CN107012204A

CN107012204A - 用于检测和/或定量人类dna的方法

Info

Publication number: CN107012204A
Application number: CN201710102415.3A
Authority: CN
Inventors: 安迪·温德; 弗兰切斯卡·迪帕斯奎尔; 萨比恩·韦尔纳; 萨沙·斯特劳布
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2010-09-23
Filing date: 2011-09-22
Publication date: 2017-08-04
Also published as: EP2619324B1; AU2011306916B2; JP2013540436A; US20130224742A1; JP5914490B2; AU2011306916A1; CN103180460A; EP2619324A1; AU2011306916C1; US9040243B2; WO2012038503A1

Abstract

本发明涉及用于检测和/或定量人类DNA的方法。更具体而言，本发明涉及用于检测和/或定量样品中基因组的一个或多个核酸的方法、试剂盒和各种核酸序列的用途。其中对所述核酸进行扩增，并且被扩增的基因座是基因组中的多拷贝基因座，所述多拷贝基因座在至少两个不同的染色体上具有拷贝，并对扩增产物进行检测和/或定量。

Description

用于检测和/或定量人类DNA的方法

本申请为国际申请日2011年9月22日、国际申请号PCT/EP2011/066500于2013年3月22日进入中国国家阶段、申请号201180045929.0、发明名称“用于检测和/或定量人类DNA的方法”的分案申请。

技术领域

本发明属于分子生物学、诊断学领域，更具体来说属于分析和法医学领域。本发明还属于核酸扩增和定量领域，更具体来说属于DNA定量领域。

背景技术

在所有DNA分型方法中，以及各种其他科学领域的DNA检测中，测定从法医样品以及其他样品回收的DNA的量是一个关键步骤。例如对于多重DNA分型试剂盒来说，为了产生最优结果，通常需要输入的DNA在0.5至2ng的狭窄范围内。因此，为了确保阳性结果是阳性结果和/或阴性结果是由不存在DNA造成的阴性结果，DNA的定量是绝对重要的。此外，法医DNA测试实验室的质量标准要求人类特异性的DNA定量。这是由于分离技术可能将人类DNA与细菌和其他外源DNA一起回收而造成的。已经开发了允许对人类特异性DNA进行定量的许多方法步骤，包括初始印迹(start-blot)技术、基于液体的杂交测定法和实时PCR(聚合酶链反应)。目前，由于实时PCR的动态范围宽并且易于自动化，实时PCR是主导技术。

现代的STR试剂盒已变得灵敏得多，并且即使使用少量DNA也能获得良好结果。因此，对于允许精确和准确定量甚至低浓度样品中的人类DNA的方法、试剂盒和核酸区域存在着需求。已经有某些定量和检测试剂盒可用，然而它们具有严重的缺点。一种这样的试剂盒是Quantifiler Human试剂盒(Applied Biosystems)，另一种试剂盒是Quantifiler Duo试剂盒(Applied Biosystems)，另一种试剂盒是Plexor HY实时PCR定量试剂盒(Promega)。Quantifiler Duo试剂盒和Plexor HY试剂盒两者都靶向基因组上的常染色体和性染色体(Y染色体)靶标。

所述试剂盒的缺点：根据LaSalle等，(Forensic Science International:Genetics，“通过实时聚合酶链反应进行DNA定量的单拷贝和多拷贝方法的分析”(Analysisof Single and Multi-copy Methods for DNA Quantification by Real-TimePolymerase Chain Reaction))，与Plexor HY相比，Quantifiler试剂盒在定量中更准确，但是具有较低的动态范围。Plexor HY由于扩增多拷贝靶标而提供较高的动态范围，但是准确性较低。这种较低的准确性可以归因于多拷贝靶标。如果由于例如靶标拷贝数的不稳定性，扩增少于基因组上全套20个拷贝，那么常染色体与性染色体(Y)靶标之间的扩增比率可能发生变化。Plexor HY试剂盒的动态范围略好于其他试剂盒(LaSalle等，ForensicScience International:Genetics，“通过实时聚合酶链反应进行DNA定量的单拷贝和多拷贝方法的分析”(Analysis of Single and Multi-copy Methods for DNAQuantification by Real-Time Polymerase Chain Reaction))。在统计学比较中，LaSalle等证实了这两种试剂盒之间的显著差异。

法医学中的另一个重要参数是必须进行分析的DNA的降解等级。由于QuantifilerHuman和PlexoHY试剂盒的扩增子的大小从62至133个碱基对(bp)不等，因此当将试剂盒应用于降解的DNA时，预期可能存在显著差异。

发明内容

本发明解决了上面指出的问题，并提供了如下所概述的以下解决方案。

一方面，本发明涉及用于定量和/或检测样品中基因组的一个或多个核酸的方法，其中

a.对所述核酸进行扩增，并且被扩增的基因座是基因组中的多拷贝基因座，

b.所述多拷贝基因座在至少两个不同的染色体上具有拷贝，

c.并且对扩增产物进行检测和/或定量。

这种新方法与现有方法相比的一个显著优点是更高的灵敏度和被检测靶标的更高稳定性。其他以前已知的靶标在不同个体之间可能存在变化，这是由于重复元件倾向于在数目上变化(Pavelitz等，人类U2snRNA基因在分裂中期表现出永久性开放的转录状态和启动子解体(Human U2snRNA Genes Exhibit a Persistently Open TranscriptionalState and Promoter Disassembly at Metaphase)，Molecular and Cellular Biology,2008l,p.3573-3588；Liao等，编码人类U2snRNA的串联重复基因(RNU2基因座)的协同进化参与快速染色体内均匀化和稀有的染色体间基因转变(Concerted evolution of thetandemly repeated genes encoding human U2snRNA(the RNU2locus)involves rapidintrachromosomal homogenization and rare interchromosomal gene conversion)，The EMBO Journal,Vol.16,No.3,pp.588,598,1997；Jasinska等，塑造人类转录组的重复序列(Repetitive sequences that shape the human transcriptome)，FEBS Letters567(2004)136-141)。

理想情况下，所述基因座不是重复元件例如短的串联重复序列，或本身不是具有下式的元件：(A_wC_xG_yT_z)_2-1000，其中w、x、y和z可以在0至10之间变化，并表示该单元中存在的核苷酸数目。所述单元可以被重复2至1000次。另一种重复元件是通常在端粒内的卫星DNA。其他也不适合的重复元件是短散在核元件(SINE)和长散在核元件(LINE)。

此外，本发明涉及基因组中的多拷贝基因座用于检测和/或定量所述基因组的核酸的用途，其中所述多拷贝基因座不是重复元件并在至少两个不同的染色体上具有拷贝。

此外，本发明涉及用于检测和/或定量人类核酸的试剂盒，其中所述试剂盒包含引物，所述引物在严紧的条件下与在80个碱基对的区段上与SEQ ID NO.1或52的序列具有至少80％序列同一性的序列结合。

