CN105907819A - 一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法 - Google Patents

一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法，包括培养基制备步骤。所述方法，还包括壳聚糖培养基制备步骤；所述壳聚糖培养基，按重量份数计，原料包括：壳聚糖15‑18份、1.3‑1.5%的醋酸溶液300‑380份、(NH4)2SO4粉末3‑5份、脱脂乳粉20‑22份、无菌水500‑800份。采用本发明的方法制备的壳寡糖，壳寡糖有效含量为92.21‑98.45%；采用本发明的方法制备的壳寡糖，脱乙酰度为95.6‑98.2%；产品主要用于高端农业防病控害和人体免疫能力提高，防治肿瘤和免疫紊乱疾患。

Description

一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法
技术领域
本发明涉及的是生产壳寡糖的方法，特别是一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法。
背景技术
甲壳素在自然界中的含量仅次于纤维素，它以其加工方法不同主要分为以下三个层次系列衍生产品：1.几丁质(甲壳质)，分子量达到100万以上，适合工业和环保应运，不溶于水，很难被人体吸收。壳聚糖分子量在10万左右，一般只溶于有机弱酸，不溶于水，可以被人体吸收，可以作为食品添加剂及保健品原料等。壳寡糖是在β-1，4位结合有2-10个葡糖胺的一种低聚糖，分子量在500-5000千之间，水溶性好，可以直接被人体吸收，速度快，效果显著，具有独特的生理性和理化性质，可广泛应用于医疗、保健食品和农业中。
壳寡糖又叫壳聚寡糖、低聚壳聚糖，是将壳聚糖经特殊的生物酶技术（也有使用化学降解、微波降解技术的报道）降解得到的一种寡糖产品，是水溶性较好、功能作用大、生物活性高的低分子量产品。它具有壳聚糖所没有的较高溶解度，全溶于水，容易被生物体吸收利用等诸多独特的功能，其作用为壳聚糖的14倍。目前，国内外降解制备壳寡糖的方法大致可分为酶降解法、氧化降解法和酸降解法三类。利用生物酶法降解制备壳寡糖的过程明显优于另两种化学降解法，但它普遍存在壳寡糖有效含量低、脱乙酰度低、分子量不稳定、酶解时间长、能耗高等问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法，以实现以下发明目的：
1、本发明制备壳聚糖酶的过程中，制备的壳聚糖酶酶活力较高；
2、本发明制备壳聚糖酶的过程中，制备的壳聚糖酶比活力大幅提高；
3、采用本发明的方法制备的壳寡糖，壳寡糖有效含量高；
4、采用本发明的方法制备的壳寡糖，脱乙酰度高；
5、采用本发明的方法制备的壳寡糖平均分子量稳定、可控；
6、采用本发明方法制备的的壳寡糖，溶解性好；
7、采用本发明方法制备的的壳寡糖微生物含量低；
8、采用本发明的方法制备的壳寡糖，聚合度合适。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法，其特征在于：包括培养基制备步骤。
以下是对上述技术方案的进一步改进：
所述方法，包括壳聚糖培养机制备步骤；所述壳聚糖培养基，按重量份数计，原料包括：壳聚糖15-18份、1.3-1.5%的醋酸溶液300-380份、(NH4)2SO4粉末3-5份、脱脂乳粉20-22份、无菌水500-800份。
所述方法，还包括菌种发酵培养基制备步骤；所述菌种发酵培养基，按重量份数计，原料包括：0.5-0.8份黄豆粉、0.03-0.04份红藻培育液、1.2-1.6份稻草浸液、0.15-0.20份玉米粉、0.6-0.8份鸡蛋白液、0.08-0.10份猪骨汤、0.25-0.40份小牛血清、0.05-0.07份大豆蛋白、0.01-0.02份羊粪浸出物、1.6-1.8份胶体壳聚糖、2.3-2.6份卵磷脂、0.002-0.005份玉米须、0.04-0.06份山药粉、0.12-0.14份破壁松花粉、0.35-0.4份土豆汁。
