方法：7-AAD染色30min，再用40g/L的多聚甲醛固定10min，DAPI染色10min，封片。

结果显示：喂食SDS、NaCl或CuSO₄的果蝇，在喂食刺五加果实水提物后肠道上皮内凋亡的细胞数量减少，甚至消失，结果见图4。图中TRITC（7-AAD）表示凋亡的细胞（红光）；DAPI表示细胞核（蓝光）；TRITC+DAPI表示叠加后的细胞（红光和蓝光）；DIC表示自然光下肠道的形态，图A、C、E的标尺均为100μm。

实施例4喂食刺五加水提取物对肠道炎症果蝇肠道的缓解作用

实验过程如下：

喂食SDS 4天后，在显微镜下分离出完整的果蝇肠道组织，自然光下观察肠道形态及黑色素瘤情况。

结果显示：只喂食SDS的果蝇肠道整体长度变短，喂食SDS同时喂食刺五加水提取物的果蝇的肠道能够恢复原来形态，结果见图5A。只喂食SDS的果蝇肠道内有黑色素瘤存在，喂食SDS同时喂食刺五加水提取物的果蝇肠道内的黑色素瘤相对较小，甚至消失，结果见图5B。其中，图A的标尺为150μm；图B的为100μm。

Claims

1.一种刺五加水提取物应用于缓解果蝇肠道炎症的方法，其特征在于：

（1）刺五加水提取物包括刺五加根水提取物和刺五加果实水提取物。

（2）喂食黑腹果蝇Micrococcus luteus或Beauveria bassiana的孢子的同时喂食果蝇刺五加根和果实水提取物，观察果蝇生存率和肠道内抗菌肽的表达情况。

（3）喂食黑腹果蝇SDS、NaCl或CuSO₄的同时喂食果蝇刺五加根和果实水提物，观察果蝇生存率、肠道上皮凋亡的细胞数量及肠道形态的情况。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：刺五加根和果实粉碎后，按十倍的质量加入去离子水，煮沸3小时后过滤，向滤渣中再次加入等体积去离子水重复提取一次，将两次滤液混匀后煮沸定容至第一次煮沸时加入的去离子水的体积，得到刺五加根和果实的提取液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：喂食Micrococcus luteus的浓度是OD₆₀₀=180，Beauveriabassiana的孢子的浓度是OD₆₀₀=6，观察生存率和喂食两种微生物6h后肠道内抗菌肽的表达情况。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：喂食SDS、NaCl和CuSO₄的浓度分别是0.6%、0.4M和6mM，观察生存率和喂食化学物质3-5天后肠道上皮凋亡细胞的情况。