在本文中使用下列缩写：(1)HDA(解链酶依赖性扩增)，(2)PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)，(3)gDNA(基因组DNA)，(4)FAM(6-羧基荧光素)，(5)SNP(单核苷酸多态性)，(6)NTC(无模板对照)，(7)BHQ(黑洞淬灭剂)，(8)qPCR(定量PCR)，(9)HEX(6-羧基-4,7,2’,4’,5’,7’-六氯荧光素)。

附图说明

图1

示出了鉴定到的一部分基因组区域。

图2

HDA反应的PAGE分析结果。第1道：O-RangeRuler 10bp DNA梯状条带(Fermentas)；第2和3道：使用其他引物的HDA反应；第4道：使用引物hT-For2和hT-Rev2而无gDNA的HDA；第5道：使用引物hT-For2和hT-Rev2以及10,000cp人类gDNA的HDA。

图3

图3示出了实时HDA反应的结果。虚线：没有人类DNA的对照反应；实线：具有10,000个拷贝的人类gDNA的反应。

图4

示出了来自于一系列稀释液(10ng-10pg人类gDNA)的qPCR数据。

图5

多拷贝测定(正方形)和单拷贝测定(圆)的Ct值的图；以每个反应10pg至10nggDNA加入模板DNA。

图6

序列的概述。SEQ ID NO.2和3是扩增SEQ ID NO.1的第一个带下划线部分的引物。SEQ ID NO.11和12是扩增SEQ ID NO.1的第二个带下划线部分的蝎型引物。

图7

图7示出了通过引物对11和12、5和6以及8和9扩增的区域。

图8

图8示出了人类中降解DNA的测定。

图9

图9示出了人类中降解DNA的测定结果。

图10

图10示出了可变拷贝数的测定结果。

图11A和B

图11示出了可变拷贝数的测定结果。

图12

图12示出了可变拷贝数的测定结果。

具体实施方式

用于定量和/或检测样品中基因组的一个或多个核酸的方法，其中

b.所述多拷贝基因座在至少两个不同的染色体上具有拷贝，

c.并且对扩增产物进行检测和/或定量。

令人惊讶的是，本发明人发现，当用于核酸的检测和/或定量时，不是重复元件的多拷贝基因座优于其他基因座。众所周知，在不同个体之间重复元件的拷贝数可能不同。因此，本发明优选涉及本文中引述的方法，其中所述多拷贝基因座不是重复元件。

总的来说，这些核酸可以具有原核或真核等任何来源。优选情况下，它们是哺乳动物的，更优选为人类的。这是因为本发明的一个极大优点是其在法医学领域中的应用。

一个这样的序列被显示在SEQ ID NO.1中，另一个序列显示在SEQ ID NO.52中。事实上，SEQ ID NO.1是SEQ ID NO.52的一部分。本发明人已令人吃惊地发现，该序列和/或与其具有序列相似性的序列可以在人类基因组中被多次找到。因此，理想情况下使用与这些序列结合的引物和/或探针。

分布在基因组各处的序列不是全都完全相同的。重要的是所选引物也结合于近似相同的序列。因此，理想情况下，所述基因座与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.52的序列在80个碱基对的区段上具有至少60％、70％、80％、90％或甚至95％或98％的序列同一性。

两个序列之间的百分比同一性的确定是使用Karlin和Altschul的数学算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:5873-5877)来完成的。这样的算法是Altschul等的BLASTN和BLASTP程序(J.Mol.Biol.(1990)215:403-410)的基础。使用BLASTN程序来执行BLAST核苷酸检索，分值＝100，字长＝12，以获得核苷酸序列之间的百分比同一性。使用BLASTP程序来执行BLAST蛋白质检索，分值＝50，字长＝3，以获得氨基酸序列之间的百分比同一性。为了获得空位比对(gapped alignment)供比较目的用，利用如Altschul等(Nucleic Acids Res.(1997)25:3389-3402)所述的Gapped BLAST。当利用BLAST和GappedBLAST程序时，使用相应程序的缺省参数。

本发明的一个方面是对多个拷贝进行扩增。理想情况下，对在多个不同的染色体上的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29个拷贝进行扩增。SEQ ID NO.1、52或与其非常相似的序列在人类基因组中出现高达29次。这不仅是令人惊讶的，而且提供了本发明的能力。此外，所述拷贝可以存在于各个不同的染色体例如1、4、5、7、11、16号染色体上。

扩增方法是非等温法或等温法。

非等温扩增方法可以选自聚合酶链反应(PCR)(Saiki等，(1985)Science 230:1350)、定量实时PCR(rtPCR)、连接酶链反应(LCR)(Landegren等，(1988)Science 241:1077-1080)。聚合酶链反应扩增是优选的。

等温扩增方法可以选自解链酶依赖性扩增(HDA)(Vincent等，(2004)EMBO rep 5(8):795-800)、热稳定的HDA(tHDA)(An等，(2005)J Biol Chem 280(32):28952-28958)、链置换扩增(SDA)(Walker等，(1992)Nucleic Acids Res 20(7):1691-6)、多重置换扩增(MDA)(Dean等，(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99(8):5261-5266)、滚环扩增(RCA)(Liu等，(1996)J Am Chem Soc118:1587-1594)、限制性辅助RCA(Wang等，(2004)Genome Res14:2357–2366)、单引物等温扩增(SPIA)(Dafforn等，(2004)Biotechniques 37(5):854-7)、转录介导的扩增(TMA)(Vuorinen等，(1995)J Clin Microbiol 33:1856-1859)、切口酶扩增反应(NEAR)(Maples等，US2009017453)、指数扩增反应(EXPAR)(Van Ness等，(2003)ProcNatl Acad Sci USA 100(8):4504-4509)、环介导的等温扩增(LAMP)(Notomi等，(2000)Nucleic Acids Res 28(12):e63)、重组酶聚合酶扩增(RPA)(Piepenburg等，(2006)PloSBiol 4(7):1115-1120)、基于核酸序列的扩增(NASBA)(Kievits等，(1991)J VirolMethods 35:273-286)、smart扩增法(SMAP)(Mitani等，(2007)Nat Methods 4(3):257-62)。

在本发明的文本中，“等温扩增反应”是指在反应期间温度没有显著变化。在优选实施方案中，在发生扩增的主要酶性反应步骤中，等温扩增反应的温度偏差不超过10℃，优选不超过5℃，甚至更优选不超过2℃。

取决于核酸等温扩增的方法，扩增反应需要不同的酶。用于核酸扩增的已知等温方法是上面所提到的那些，其中用于在等温条件下扩增核酸的至少一种嗜中温酶选自解旋酶、嗜中温聚合酶、具有链置换活性的嗜中温聚合酶、切口酶、重组蛋白、连接酶、糖基化酶和/或核酸酶。