所述黄豆粉，蛋白质含量22-23%，脂肪含量13.5-14.2%，钙含量0.56-0.78%，磷含量0.85-0.95%，胡萝卜素含量0.06-0.08%。
所述红藻培育液的制备，将新鲜红藻加入等质量的水，保温处理，保温温度为35-37℃，保温时间为20-30h。
所述大豆蛋白，为大豆分离蛋白，蛋白质含量92-94%，水溶氮指数92-95%，水份含量3.5-4%，脂肪含量0.3-0.45%。
所述卵磷脂，磷脂酰乙醇胺含量7-9%、磷脂酰肌醇含量22-25%。
所述破壁松花粉，为云松松花粉，目数160-170目，破壁率96-98%。
所述方法还包括发酵培养步骤；所述发酵培养步骤，培养温度为25-32℃，培养时间为80-120h，培养过程中，每隔10-12h，转动一次培养基，转动频率为300-500rpm，每次转动时间20-25min。
所述方法还包括酶解步骤；所述酶解步骤包括二次快速超声处理步骤；所述二次快速超声处理步骤，超声频率为20-25 MHz，超声处理时间为30-35min。
由于采用了上述技术方案，本发明达到的技术效果如下：
1、本发明制备壳聚糖酶的过程中，制备的壳聚糖酶酶活力为155-194KU/g；
2、本发明制备壳聚糖酶的过程中，制备的壳聚糖酶比活力为60-68%；
3、采用本发明的方法制备的壳寡糖，壳寡糖有效含量为92.21-98.45%，特别是采用本发明实施例3的制备方法制备的壳寡糖，壳寡糖成份有效含量达99.45%；
4、采用本发明的方法制备的壳寡糖，脱乙酰度为95.6-98.2%；
5、采用本发明的方法制备的壳寡糖平均分子量为1250-1262Da；
6、采用本发明方法制备的的壳寡糖，溶解性为99.1-99.4；
7、采用本发明方法制备的的壳寡糖微生物含量为1200-3200 CFU/g；
8、采用本发明的方法制备的壳寡糖，聚合度为2-4；
9、本发明制备的壳寡糖黏度为1.2-2.2CPS（5%壳寡糖溶液）；大肠杆菌、沙门氏菌检测呈阴性；
10、本产品用于高端农业防病控害和人体免疫能力提高，防治肿瘤和免疫紊乱疾患。
具体实施方式
实施例1 一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法
包括以下步骤：
步骤1：培养基制备
（1）壳聚糖培养基制备：
壳聚糖培养基，按重量份数计，包括以下原料：
壳聚糖15份、1.3%的醋酸溶液300份、(NH4)2SO4粉末3份、脱脂乳粉20份、无菌水500份；
将壳聚糖溶解到醋酸溶液汇总，然后加入(NH4)2SO4粉末、脱脂乳粉和无菌水，制备成壳聚糖培养基。
（2）菌种发酵培养基制备：
菌种发酵培养基，按重量份数计，包括以下原料：
0.5份黄豆粉、0.03份红藻培育液、1.2份稻草浸液、0.15份玉米粉、0.6份鸡蛋白液、0.08份猪骨汤、0.25份小牛血清、0.05份大豆蛋白、0.01份羊粪浸出物、1.6份的胶体壳聚糖、2.3份卵磷脂、0.002份玉米须、0.04份山药粉、0.12份破壁松花粉、0.35份土豆汁；
将所述原料混合，杀菌后即可制得菌种发酵培养基。
所述黄豆粉，每100克，蛋白质含量22-23%，脂肪含量13.5-14.2%，钙含量0.56-0.78%，磷含量0.85-0.95%，胡萝卜素含量0.06-0.08%；
所述红藻培育液的制备方法，将新鲜红藻加入等质量的水，保温处理，保温温度为35-37℃；保温时间为20-30h；
所述大豆蛋白，为大豆分离蛋白，蛋白质含量92-94%，水溶氮指数92-95%，水份含量3.5-4%，脂肪含量0.3-0.45%；
所述卵磷脂，磷脂酰乙醇胺含量7-9%、磷脂酰肌醇含量22-25%；
所述破壁松花粉，为云松松花粉，目数160-170目，破壁率96-98%。
步骤2：菌种培育
斜面培养：浆制备的壳聚糖培养基，对其紫外线进行灭菌后均匀装配到培养皿中，取土壤浸出液，等量均匀移送至制备的壳聚糖培养基培养皿中，35℃培养4天，采用平板稀释法将培养后的均匀涂抹转移到斜面培养，培养3天；
发酵培养：筛选壳聚糖透明圈大的菌种接种至制备的菌种发酵培养基中，培养温度为25℃，培养时间为80h，培养过程中，每隔10h转动一次培养基，转动频率为300rpm，每次转动时间20min；采用常规层析柱法制得含有壳聚糖酶的酶液。
