JP2002532063A - 非特異的二重鎖形成を不安定化することが可能なオリゴヌクレオチドプライマーとその使用 - Google Patents
非特異的二重鎖形成を不安定化することが可能なオリゴヌクレオチドプライマーとその使用Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、オリゴヌクレオチド又はプライマーののホモポリマー伸長部の修飾が、そのような修飾されたオリゴヌクレオチドまたはプライマーのその相補ホモポリマー標的配列への結合の、非ホモポリマー配列への結合に対しての区別を改善することの実証に関する。本発明は、オリゴにおけるホモポリマー配列の修飾、ｃＤＮＡライブラリー構築の間のミスプライムを減少させるユニバーサルプライマー、ｍＲＮＡ生成やＰＣＲベース検出法等における区別化オリゴヌクレオチドの使用に関する。
Description
【０００１】
本発明は、遺伝子工学に関する。より具体的には、ＤＮＡ合成の間のミスプラ
イムを減少させる方法が提供される。特に、本発明は、ｃＤＮＡライブラリー構
築の間のミスプライムを減少させる修飾されたヌクレオシド（例えばユニバーサ
ル塩基）を含み、それにより真性の３'ポリＡ末端から開始されたｃＤＮＡクロ
ーンの比率を増加させるプライマーに関する。本発明はさらに本発明の区別する
オリゴヌクレオチドの、ｍＲＮＡ精製、ＰＣＲベースの検出方法及び配列決定等
の他の方法における使用に関する。
イムを減少させる方法が提供される。特に、本発明は、ｃＤＮＡライブラリー構
築の間のミスプライムを減少させる修飾されたヌクレオシド（例えばユニバーサ
ル塩基）を含み、それにより真性の３'ポリＡ末端から開始されたｃＤＮＡクロ
ーンの比率を増加させるプライマーに関する。本発明はさらに本発明の区別する
オリゴヌクレオチドの、ｍＲＮＡ精製、ＰＣＲベースの検出方法及び配列決定等
の他の方法における使用に関する。
【０００２】
相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の単離及び迅速なマッピングは、生物のゲノムの重要
な生物的関連の情報の特徴づけの中心である。全長ｃＤＮＡは、転写開始部位、
翻訳開始部位を予想し、第一次アミノ酸配列に基づくあるタンパク質の特性を推
定し、転写終結部位を予想し、遺伝子発現の転写後の制御に関与しているかもし
れない要素について５'と３'非翻訳領域を可視的に精査することを可能にする。
与えられた遺伝子のいくつかの完全なｃＤＮＡの分析は、選択的なスプライシン
グ、選択的なプロモーター使用、及び選択的なポリアデニル化シグナルについて
の情報を集めることを可能にし、これらは全て遺伝子発現制御に重要であること
が知られている。さらに、ゲノムとｃＤＮＡ配列の比較は、エクソン‐イントロ
ン構造を決定し、 ＲＮＡエディットが起こることを示すために必須である−転
写の後の制御機構は情報が少ない。
な生物的関連の情報の特徴づけの中心である。全長ｃＤＮＡは、転写開始部位、
翻訳開始部位を予想し、第一次アミノ酸配列に基づくあるタンパク質の特性を推
定し、転写終結部位を予想し、遺伝子発現の転写後の制御に関与しているかもし
れない要素について５'と３'非翻訳領域を可視的に精査することを可能にする。
与えられた遺伝子のいくつかの完全なｃＤＮＡの分析は、選択的なスプライシン
グ、選択的なプロモーター使用、及び選択的なポリアデニル化シグナルについて
の情報を集めることを可能にし、これらは全て遺伝子発現制御に重要であること
が知られている。さらに、ゲノムとｃＤＮＡ配列の比較は、エクソン‐イントロ
ン構造を決定し、 ＲＮＡエディットが起こることを示すために必須である−転
写の後の制御機構は情報が少ない。
【０００３】 機能研究の目的のための、ｃＤＮＡへのｍＲＮＡのクローニングは、ｍＲＮＡ
のＤＮＡコピーのインビトロ合成、その後の二重鎖ｃＤＮＡへの転換、及び適当
な原核生物ベクターへの挿入を含む、酵素触媒反応の複雑な相互関係の連続であ