“解旋酶”对于本领域技术人员来说是已知的。它们是沿着核酸的磷酸二酯骨架定向移动，使用源自于NTP或dNTP水解的能量将两条退火的核酸链(例如DNA、RNA或RNA-DNA杂合体)分开的蛋白。根据明确的解旋酶基序的存在，可以确定给定蛋白质的解旋酶活性。本领域技术人员能够选择适合的具有解旋酶活性的酶用于本发明的方法中。在优选实施方案中，解旋酶选自来自于不同家族的解旋酶：超家族I解旋酶(例如dda、pcrA、F质粒traI蛋白解旋酶、uvrD)，超家族II解旋酶(例如recQ、NS3解旋酶)，超家族III解旋酶(例如AAV rep解旋酶)，来自于DnaB样超家族的解旋酶(例如T7噬菌体解旋酶)或来自于Rho样超家族的解旋酶。

除了所需的酶之外，扩增方法还将包含缓冲液、dNTP或NTP。

当在本文中使用时，术语“dNTP”是指脱氧核糖核苷三磷酸。这样的dNTP的非限制性实例是dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，其也可以以标记的衍生物的形式存在，所述标记的衍生物例如包含荧光标记物、放射活性标记物、生物素标记物。还包括具有修饰的核苷酸碱基的dNTP，其中所述核苷酸碱基是例如次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、次黄嘌呤核苷、黄嘌呤核苷、7-甲基鸟苷、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氢尿苷、5-甲基胞苷。此外，在本发明中还包括上述分子的ddNTP。

当在本文中使用时，术语“NTP”是指核糖核苷三磷酸。这样的NTP的非限制性实例是ATP、GTP、CTP、TTP、UTP，其也可以以标记的衍生物的形式存在，所述标记的衍生物例如包含荧光标记物、放射活性标记物、生物素标记物。

理想情况下，当检测核酸时，使用解链酶依赖性扩增(HDA)。当对核酸进行定量时，使用实时PCR(rtPCR)。

理想情况下，扩增产物的大小在80bp和200bp之间。扩增产物也可以更长，即300bp、400bp或甚至更长。

理想情况下，用于扩增的引物具有在18个核苷酸的区段上与SEQ ID NO.2、3、5、6、8、9、10、11和12的差异不超过5个核苷酸的核苷酸序列。

可以使用任何适合的方法例如磷酸三酯和磷酸二酯方法或其自动化实施方案来制备寡核苷酸引物。在一个这样的自动化实施方案中，使用二乙基亚磷酰胺作为起始材料，并且它可以如Beaucage等(1981)Tetrahedron Letters 22:1859-1862所述来合成。在美国专利No.4,458,006中描述了一种用于在改性的固体支持物上合成寡核苷酸的方法。也可以使用从生物来源(例如限制性内切酶消化物)分离的引物。优选的引物具有约6-100个碱基、更优选约20-50个碱基、最优选约20-40个碱基的长度。

使用实时PCR的DNA定量

在PCR期间，DNA的量理论上随着每个循环而加倍。在每个循环后，DNA的量是循环前的两倍。

优选使用外部标准品来确定未知样品中DNA的绝对量。标准品通常非常类似于未知样品；标准品的引物结合位点应该与靶序列中的相同。这确保标准品和未知样品两者中的靶标以等同的效率被扩增，这对于定量来说是必需的。

使用实时PCR技术，在实时PCR热循环仪中检测并测定荧光，与产物的指数增加相对应的荧光的几何增加被用于确定每个反应中的循环阈值(CT)。

将未知样品和每个标准品在独立的管中进行扩增。使用不同的标准品稀释液产生标准曲线(CT值/交点对标准品的量的对数作图)。将未知样品的CT值与标准曲线进行比较，允许计算靶标的初始量。重要的是为待定量的核酸的类型选择适合的标准品。为了产生标准曲线，应该对至少5个不同的量的标准品进行定量，并且未知靶标的量应该落在标准曲线的范围之内。因此，在一个实施方案中，还执行上述定量步骤。

本发明还涉及基因组中的多拷贝基因座用于检测和/或定量所述基因组的核酸的用途，其中理想情况下，所述多拷贝基因座不是重复元件。在一个实施方案中，所述多拷贝基因座的用途旨在按照本文中引述的方法检测和/或定量核酸，或用于分析人类DNA的降解状态。

法医科学家常常应对来自于不同来源的案例工作样品。这些样品由于不同因素例如环境胁迫而可能降解。

本发明还涉及与现有技术方法相比具有更高灵敏度和准确性的人类DNA降解标志物系统。

从文献中已知，可以通过在同一反应容器中通过qPCR靶向至少两个不同的基因组区域来评估DNA的完整性。这两种共同扩增的靶标必须具有不同的长度，但是使用未降解DNA的扩增效率必须相等。因此，如果DNA未被降解，则较短和较长的PCR系统两者将以相同的效率被扩增。如果所分析的DNA受损，则样品中存在的DNA片段的平均长度将下降，这导致扩增效率的降低。由于较长系统的模板DNA在统计学上比较短系统的模板更容易受损，因此，较长PCR系统的扩增效率将比较短系统的效率低。随着样品中平均片段长度的降低，两种PCR系统之间扩增效率的差距将增加。因此，两种PCR系统的定量的比率给出了关于待分析DNA的降解状态的信息。

在下面的图8中显示了一个实例。在Rotor-Gene Q的深红色通道中使用“蝎型探针和引物降解”(SEQ ID NO.53和54)来瞄准较长PCR系统，产生了363bp的PCR产物。在相同仪器的绿色通道中使用上面概述的引物和蝎型探针来瞄准较短PCR系统，产生了146bp的PCR产物。显示了未受损的DNA样品与降解的DNA样品的(在约500、300和150bp的平均片段长度上)定量的比较。在图9中给出了使用两种PCR系统的定量。两种定量的比率是表示待分析DNA的降解状态的可能解决方案。较高的比率指示所分析DNA的较高的降解程度；也参见图9.