步骤3：壳聚糖酶制备
将经过超滤浓缩后的壳聚糖酶液用恒流泵泵入喷雾干燥机，在雾化器的作用下使壳聚糖酶液形成均一的细小液滴，通入的热空气和罐体内的负压状态会将壳聚糖酶与水分离开来，分离后的酶颗粒会进入右端的旋风分离器中，在旋风分离器中实现酶与水的进一步分离，制得壳聚糖酶粉末，酶活为155KU/g，酶的比活力提高了60%。
步骤4：酶解
一次快速超声处理：
将壳聚糖粉末和水进行混合，所述加入壳聚糖粉末的质量分数为15wt%，采用超声波进行处理，超声频率为380MHz，处理时间为10min。
搅拌：
超声处理完成后，在对混合溶液进行搅拌，滴加冰醋酸，同时逐步加入壳聚糖粉末和壳聚糖酶粉末。
壳聚糖酶粉末的加入量为壳聚糖质量的8%。
所述搅拌速率为500rpm，控制温度在35℃，至壳聚糖溶液的浓度为5wt%，溶液粘度为1200cp，溶液pH为5.5；
二次快速超声处理：
搅拌完成后，将搅拌完成的壳聚糖溶液，进行第二次快速超声处理，超声频率为20MHz，处理时间为30-min；
絮凝离心：
用NaOH调节pH至8，静置20min，形成絮凝物，离心去除杂质；
步骤5：膜分离：
将上清液通过截留分子量3000的超滤膜，去除大分子壳聚糖和酶蛋白等。
步骤6：浓缩
离心过滤后将上清加入旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩比为1/5，放入低温干燥箱进行低温干燥，取出干燥后的粉末即为壳寡糖。
实施例2 一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法
步骤1：培养基制备
（1）壳聚糖培养基制备：
所述壳聚糖培养基，按重量份数计，原料包括：
壳聚糖16份、1.4%的醋酸溶液350份、(NH4)2SO4粉末4份、脱脂乳粉21份、无菌水600份；
将壳聚糖溶解到醋酸溶液汇总，然后加入(NH4)2SO4粉末、脱脂乳粉和无菌水，杀菌后制备成壳聚糖培养基。
（2）菌种发酵培养基制备：
所述菌种发酵培养基，按重量份数计，原料包括：
0.6份黄豆粉、0.035份红藻培育液、1.4份稻草浸液、0.17份玉米粉、0.7份鸡蛋白液、0.09份猪骨汤、0.3份小牛血清、0.06份大豆蛋白、0.01份羊粪浸出物、1.8份胶体壳聚糖、2.3份卵磷脂、0.002份玉米须、0.05份山药粉、0.13份破壁松花粉、0.36份土豆汁；
将所述原料混合，杀菌后即可制得菌种发酵培养基。
步骤2：菌种培育
斜面培养：将制备的壳聚糖培养基，对其紫外线进行灭菌后均匀装配到培养皿中，取土壤浸出液，等量均匀移送至制备的壳聚糖培养基培养皿中，36℃培养4天，采用平板稀释法将培养后的均匀涂抹转移到斜面培养，培养3天；
发酵培养：筛选壳聚糖透明圈大的菌种接种至制备的菌种发酵培养基中，培养温度为28℃，培养时间为90h，培养过程中，每隔10h，转动一次培养基，转动频率为350rpm，每次转动时间22min；采用常规层析柱法制得含有壳聚糖酶的酶液；
步骤3：壳聚糖酶制备
将经过超滤浓缩后的壳聚糖酶液用恒流泵泵入喷雾干燥机，在雾化器的作用下使壳聚糖酶液形成均一的细小液滴，通入的热空气和罐体内的负压状态会讲壳聚糖酶与水分离开来，分离后的酶颗粒会进入右端的旋风分离器中，在旋风分离器中实现酶与水的进一步分离，制得壳聚糖酶粉末，酶活为160KU/g，酶的比活力提高了61%。
骤4：酶解
一次快速超声处理：
将壳聚糖粉末和水进行混合，所述加入壳聚糖粉末的质量分数为17%，采用超声波进行处理，超声频率为400MHz，处理时间为12min。
搅拌：
超声处理完成后，在对混合溶液进行搅拌，滴加冰醋酸，同时逐步加入壳聚糖粉末和壳聚糖酶粉末。
壳聚糖酶粉末的加入量为壳聚糖质量的6%。
所述搅拌速率为550rpm，控制温度在36℃，至壳聚糖溶液的浓度为6wt%，溶液粘度为1200cp，溶液pH为5.6；
二次快速超声处理：
搅拌完成后，将搅拌完成的壳聚糖溶液，进行第二次快速超声处理，超声频率为22MHz，处理时间为32min；
絮凝离心：
用NaOH调节pH至8，静置25min，形成絮凝物，离心去除杂质；
步骤5：膜分离：
将上清液通过截留分子量4000的超滤膜，去除大分子壳聚糖和酶蛋白等。