る。この方法は以下の工程の連続を含むことができる（図１に示す）： １）対象の組織又は細胞系からの高品質のｍＲＮＡの分離 ２）ランダム配列のオリゴヌクレオチドの混合物又はオリゴｄ（Ｔ）プライマー
のいずれかである、ＤＮＡオリゴヌクレオチドのｍＲＮＡへのアニーリング。全
長ｃＤＮＡが必要なとき、オリゴｄ（Ｔ）がｍＲＮＡの３'ポリ（Ａ）末端とア
ニールすると考えられるので利用される。 ３）ついで逆転写酵素を用いて、ＤＮＡプライマーから開始し、ｃＤＮＡ中のＲ
ＮＡテンペレートを複製する。 ４）ＲＮＡｓｅＨ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、及びＤＮＡリガーゼを用いて、第２
の鎖合成を行なう。 ５）ｃＤＮＡの末端を磨き、クローニングのために調製し、ｃＤＮＡを適当なク
ローニングベクターに導入する。
のＤＮＡコピーのインビトロ合成、その後の二重鎖ｃＤＮＡへの転換、及び適当
な原核生物ベクターへの挿入を含む、酵素触媒反応の複雑な相互関係の連続であ
る。この方法は以下の工程の連続を含むことができる（図１に示す）： １）対象の組織又は細胞系からの高品質のｍＲＮＡの分離 ２）ランダム配列のオリゴヌクレオチドの混合物又はオリゴｄ（Ｔ）プライマー
のいずれかである、ＤＮＡオリゴヌクレオチドのｍＲＮＡへのアニーリング。全
長ｃＤＮＡが必要なとき、オリゴｄ（Ｔ）がｍＲＮＡの３'ポリ（Ａ）末端とア
ニールすると考えられるので利用される。 ３）ついで逆転写酵素を用いて、ＤＮＡプライマーから開始し、ｃＤＮＡ中のＲ
ＮＡテンペレートを複製する。 ４）ＲＮＡｓｅＨ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、及びＤＮＡリガーゼを用いて、第２
の鎖合成を行なう。 ５）ｃＤＮＡの末端を磨き、クローニングのために調製し、ｃＤＮＡを適当なク
ローニングベクターに導入する。
【０００４】 ｃＤＮＡライブラリーを生成させるために多くの異なるアプローチを用いるこ
とができるが、それらはいくつかの大きな問題を有しており、しばしば、完全な
ｃＤＮＡの分離が困難となる。不完全なｃＤＮＡのクローニングはよく起こるこ
とであり、ｍＲＮＡ転写物の部分的な特徴づけだけが行なわれ、対象のｃＤＮＡ
の全長コピーを得るために必要な費用と仕事の量がが著しく増加することになる
。現在のｃＤＮＡライブラリー中の多くのクローンが全長でない１つの大きな理
由は、オリゴｄ（Ｔ）プライマーのミスプライムのためである（de Fatima Bona
ldoら、1996, Genome Res. 6:791-806）。多くの真核生物のｍＲＮＡは、その配
列内にＡリッチ伸長部の領域を含む。こうしてオリゴｄ（Ｔ）プライマーはこれ
らの内部Ａリッチストレッチにアニールすることができる。逆転写酵素は、これ
らの内部部位から開始するとき、ｍＲＮＡの３'末端からの配列情報は、ｃＤＮ
Ａクローニングプロセスの間に失われる（図１）。大部分の生物の遺伝子コード
は〜５０％のグアノシン＋シトシン残基と５０％のアデノシン＋チミジン残基か
らなるが、遺伝子コードがこの比率からはずれている生物の例が良く知られてい
る。例えば、マラリア伝染の原因となる寄生虫、Plasmodium Falciparumのゲノ
ムは、８０％を超えるアデノシン＋チミジン残基のゲノムを有している（Weber,
J.L. 1987, Gene 52:103-109）。このことは、この生物から由来するｃＤＮＡラ
イブラリーが、第１の鎖合成の間にオリゴｄ（T）プライマーのミスプライムの
ために、多くの先端を欠いた（truncated）全長より短いクローンを含むことを
意味する。こうしてミスプライムは、一般的に遺伝子発見と特徴づけの重大な妨
害であり、ある種の生物にとってはより重大である。
とができるが、それらはいくつかの大きな問題を有しており、しばしば、完全な
ｃＤＮＡの分離が困難となる。不完全なｃＤＮＡのクローニングはよく起こるこ
とであり、ｍＲＮＡ転写物の部分的な特徴づけだけが行なわれ、対象のｃＤＮＡ