优选情况下，基因座与SEQ ID NO.1或52的序列在80个碱基对的区段上具有至少80％的序列同一性。序列同一性可以按照上面所概述的来确定。

本发明还涉及用于检测和/或定量人类核酸的试剂盒，其中所述试剂盒包含引物，所述引物在严紧的条件下与在50个碱基对的区段上与SEQ ID NO.1或52的序列具有至少80％的序列同一性的序列结合。结合条件对于本领域技术人员来说是已知的，并且可以在《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology),John Wiley&Sons,N.Y.,6.3.1-6.3.6,1991中找到。严紧的条件可以被定义为等同于在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在45℃下杂交，然后在0.2X SSC、0.1％SDS中在65℃下洗涤。在优选实施方案中，试剂盒旨在按照本文中引述的方法检测和/或定量核酸。

优选情况下，试剂盒中的至少一个引物具有在18个核苷酸的区段上与SEQ IDNO.2、3、5、6、8、9、10、11和12的差异不超过5个核苷酸的核苷酸序列。

实施例

本发明的极大优点是可以产生允许进行DNA定量和/或检测并且不论性别、种族或地区背景如何都能起作用的引物和探针。这提供了超过现有技术的极大优势。

人类DNA的扩增与分子诊断学以及法医学的各个领域相关。在法医学方法中，通过扩增DNA的某些区域来进行DNA分型。这些区域通常被称为短串联重复区域。为了获得正确结果，必需施加具有一定的狭窄浓度范围的模板DNA。知道向反应添加的DNA的准确量对其来说是重要的其他领域，是HLA分型以及单核苷酸多态性(SNP)分析。执行HLA分型是为了分析移植物是否会被排斥。SNP分析通常被用于分析个体的遗传背景以例如评估遗传疾病，以及用于分析个体是否对某些癌症类型易感。

此外，在与本发明方法相似的某些现有方法中，待扩增基因座的多个拷贝以串联重复基序的形式位于一条染色体上，并且在群体中存在不同的变体，这引起不同的结果。尽管这未得到证明，但它似乎是解释现有测试的缺点的一种方式。在上面也概述过的常用扩增方法是HDA方法。美国专利US 7,662,594在图6中显示了在使用过多DNA时获得的扩增结果。因此，显然在某些扩增方法中，需要知道向反应添加的DNA的准确量，并且这对于所述反应的成功而言是必需的。本发明方法的优点在于下述事实，即，能够提供来自于多个拷贝、特别是来自于不同染色体的可重复的扩增的这种基因组区域，最初通过检索文献来鉴定，这被证明是无用的，后来通过检索数据库来鉴定，这也不是非常有帮助的，其中没有基因座位于X或Y染色体之一上。本发明人从通用转录因子II H亚基2基因(GTF2H2)开始鉴定到了另一个序列，然而该序列不是该基因的一部分。鉴定到的DNA区域为约2000bp大小，并位于11号染色体上(Pos.69000bp-71000bp)。所述序列被示出在图6的SEQ ID NO.1中。在整个基因组中都可以找到与在11号染色体上鉴定到的序列具有高序列同一性的其他序列。

SEQ ID NO.2

hT-For1(5’-AGTGGGTCTGGAGAGGCCGACTTG-3’)

SEQ ID NO.3

hT-Rev1(5’-TCAGGCCCATG GGGCTCATTCCT-3’)

上面鉴定到的引物实现的扩增反应扩增了分布于整个人类基因组中的29个基因座(参见图1)。还为等温反应合成了作为引物以及探针的其他寡核苷酸。为了在本文所发明的多拷贝靶标与单拷贝靶标之间进行定量PCR的比较，产生了下列引物和探针。

hT-For1和hT-Rev1以及探针hT-Pro1(5’-FAM-TTCTGGGCCCGGAGAGGCCGC-BHQ1-3’)(SEQ ID NO.4)

所述比较在本发明的方法与使用cmyc基因的单拷贝基因定量之间进行。与cmyc相反，存在27个可以用上面概述的寡核苷酸进行扩增和探测的基因座。所述反应包含下列组分。

1x QuantiTect Multiplex Mastermix(QIAGEN)

400nM hT-For1bzw.cmyc-fwd

400nM hT-Rev1bzw.cmyc-rev

200nM hT-Pro1bzw.cmyc探针

0至10,000个拷贝的人类基因组DNA

使用Rotor Gene 6000(QIAGEN)对反应进行循环，利用了下列PCR模式：95℃10分钟，然后进行40个循环，其中每个循环由95℃10秒和60℃45秒构成。对于两种引物系统来说，PCR效率相同。hT-For1/Rev1-PCR的归一化探针荧光比cmyc-PCR反应的探针荧光早4.2±0.2个循环达到给定阈值。将这往回计算到模板浓度，这计算出hT-For1/Rev1反应与cmyc反应相比，DNA扩增模板的浓度高18倍。这不等于27:1的理论比率，但非常接近。

还使用HDA方法对多拷贝基因座进行了等温扩增。为等温扩增反应产生了许多不同的正向和反向引物。最佳组合是hT-For2(5’-GCAGAAGGTGG GCCTGGAGAGTTTGAC-3’；SEQID NO.5)和hT-Rev2(5’-CCTTTTTTGGCCCAGTTCCTGTCCAGC-3’；SEQ ID NO.6)。反应产物的检测可以作为终点测定以及实时测定两者来进行。HDA反应包含下列组分。

20mM Tris/HCl pH 8.8

40mM NaCl

10mM KCl

400nM dNTP混合物

3mM dATP

4mM MgCl₂

0.2x EvaGreen

1.75μl IsoAmp Enzymmix(Biohelix)

100nM hT-For2

100nM hT-Rev2

0至10,000个拷贝的人类基因组DNA

该溶液被分配成：

预混物I：15μl体积[hT-For2；hT-Rev2；EvaGreen；人类基因组DNA；H₂O]

预混物II：8μl体积[Tris/HCl pH 8.8；NaCl；KCl；dNTP混合物；dATP；酶混合物；H₂O]

起始溶液：2μl 50mM MgCl₂

反应如下进行：

将15μl预混物I在PCR循环仪中在95℃下温育2分钟。然后将反应冷却至4℃，然后使用ESE Quant Tubescanner(QIAGEN GmbH)再次加热至65℃。在1分钟后，向预温的预混物I加入8μl预混物II，并将反应物混合。在另外1分钟后，启动HDA反应，并在65℃下温育60分钟。在温育完成后，使用12％聚丙烯酰胺凝胶分析结果，然后将该凝胶用溴乙锭染色。结果显示在图2中。第4道显示出非常强的DNA条带，大小为约90bp。这与计算得到的88bp的扩增子长度非常符合。第3道中显示了阴性对照。阴性对照未显示出大小为约90bp的扩增产物。还进行了另一个实验，该实验显示出所述反应也可以继之以另外的荧光标记的寡核苷酸探针hT-Pro2(5’-FAM-GGAAGTTTTGGGCCTACATTGGCCGCCATG-BHQ1-3’)(SEQ ID NO.7)。

图3显示了与上面概述的反应相类似地执行的实时HDA反应。仅有的差别是添加60nM标记的探针hT-Pro2，并且引物浓度不同(40nM hT-For2，120nM hT-Rev2)。图3显示，使用人类基因组DNA作为扩增模板的HDA反应运行得很好。在约25分钟后，荧光信号强烈升高。这是寡核苷酸探针hT-Pro2与被扩增的靶标相结合的结果。