步骤6：浓缩
离心过滤后将上清加入旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩比为1/6，放入低温干燥箱进行低温干燥，取出干燥后的粉末即为壳寡糖。
实施例3 一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法
步骤1：培养基制备
（1）壳聚糖培养基制备：
所述壳聚糖培养基，按重量份数计，原料包括：
壳聚糖18份、1.5%的醋酸溶液380份、(NH4)2SO4粉末5份、脱脂乳粉22份、无菌水800份；
将壳聚糖溶解到醋酸溶液汇总，然后加入(NH4)2SO4粉末、脱脂乳粉和无菌水，制备成壳聚糖培养基。
（2）菌种发酵培养基制备：
所述菌种发酵培养基，按重量份数计，原料包括：
0.8份黄豆粉、0.04份红藻培育液、1.6份稻草浸液、0.20份玉米粉、0.8份鸡蛋白液、0.1份猪骨汤、0.4份小牛血清、0.07份大豆蛋白、0.02份羊粪浸出物、11.8份胶体壳聚糖、2.6份卵磷脂、0.005份玉米须、0.06份山药粉、0.14份破壁松花粉、0.4份土豆汁；
将所述原料混合，杀菌后即可制得菌种发酵培养基。
步骤2：菌种培育
斜面培养：将制备的壳聚糖培养基，对其紫外线进行灭菌后均匀装配到培养皿中，取土壤浸出液，等量均匀移送至制备的壳聚糖培养基培养皿中，36℃培养4天，采用平板稀释法将培养后的均匀涂抹转移到斜面培养，培养4天；
发酵培养：筛选壳聚糖透明圈大的菌种接种至制备的菌种发酵培养基中，培养温度为32℃，培养时间为90h，培养过程中，每隔12h，转动一次培养基，转动频率为450rpm，每次转动时间22min；采用常规层析柱法制得含有壳聚糖酶的酶液。
步骤3：壳聚糖酶制备
将经过超滤浓缩后的壳聚糖酶液用恒流泵泵入喷雾干燥机，在雾化器的作用下使壳聚糖酶液形成均一的细小液滴，通入的热空气和罐体内的负压状态会讲壳聚糖酶与水分离开来，分离后的酶颗粒会进入右端的旋风分离器中，在旋风分离器中实现酶与水的进一步分离，制得壳聚糖酶粉末，酶活为194KU/g，酶的比活力提高了68%。
步骤4：酶解
一次快速超声处理：
将壳聚糖粉末和水进行混合，所述加入壳聚糖粉末量为20wt%，采用超声波进行处理，超声频率为450MHz，处理时间为15min。
搅拌：
超声处理完成后，在对混合溶液进行搅拌，滴加冰醋酸，同时逐步加入壳聚糖粉末和制备的壳聚糖酶粉末。
壳聚糖酶粉末的加入量为壳聚糖质量的8%。
所述搅拌速率为600rpm，搅拌温度为8℃，壳聚糖溶液的浓度为7wt%，溶液粘度为1300cp，溶液pH为5.8；
二次快速超声处理：
搅拌完成后，将搅拌完成的壳聚糖溶液，进行第二次快速超声处理，超声频率为25MHz，处理时间为35min；
絮凝离心：
用NaOH调节pH至8，静置30min，形成絮凝物，离心去除杂质；
步骤5：膜分离：
将上清液通过截留分子量5000的超滤膜，去除大分子壳聚糖和酶蛋白等。
步骤6：浓缩
离心过滤后将上清加入旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩比为1/6，放入低温干燥箱进行低温干燥，取出干燥后的粉末即为壳寡糖。
采用本发明实施例1、2、3的制备方法，制备的功能性壳寡糖，具体指标如下：
（1）采用本发明的方法制备的壳寡糖，具有壳寡糖含量高、脱乙酰度高、平均分子量高的特点，具体参数见表1：
表1：本发明制备的壳寡糖，壳寡糖有效含量、脱乙酰度、平均分子量
由上表可以看出，采用本发明的方法制备的壳寡糖，壳寡糖有效含量为92.21-99.45%，特别是采用本发明实施例3的制备方法制备的壳寡糖，壳寡糖成份最高；采用本发明的方法制备的壳寡糖，脱乙酰度为95.6-98.2%；采用本发明的方法制备的壳寡糖平均分子量为1250-1262Da。
（2）采用本发明的方法制备的壳寡糖，溶解性较好、pH适中、微生物含量少、聚合度低，具体检测指标见表2
表2：本发明制备的壳寡糖的溶解性、pH值、微生物含量、聚合度
由上表可以看出，采用本发明方法制备的的壳寡糖，溶解性为99.1-99.4；采用本发明方法制备的的壳寡糖微生物含量为1200-3200 CFU/g；采用本发明的方法制备的壳寡糖，聚合度为2-4。