の全長コピーを得るために必要な費用と仕事の量がが著しく増加することになる
。現在のｃＤＮＡライブラリー中の多くのクローンが全長でない１つの大きな理
由は、オリゴｄ（Ｔ）プライマーのミスプライムのためである（de Fatima Bona
ldoら、1996, Genome Res. 6:791-806）。多くの真核生物のｍＲＮＡは、その配
列内にＡリッチ伸長部の領域を含む。こうしてオリゴｄ（Ｔ）プライマーはこれ
らの内部Ａリッチストレッチにアニールすることができる。逆転写酵素は、これ
らの内部部位から開始するとき、ｍＲＮＡの３'末端からの配列情報は、ｃＤＮ
Ａクローニングプロセスの間に失われる（図１）。大部分の生物の遺伝子コード
は〜５０％のグアノシン＋シトシン残基と５０％のアデノシン＋チミジン残基か
らなるが、遺伝子コードがこの比率からはずれている生物の例が良く知られてい
る。例えば、マラリア伝染の原因となる寄生虫、Plasmodium Falciparumのゲノ
ムは、８０％を超えるアデノシン＋チミジン残基のゲノムを有している（Weber,
J.L. 1987, Gene 52:103-109）。このことは、この生物から由来するｃＤＮＡラ
イブラリーが、第１の鎖合成の間にオリゴｄ（T）プライマーのミスプライムの
ために、多くの先端を欠いた（truncated）全長より短いクローンを含むことを
意味する。こうしてミスプライムは、一般的に遺伝子発見と特徴づけの重大な妨
害であり、ある種の生物にとってはより重大である。
【０００５】 これらの技術的制限は、種々の長さの産物のセットが、しばしば、第１の鎖合
成の間に生成されることを意味する。その結果、多くの先端を欠いたクローンが
いかなる与えられたライブラリーにも存在し得る。これらのクローニングの障害
があるために、遺伝子構造についての解釈は、時々誤ることがあり、ｃＤＮＡク
ローニングは、しばしな不十分で、費用がかかり、時間を要し、しばしばいくつ
かの異なるライブラリーのサンプリングを必要とする。
成の間に生成されることを意味する。その結果、多くの先端を欠いたクローンが
いかなる与えられたライブラリーにも存在し得る。これらのクローニングの障害
があるために、遺伝子構造についての解釈は、時々誤ることがあり、ｃＤＮＡク
ローニングは、しばしな不十分で、費用がかかり、時間を要し、しばしばいくつ
かの異なるライブラリーのサンプリングを必要とする。
【０００６】 ｃＤＮＡライブラリーを作製する実際の方法は、Gublerら、1983,Gene 25:263
-269のオリジナルの方法から遠くは外れていない。第１の鎖合成の間の種々の長
さの産物の頻度の高い作製のために、いかなる遺伝子についても、多くの先端を
切られたクローンが、ライブラリー中に存在するであろう。オリゴｄ（Ｔ）を用
いたｍＲＮＡのポリ（Ａ）領域からのプライムは、３'非翻訳領域の全体のコピ
ーを得るために必要である。しかしながら、オリゴｄ（Ｔ）プライマーの内部Ａ
リッチ部位へのミスアニールのためにかなりの割合のクローンが真性の３'末端
を有していないことは、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする多くの研究
室が経験している。実際に３'先端が欠けたｃＤＮＡは、いくつかのライブラリ
ーで１０〜１５％の頻度で起こることが見積もられる（de Fatima Bonaldoら、1
996、前述）。そのようなクローンは、真性のポリアデニル化シグナル配列、ｃ
ＤＮＡのオリゴ（ｄＡ）末端の〜２０のヌクレオチド上流、の非存在により容易
に認識される。もし、内部Ａリッチ配列へのアニールに対して、逆転写酵素プラ
イマーの真性ポリ（Ａ）末端へのアニールの区別が増加されるなら、このミスプ
ライム産物の頻度は著しく減少するであろう。
-269のオリジナルの方法から遠くは外れていない。第１の鎖合成の間の種々の長
さの産物の頻度の高い作製のために、いかなる遺伝子についても、多くの先端を
切られたクローンが、ライブラリー中に存在するであろう。オリゴｄ（Ｔ）を用