作为定量实时PCR实验，执行了其他实验。

使用了下列寡核苷酸：

hT-For3(5’-AAGGTGGGCCTGGAG AGTTT-3’)(SEQ ID NO.8)

hT-Rev3(5’-CCTTTTTTGGCCCAGTTCCTGT-3’)(SEQ ID NO.9)

hT-Pro3(5’-HEX-AAG TTTTGGGCCTACATTGGCCGC-BHQ1-3’)(SEQ ID NO.10)

这些引物和探针杂交于人类基因组中的14个基因座并扩增所述基因座。

模板是使用QiaAmp Maxi试剂盒(Qiagen)从5位男性和5位女性的EDTA处理过的血液分离的基因组DNA。

该反应包含下列组分：

1x QuantiTect Multiplex ROX Mastermix

400nM hT-For3

400nM hT-Rev3

200nM hT-Pro3

每个反应10pg至10ng人类gDNA

PCR模式如下：在95℃下15min初始温育后执行50个循环，其中每个循环由95℃1min和60℃1min构成。PCR扩增荧光曲线显示在图4中。

在同一实验内，分析了本发明的多拷贝测定法与现有技术的单拷贝方法相比是否有优势。将HEX通道中hT-For3/hT-Rev3/hT-Probe3测定法(多拷贝)的荧光信号与FAM通道中cmyc测定法(单拷贝)的信号进行比较。结果显示在图5中。多拷贝测定法的荧光信号比单拷贝cmyc测定法的荧光信号早4.2±0.2个循环跨过阈值水平。这经计算表明多拷贝靶标的浓度是单拷贝靶标的18倍。因此，该实验良好地反映出多拷贝基因座测定法理论上的14个不同的结合基因座。

此外，本发明和序列SEQ ID NO.1和52可用于分析样品中人类DNA的降解。对于所述应用来说，优选的探针和引物如下。

多拷贝靶标的另一个令人吃惊的应用是作为参比基因用于拷贝数变异(CNV)分析。

拷贝数变异(CNV)，即基因组中DNA拷贝数的变化，最近已被表明是广泛存在的现象，其影响约10-20％的人类基因组。已将CNV的出现与多种疾病例如孤独症、自体免疫障碍和癌症相关联。

用于发现CNV的最常用的分子生物学工具是微阵列分析和下一代测序(NGS)。这两种高通量方法能够发现多个潜在的CNV，其随后需要使用独立的方法进行验证。一旦得到验证，就可以在大量样品中对证实的CNV进行检查，以鉴定CNV与表型之间的统计学显著的关联性。

由于易于使用、灵敏和可缩放性，定量PCR(qPCR)通常是被选择用于CNV验证和相关研究的方法。对于这种应用来说，使用相对定量原理：首先必须确定参比基因，所述参比基因的拷贝数被假定在待比较的样品之间是恒定的。然后根据不同样品中目标基因(GOI)与参比基因的Cq差值来计算GOI的拷贝数。

由于参比基因的恒定的拷贝数为基于qPCR的CNV定量所必需的，因此我们将常用的单拷贝参比基因例如TERT(端粒酶反转录酶)的可靠性与使用多拷贝靶标的新方法进行比较。作为参比靶标的多拷贝靶标与单拷贝基因相比，提供了更灵敏和可靠的CNV定量结果。

对于拷贝数判定来说，单拷贝基因是不太可靠的参比基因。TERT，一种通常作为参比基因用于基于qPCR的CNV验证的单拷贝基因，其本身经历拷贝数变异；参见图10。

该图显示了TERT基因以及5个已知的CNV在5号染色体上的位置。基于基因组变体数据库(Database of Genomic Variants)(http://projects.tcag.ca/cgi-bin/variation/gbrowse/hg19/？name＝chr5:1211340..1337106)的信息。

此外，在dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)中记载有517个TERT单核苷酸多态性(SNP)。被qPCR引物或探针所识别的CNV参比基因序列中的SNP，可以引起qPCR效率降低以及Cq值较晚获得，并随后引起错误的拷贝数判定。

通过使用分布于整个基因组中的多拷贝遗传元件代替单拷贝基因作为参比基因用于ΔΔCq分析，可以实现更可靠的基于qPCR的拷贝数定量。

下面的理论计算说明了从CNV参比基因损失或增加1个拷贝对参比基因的Cq值以及GOI的拷贝数判定的影响。假设包括：参比基因和GOI的qPCR效率为100％；GOI是单拷贝基因，单拷贝基因的拷贝数在测试样品中不改变(NC)。CNV定量参比基因是18个拷贝的遗传元件或单拷贝基因；参见图11。

从单拷贝参比基因损失或增加一个拷贝，将引起错误的GOI拷贝数判定。从多拷贝参比基因损失或增加一个拷贝不影响GOI拷贝数判定。

基于SybrGreen的qPCR准确地定量GOI和多拷贝靶标参比元件。

这种方法依赖于在同一实验中运行的GOI和多拷贝靶标两者的Cq值的比较。用于这些实验的引物是SEQ Nr.8和SEQ Nr.9。

基于探针的qPCR准确地同时定量GOI和多拷贝靶标参比元件。这种方法依赖于双路的、基于探针的qPCR方法，其准确地在一个qPCR反应中定量GOI和多拷贝靶标两者。