（3）本发明制备的卡寡糖黏度，大肠杆菌、沙门氏菌检测结果
本发明制备的壳寡糖黏度为1.2-2.2CPS（5%壳寡糖溶液）；大肠杆菌、沙门氏菌检测呈阴性。
本产品还可以用于高端农业防病控害和人体免疫能力提高，防治肿瘤和免疫紊乱疾患。
除非另有说明和本领域技术常规单位，本发明中所采用的百分数均为重量百分数，本发明所述的比例，均为质量比例。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法，其特征在于：包括培养基制备步骤。
2.根据权利要求1所述的一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法，其特征在于：所述培养基制备步骤，包括壳聚糖培养基制备步骤；所述壳聚糖培养基，按重量份数计，原料包括：壳聚糖15-18份、1.3-1.5%的醋酸溶液300-380份、(NH4)2SO4粉末3-5份、脱脂乳粉20-22份、无菌水500-800份。
3.根据权利要求1所述的一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法，其特征在于：所述所述培养基制备步骤，还包括菌种发酵培养基制备步骤；所述菌种发酵培养基，按重量份数计，原料包括：0.5-0.8份黄豆粉、0.03-0.04份红藻培育液、1.2-1.6份稻草浸液、0.15-0.20份玉米粉、0.6-0.8份鸡蛋白液、0.08-0.10份猪骨汤、0.25-0.40份小牛血清、0.05-0.07份大豆蛋白、0.01-0.02份羊粪浸出物、1.6-1.8份胶体壳聚糖、2.3-2.6份卵磷脂、0.002-0.005份玉米须、0.04-0.06份山药粉、0.12-0.14份破壁松花粉、0.35-0.4份土豆汁。
4.根据权利要求3所述的一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法，其特征在于：所述黄豆粉，蛋白质含量22-23%，脂肪含量13.5-14.2%，钙含量0.56-0.78%，磷含量0.85-0.95%，胡萝卜素含量0.06-0.08%。
5.根据权利要求3所述的一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法，其特征在于：所述红藻培育液的制备方法包括：将新鲜红藻加入等质量的水，保温处理，保温温度为35-37℃，保温时间为20-30h。
6.根据权利要求3所述的一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法，其特征在于：所述大豆蛋白，为大豆分离蛋白，蛋白质含量92-94%，水溶氮指数92-95%，水份含量3.5-4%，脂肪含量0.3-0.45%。
7.根据权利要求3所述的一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法，其特征在于：所述卵磷脂，磷脂酰乙醇胺含量7-9%、磷脂酰肌醇含量22-25%。
8.根据权利要求3所述的一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法，其特征在于：所述破壁松花粉，为云松松花粉，目数160-170目，破壁率96-98%。
9.根据权利要求1所述的一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法，其特征在于：所述方法还包括发酵培养步骤；所述发酵培养步骤，培养温度为25-32℃，培养时间为80-120h，培养过程中，每隔10-12h，转动一次培养基，转动频率为300-500rpm，每次转动时间20-25min。
10.根据权利要求1所述的一种可控窄分子量功能性壳寡糖的生物酶解生产方法，其特征在于：所述方法还包括酶解步骤；所述酶解步骤包括二次快速超声处理步骤；所述二次快速超声处理步骤，超声频率为20-25 MHz，超声处理时间为30-35min。
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