いたｍＲＮＡのポリ（Ａ）領域からのプライムは、３'非翻訳領域の全体のコピ
ーを得るために必要である。しかしながら、オリゴｄ（Ｔ）プライマーの内部Ａ
リッチ部位へのミスアニールのためにかなりの割合のクローンが真性の３'末端
を有していないことは、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする多くの研究
室が経験している。実際に３'先端が欠けたｃＤＮＡは、いくつかのライブラリ
ーで１０〜１５％の頻度で起こることが見積もられる（de Fatima Bonaldoら、1
996、前述）。そのようなクローンは、真性のポリアデニル化シグナル配列、ｃ
ＤＮＡのオリゴ（ｄＡ）末端の〜２０のヌクレオチド上流、の非存在により容易
に認識される。もし、内部Ａリッチ配列へのアニールに対して、逆転写酵素プラ
イマーの真性ポリ（Ａ）末端へのアニールの区別が増加されるなら、このミスプ
ライム産物の頻度は著しく減少するであろう。
【０００７】 ＤＮＡ又はＲＮＡ鎖がその相補体に結合して、二重鎖構造を形成する、核酸ハ
イブリダイゼーションは、分子生物学における基本的なプロセスである。このプ
ロセスの重大な態様は、１つの鎖の他の鎖による分子認識の特異性である。単一
塩基ほどの微妙な配列の相違は、短い（例えば−１４mer）オリゴマーの区別に
十分であり、しばしば遺伝子中のポイント変異の検出に用いられる（Connerら、
1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80:278-282）。オリゴヌクレオチドを用いた単一
ポイント変化の分子の区別は、よく報告され、基礎となる熱力学もよく研究され
ている（Ikutaら,1987,Nucl.Acid Res.15:797-811; Doktyczら,1995,J.Biol.Che
m.270:8439-8445;Southernら,1994,Nucl.Acids Res.22:1368-1373;Saikiら,1989
,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6230-6234）。しかしながら、多くの場合で、完全
にマッチする相補体（例えば、ポリ（Ａ）末端とオリゴｄ（Ｔ）15との間）と１
つの塩基だけミスマッチする相補体（例えばＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡと
オリゴｄ（Ｔ）15との間）との安定性の差が、非常に小さい可能性があり、それ
らの二重鎖溶解温度（Ｔmｓ）における０．５℃ほどの差異に対応している。対
象のオリゴマーが長いほど（例えばオリゴｄ（Ｔ）20プライマー対オリゴｄ（Ｔ
）15プライマー）、単一塩基のミスマッチの、二重鎖全体の安定性に対する効果
が小さくなる。ハイブリダイゼーションにおけるこの制限は、オリゴｄ（Ｔ）プ
ライマーがしばしば、ｃＤＮＡライブラリー作製の間、ｍＲＮＡテンペレート上
の内部Ａリッチ配列にハイブリダイズする主たる理由であり、そのようなライブ
ラリーの多くのクローンが真性の３'末端を含まない理由である。
イブリダイゼーションは、分子生物学における基本的なプロセスである。このプ
ロセスの重大な態様は、１つの鎖の他の鎖による分子認識の特異性である。単一
塩基ほどの微妙な配列の相違は、短い（例えば−１４mer）オリゴマーの区別に
十分であり、しばしば遺伝子中のポイント変異の検出に用いられる（Connerら、
1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80:278-282）。オリゴヌクレオチドを用いた単一
ポイント変化の分子の区別は、よく報告され、基礎となる熱力学もよく研究され
ている（Ikutaら,1987,Nucl.Acid Res.15:797-811; Doktyczら,1995,J.Biol.Che
m.270:8439-8445;Southernら,1994,Nucl.Acids Res.22:1368-1373;Saikiら,1989