用于这些实验的引物和探针是SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；也参见图12。

序列表

<110> 凯杰有限公司

<120> 用于检测和/或定量人类DNA的方法

<130> S2197 PCT BLN

<150> EP 10 17 8914.7

<151> 2010-09-23

<160> 54

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2000

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

tcaacaggcc accgtgaggg aggagctggg ccgcacgcgg gctgctggga ggcaggcagg 60

gacttggccc cgagaggccg ccgtgggggc aagagctggg cctggagagg cccctgggag 120

gcaagggcgg ggcctgcaga ggctgttctc caaccagtgc tagaactgta caggccacca 180

ggaggcagga ggtgggccct cagagcttgg ctggagaaag ttcggggcct acaaaggcgg 240

ttgggagctg ggcaggagtt gagccaaaag agcttgctta cttgctggga ggcagggccg 300

ggagagcccg acttcaggac aacttgggcc tgcggcagtc gccgggaggc ccaaccttgg 360

cgtggaggag cccaccgacc ggagaccatt tggggcctgg agatgccatc ggagggcagg 420

agctcatcct ggagaggcca ccgtgaggcc tgacctgggc ctggggagct tggcttgagg 480

aagctgtggg ccgaccaagg ccgccaggag atgggtaggc actgagtcca aagaggttgt 540

tgagaggcag gaatcgggcc tggagaccca accaggaaga agagctgggc ccggagagaa 600

tgcacggagg gtgcaagtgg gtctggagag gccgacttga ggaggttctg ggcccggaga 660

ggccgccgga agggaaaaac tgggcctgga aaggccgttg tcaggaatga gccccatggg 720

cctgaagagg ccactggcag gcgggagctg ggcctgccga agcggccgag aggcaggagc 780

tttggactcg ggaggccgca gtgaagcaac agctagctgg gcgtggagag tccgctgtga 840

ggcagaggct gggcctgtgc aggccttcgg gaggcaggag gctgggcctt gtcgaggcct 900

gcagaggcca ccgaaagtca aaagcggggc ttgggaaggc cgccgggagg catgagctgg 960

gctgggccga aagaggccac tgggaggcag gaggagctgg gcctggagag gctgccaaaa 1020

ggcaggagct tcgcctgagg atgccacagt gagacaccat ctgggtctgg agggtccact 1080

gtgaggcaga ggctgacctg tagagtccga cagtagacag aagttgggca aaagcctgat 1140

ttgaggaagt tttgggcttc aagagtcagc cacgaggcag gcactaggcc tggaaatggc 1200

ctcacagtca tgagttgggc ctaaatgggc cactgtgagg gaggagctgt gcctgttgag 1260

gctgctggca ggcaggcaga aatttggcct ggggcagctg ccatgaggca agagctgggc 1320

ctggaaaaag cccctgggag gcaagagcag ggcctgcaga ggctgttctc aagtcaaagc 1380

tgggcctgtt gatgccaccg ggaagcagaa ggtgggcctg gagagtttga cttgaggaag 1440

ttttgggcct acattggccg ccatgagctg gacaggaact gggccaaaaa aggctgttgt 1500

gaggcagcag ttgtgcctgt agacccagcc aagaggaaga ggtgggtctg gagaagcccc 1560

catgaggcag aggttgggcc tgtagacgct gacaggaggc aggagctggg cctggacagg 1620

tcaacttgag gagattttgg gccttcatag gccaccagga ggcagtagtt gggactagag 1680

agtctgactt gagtaagttt tgggcccgga gatgacgtcc tgggacagga gttgggcgtg 1740

gagaggccac cgtgaggcat aagctggatg tagagaggcc agtgtgaggc aagacctggg 1800

cctgtctagg ctgctgggag acaggcagga atctggccag ggaaggttgc catgagacaa 1860

aagttgggcc tggaaaggcc cttgtgaagc atgagcttgg cctaaagagg ccactgggtg 1920

gcaggagctg ggtgtgtaga agctgctgaa aggttgggag cttggcttgg ggggtccaca 1980

gtgaggtaga tgctgggcgt 2000

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

agtgggtctg gagaggccga cttg 24

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

tcaggcccat ggggctcatt cct 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

ttctgggccc ggagaggccg c 21

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

gcagaaggtg ggcctggaga gtttgac 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

ccttttttgg cccagttcct gtccagc 27

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

ggaagttttg ggcctacatt ggccgccatg 30

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

aaggtgggcc tggagagttt 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

ccttttttgg cccagttcct gt 22

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

aagttttggg cctacattgg ccgc 24

<210> 11

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Scorpion probe

<220>

<221> misc_feature

<223> -dabcyl-C18- between position 28 and 29

<400> 11

cgagctcagt tgtgcctgta gagctcgacc tcttcctctt ggctggg 47

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 12

ccgggaagca gaaggtgg 18

<210> 13

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagg ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggc cgttgtcagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 14

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 14

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagg ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggc cgttgtcagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 15

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagg ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggc cgttgtcagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 16

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 16

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagg ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggc cgttgtcagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 17

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagg ttctgggccc ggagaggccg ctggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggc cgttgtcagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 18

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 18

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagg ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggc tgttgtcagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 19

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 19

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagg ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 20

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 20

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagg ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 21

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 21

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagg ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 22

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 22

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagg ttctgggccc ggagaggcca ccggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 23

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 23

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagg ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggt tgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 24

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 24

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagg ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctagaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 25

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 25

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagg ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggc tgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 26

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 26

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagg ttctgggtcc gcagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 27

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 27

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagc ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 28

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 28

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagc ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 29

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 29

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagc ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 30

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 30

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagc ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 31

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 31

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagc ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 32

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 32

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagc ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 33

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 33

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagc ttctgggccc ggagaggccg ccggaagaga 60

aaaactgggc ctggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 34

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 34

agtgggtctg gagaggccga cttgaagagc ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc ctcgaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 35

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 35

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagc ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc cgggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 36

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 36

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagc ttctgggccc ggagaggccg ccggacggga 60

aaaactgggc cgggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 37

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 37

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagc ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc cgggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 38

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 38

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagc ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc cgggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 39

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 39

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagc ttctgggccc ggagaggccg ccggacggga 60

aaaactgggc tgggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 40

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 40

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagc ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc cgggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 41

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 41

agtgggtctg gagaggccga cttgaggagc ttctgggccc ggagaggccg ccggaaggga 60

aaaactgggc cgggaaaggc cgttgtgagg aatgagcccc atgggcctga 110

<210> 42

<211> 146

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 42

acctcttcct cttggctggg tctacaggca caactgctgc ctcacaacag ccttttttgg 60

cccagttcct gtccagctca tggcggccaa tgtaggccca aaacttcctc aagtcaaact 120

ctccaggccc accttctgct tcccgg 146

<210> 43

<211> 146

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 43

acctcttcct cttggctggg tctacaggca caactgctgc ctcacaacag ccttttttgg 60

cccagttcct gtccagctca tggcggccaa tgtaggccca aaacttcctc aagtcaaact 120

ctccaggccc accttctgct tcccgg 146

<210> 44

<211> 146

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 44

acctcttcct cttggctggg tctacaggca caactgctgc ctcacaacag ccttttttgg 60

cccagttcct gtccagctca tggcggccaa tgtaggccca aaacttcctc aagtcaaact 120

ctccaggccc accttctgct tcccgg 146

<210> 45

<211> 146

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 45

acctcttcct cttggctggg tctacaggca caactgctgc ctcacaacag ccttttttgg 60

cccagttcct gtccagctca tggcggccaa tgtaggccca aaacttcctc aagtcaaact 120

ctccaggccc accttctgct tcccgg 146

<210> 46

<211> 146

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 46

acctcttcct cttggctggg tctacaggca caactgctgc ctcacaacag ccttttttgg 60

cccagttcct gtccagctca tggcggccaa tgtaggccca aaacttcctc aagtcaaact 120

ctccaggccc accttctgct tcccag 146

<210> 47

<211> 146

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 47

acctcttcct cttggctggg tctacaggca caactgctgc ctcacaacag ccttttttgg 60

cccagttcct gtccagctca tggcggccaa tgtaggccca aaacttcctc aagtcaaact 120

ctccaggccc accttctgct tcccgg 146

<210> 48

<211> 146

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 48

acctcttcct cttggctggg tctacaggca caactgctgc ctcacaacag ccttttttgg 60

cccagttcct gtccagctca tggcggccaa tgtaggccca aaacttcctc aagtcaaact 120

ctccaggccc accttctgct tcccgg 146

<210> 49

<211> 146

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 49

acctcttcct cttggctggg tctacaggca caactgctgc ctcacaacag ccttttttgg 60

cccagttcct gtccagctca tggcggccaa tgtaggccca aaacttcctc aagtcaaact 120

ctccaggccc accttctgct tcccgg 146

<210> 50

<211> 146

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 50

acctcttcct cttggctggg tctacaggca caactgctgc ctcacaacag ccttttttgg 60

cccagttcct gtccagctca tggcggccaa tgtaggccca aaacttcctc aagtcaaact 120

ctccaggccc accttctgct tcccgg 146

<210> 51

<211> 146

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 51

acctcttcct cttggctggg tctacaggca caactgctgc ctcacaacag ccttttttgg 60

cccagttcct gtccagctaa tggcggccaa tgtaggccca aaacttcctc aagtcaaact 120

ctccaggccc accttctgct tcccgg 146

<210> 52

<211> 5553

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 52

tcaacaggcc accgtgaggg aggagctggg ccgcacgcgg gctgctggga ggcaggcagg 60

gacttggccc cgagaggccg ccgtgggggc aagagctggg cctggagagg cccctgggag 120

gcaagggcgg ggcctgcaga ggctgttctc caaccagtgc tagaactgta caggccacca 180

ggaggcagga ggtgggccct cagagcttgg ctggagaaag ttcggggcct acaaaggcgg 240

ttgggagctg ggcaggagtt gagccaaaag agcttgctta cttgctggga ggcagggccg 300

ggagagcccg acttcaggac aacttgggcc tgcggcagtc gccgggaggc ccaaccttgg 360

cgtggaggag cccaccgacc ggagaccatt tggggcctgg agatgccatc ggagggcagg 420

agctcatcct ggagaggcca ccgtgaggcc tgacctgggc ctggggagct tggcttgagg 480

aagctgtggg ccgaccaagg ccgccaggag atgggtaggc actgagtcca aagaggttgt 540

tgagaggcag gaatcgggcc tggagaccca accaggaaga agagctgggc ccggagagaa 600

tgcacggagg gtgcaagtgg gtctggagag gccgacttga ggaggttctg ggcccggaga 660

ggccgccgga agggaaaaac tgggcctgga aaggccgttg tcaggaatga gccccatggg 720

cctgaagagg ccactggcag gcgggagctg ggcctgccga agcggccgag aggcaggagc 780

tttggactcg ggaggccgca gtgaagcaac agctagctgg gcgtggagag tccgctgtga 840

ggcagaggct gggcctgtgc aggccttcgg gaggcaggag gctgggcctt gtcgaggcct 900

gcagaggcca ccgaaagtca aaagcggggc ttgggaaggc cgccgggagg catgagctgg 960

gctgggccga aagaggccac tgggaggcag gaggagctgg gcctggagag gctgccaaaa 1020

ggcaggagct tcgcctgagg atgccacagt gagacaccat ctgggtctgg agggtccact 1080

gtgaggcaga ggctgacctg tagagtccga cagtagacag aagttgggca aaagcctgat 1140

ttgaggaagt tttgggcttc aagagtcagc cacgaggcag gcactaggcc tggaaatggc 1200

ctcacagtca tgagttgggc ctaaatgggc cactgtgagg gaggagctgt gcctgttgag 1260

gctgctggca ggcaggcaga aatttggcct ggggcagctg ccatgaggca agagctgggc 1320

ctggaaaaag cccctgggag gcaagagcag ggcctgcaga ggctgttctc aagtcaaagc 1380

tgggcctgtt gatgccaccg ggaagcagaa ggtgggcctg gagagtttga cttgaggaag 1440

ttttgggcct acattggccg ccatgagctg gacaggaact gggccaaaaa aggctgttgt 1500

gaggcagcag ttgtgcctgt agacccagcc aagaggaaga ggtgggtctg gagaagcccc 1560

catgaggcag aggttgggcc tgtagacgct gacaggaggc aggagctggg cctggacagg 1620

tcaacttgag gagattttgg gccttcatag gccaccagga ggcagtagtt gggactagag 1680

agtctgactt gagtaagttt tgggcccgga gatgacgtcc tgggacagga gttgggcgtg 1740

gagaggccac cgtgaggcat aagctggatg tagagaggcc agtgtgaggc aagacctggg 1800

cctgtctagg ctgctgggag acaggcagga atctggccag ggaaggttgc catgagacaa 1860

aagttgggcc tggaaaggcc cttgtgaagc atgagcttgg cctaaagagg ccactgggtg 1920

gcaggagctg ggtgtgtaga agctgctgaa aggttgggag cttggcttgg ggggtccaca 1980

gtgaggtaga tgctgggcgt gaagaatctg ctgtgaggca gacgttggga ctgtagaggc 2040

tgacgggagg cagaggctgg gcctggaggg gccaccaaga tgcaggagct gggcctggag 2100

aggctgcaaa gaagcatgac ctgggcctgg tgaggtcgac ttgagaaagt tcagggcctg 2160

gagagaaggc tgggaggcag gagctgggtc taaagaggcc attgtaacga tggagctgtg 2220

cctgtggagg ctgttgtgag gcagtagcct catctgtgga ggctgccgtg acgtagggta 2280

tgggcctaaa taggccattg tgagtcatga tcttggtctg tagaggctga ctggagaaag 2340

ttctgggcct ggagaggctg ccgggaggta ggagctgggc caaaagatgt aagcacattt 2400

gcatttatta ggcactttat ttccattatt acactgtaat atataataaa ataatcatag 2460

aactcaccat aatgtagaat cagtgggcgt gttaagcttg ttttcctgca actggatggt 2520

cccacctgag cgtgatggga gaaagtaaca gatcaatagg tattagattc tcataaggac 2580

ggcgcaacct tgatccctca catgcacggt tcacaacagg gtgcgttctc ctatgagaat 2640

ctaacgctgc tgctcatctg agaaggtgga gctcaggcgg gaatgtgagc aaaggggagt 2700

ggctgtaaat acagacgaag cttccctcac tccctcactc gacaccgctc acctcctgct 2760

gtgtggctcc ttgcggctcc atggctcagg ggttggggac ccctgctcaa gtgcatccaa 2820

agcgaccctt cccacaccag tcttcacagt ggtcaagggc agcaaccact tagctcccaa 2880

ggcatgtgcc tcagctggca tttcgtcaca atcaacagta agtggtagct tgagtcactg 2940

tgaggtcacc tactggaaat caccagcatc ccatttccca ctggcaaaga gctcagcgct 3000

gccccctggg aaaccaaacc tatgcccaaa tcccatctgt gtgggtgtat ctcctgggac 3060

ccttcctaac atattagtca gagtccaatc aggaagcata aaccactcaa aagtttaaag 3120

tggtaaaatt taatacagag aattattcat tataacaggt gaacagcata atgagagatt 3180

ggctagcaca aagtaaagag aactctagag aatataggac tagcccaggc caggcatggt 3240

ggctcaggcc tgaaattcca gcaatttgag aagctaatgc aggaggattg cttaaggcca 3300

ggagctagag accggtctgg acaacagagt gagaccctgt ctctatccaa aagaagaaaa 3360

aagttagctg gtggtggtag tgcacacttg cagtcccagc tactcggaat gcggaagttt 3420

gagcctggga ggtcaaggct gcagtgaggc atgattatgc cactacagtc cagcctggtg 3480

acagagcaag accctgtctc aaagaacaaa acaacaacaa ccatttacag acagaaaaga 3540

aatagagcta ataagctgag gaaagatgtt gaaatgtgac aagtaaagta acatgaggtc 3600

ttttgtctat ttaaaataat caaacaaaaa atgacttact aaattataat accctgtgct 3660

ggcaaaggtg cagtgaaatg ggcactttct tatactatga gaggtggtta aattgtgtat 3720

aagccttccc gggtaaagcc tgtcaatttt ttaaaataat ggagacaggg tctcaccata 3780

ctgccatact gcctcctcca actcttggcc tcaagcaatc ctcctctctt agcctcccaa 3840

agtgctaaga ttatagctgg gaggcaccca aaaccctgtc aatttacatc aagggtaagg 3900

agaatgtcca ttcaccatga ctcacagtaa tcttacttct ggggagacaa ttcagtctaa 3960

acaaaaggtc atctgtacac acacagtaaa aatctgggag taactgaaga cagagttggt 4020

aagtgaaata agaaacagtt ataagaaatt aaactatggt atcaataggc acctggtaca 4080

aaaggtcagt tgatgttggc tgctactttt ttgttgtttt gagacagggt ctcactctgt 4140

cacccaggct ggagtgcaga ggcctgatca tgactcactg cagtctcagc ctccctgggc 4200

tcaagtgatc ctcccacctc agcctcccaa gtagctggga ctacaggaac atgccaccac 4260

actaggctaa ttcatgtatt tttctgtagg gatggtgact ccccctttgt ttccaaggcc 4320

tatcgcaaac tcttggcctc gagccatcct cctgcctcag cctcccaaag tgttgcgatt 4380

accagtgtga gccaccacac ctggccagct gctactttta tcaatattat tcttattcca 4440

ctcaattaaa aattattatt ttcaaggcta tgcaacagta tgtatcctac agcgtaattg 4500

taaaaacata tacagtcgtc gtccctcagt atacagaatt agttccagcc ccccatctct 4560

gcatatacca aaatccatgc ttactcacgt ttcgctgtca cccctctgga atccacgtat 4620

acgaaaattc caaatattag ttgggcatag tggcaagcac ctgtagtctc agccacgtgg 4680

gaggttgagg tgggaggatc gcttcagcct ggaaggttga ggctgcagtc agctgcgata 4740

gcactactac actccagcct tggacaacag agggagaccc tgtctcagaa caaaaaaaaa 4800

taaaaaataa aaaataaaac aggttagaaa ctgtgatgag gtctgctggg caaaattcca 4860

tataagcaaa gtataaatta ataaagcaaa tcgtgataaa ttagtacgat tgactttctg 4920

gagtttctga caataaaagt aaggaaaatg cagaacacaa agacagagag taaaaagaga 4980

aattaggaaa gcattctaca tgttgaatag gaagacactg gccatgttcg tgcagcggca 5040

gtatgtcgtg acatgacata ccttggagag aagttaacag atgaggaagt tgataaaaat 5100

catcagagaa gcaaaatact ggtagggaca ctcaagtaaa ccatgaaatt tccataactt 5160

atgtcagcaa agtgggaata ttgtacagtg tgtgttgaag ttcctataca acattgttta 5220

tctgcctttt gtttgtttgt aaggaatgta catactaaaa gttcttcttg ctgtcaaaag 5280

aatatgtgtg aataagtcat tttaacttat tcttctgttt ttcttttatc ttcctgccat 5340

catcccacag ccttacttta gaaatttttt ttttagaaaa ttgaacaagt gctccttgtg 5400

gtggcacatg cctcgaggat gggaggcagg ggtggaaggg tcacttgagg ccattagttt 5460

gacaccagcc tggccaacaa agtgagaccc cgtgtctaca aaacaattta aaaattagcc 5520

aagtatcatc atgtatacct acagtcccag cta 5553

<210> 53

<211> 44

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(28)

<223> Spacer

<400> 53

ccgcgttggg agcttggctt ggcgcggatc tacctcactg tgga 44

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 54

aggagatttt gggccttcat 20

Claims

1.引物在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒用于分析人类DNA的可能的降解状态的方法、或者所述试剂盒用于分析人类DNA的可能的降解状态和用于分析拷贝数变异(CNV)的方法，其中

a.利用所述引物对基因座进行扩增，并且被扩增的基因座是基因组中的多拷贝基因座，

b.所述多拷贝基因座在至少两个不同的染色体上具有拷贝，

c.并且对扩增产物进行检测和/或定量，并且

d.所述多拷贝基因座不是重复元件，其中所述基因座与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.52的序列在80个碱基对的区段上具有至少80％的序列同一性。

2.权利要求1的应用，其中所述多拷贝基因座的至少4个不同拷贝被扩增。

3.权利要求1的应用，其中扩增是非等温扩增或等温扩增。

4.权利要求3的应用，其中所述扩增选自定量实时PCR(rtPCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、环介导的等温扩增(LAMP)、转录介导的扩增(TMA)、解链酶依赖性扩增(HDA)、SMART扩增法(SMAP)、单引物等温扩增(SPIA)、切口酶扩增反应(NEAR)、指数扩增反应(EXPAR)、重组酶聚合酶扩增(RPA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。

5.权利要求4的应用，其中所述扩增是解链酶依赖性扩增(HDA)或实时PCR(rtPCR)。

6.权利要求1的应用，其中所述扩增产物的长度在60个碱基对和200个碱基对之间。

7.权利要求1的应用，其中用于扩增的引物具有在18个核苷酸的区段上与SEQ IDNO.2、3、5、6、8、9、10、11和/或12的差异不超过5个核苷酸的核苷酸序列。

8.用于检测和/或定量人类核酸的试剂盒，其中所述试剂盒包含引物，所述引物在严紧的条件下与在80个碱基对的区段上与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.52的序列具有至少80％的序列同一性的序列结合，并且其中所述试剂盒中至少一个引物具有在18个核苷酸的区段上与SEQ ID NO.2、3、5、6、8、9、10、11和/或12的差异不超过5个核苷酸的核苷酸序列。