,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6230-6234）。しかしながら、多くの場合で、完全
にマッチする相補体（例えば、ポリ（Ａ）末端とオリゴｄ（Ｔ）15との間）と１
つの塩基だけミスマッチする相補体（例えばＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡと
オリゴｄ（Ｔ）15との間）との安定性の差が、非常に小さい可能性があり、それ
らの二重鎖溶解温度（Ｔmｓ）における０．５℃ほどの差異に対応している。対
象のオリゴマーが長いほど（例えばオリゴｄ（Ｔ）20プライマー対オリゴｄ（Ｔ
）15プライマー）、単一塩基のミスマッチの、二重鎖全体の安定性に対する効果
が小さくなる。ハイブリダイゼーションにおけるこの制限は、オリゴｄ（Ｔ）プ
ライマーがしばしば、ｃＤＮＡライブラリー作製の間、ｍＲＮＡテンペレート上
の内部Ａリッチ配列にハイブリダイズする主たる理由であり、そのようなライブ
ラリーの多くのクローンが真性の３'末端を含まない理由である。
【０００８】 Guoら（1997,Nature Biotech.15:331-335）は、最近、塩基アナログ３−ニト
ロピロールを用いて人為的なミスマッチをプローブヌクレオチドに導入すること
により、オリゴヌクレオチドによる単一ヌクレオチドミスマッチの区別を増大さ
せることを達成できることを示した。この塩基アナログは、ＤＮＡ二重鎖の立体
障害なしに水素がすべての４つの塩基と最小限に結合するユニバーサルヌクレオ
シドとして作用する（Nicholsら、1994,Nature 369:492-493）。ＤＮＡの２つの
相補鎖の塩基の間の水素結合が、二重鎖ＤＮＡの統一性を保持するための主な熱
力学的力であることから、水素結合力の少ないアナログによる塩基置換は、ユニ
バーサルヌクレオシドとして機能することができる（Nicholsら、1994、前述）
。このように機能する多くの異なるヌクレオシドアナログが開発されている（Mi
llicanら、1984,Nucl.Acids Res. 12:7435-7453; Inoneら、1985,Nucl.Acids Re
s.13:7119-7128; Fukadaら、1986, Naturforsch.B.41:1571-1579;Seelaら、1986
,Nucl.Acids Res.14:1825-1844;Eritjaら、1986,Nucl.Acids Res.14:8135-8153;
Habenerら、1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:1735-1739; Linら、1989,Nucl.Ac
ids Res.17:10373-10383; Francoisら、1990,Tetrahedron Lett. 32:6347-6350;
Brownら、1991,Carbohydrate Res.216:129-139）。Guoら（1997,前述）は、ユ
ニバーサルアナログの、ヘテロポリマーオリゴヌクレオチドへのそれらの合成の
間の導入が、ユニバーサルヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドと、正常で
単一ヌクレオチドバリアントＤＮＡターゲットとの間に形成されたハイブリッド
の熱安定性（△Ｔm）が、野生型のオリゴヌクレオチドと正常又は単一ヌクレオ
チドバリアントＤＮＡターゲットとの間に形成されたハイブリッドと比べて、２
００％も増加することを示した。
ロピロールを用いて人為的なミスマッチをプローブヌクレオチドに導入すること
により、オリゴヌクレオチドによる単一ヌクレオチドミスマッチの区別を増大さ
せることを達成できることを示した。この塩基アナログは、ＤＮＡ二重鎖の立体
障害なしに水素がすべての４つの塩基と最小限に結合するユニバーサルヌクレオ
シドとして作用する（Nicholsら、1994,Nature 369:492-493）。ＤＮＡの２つの
相補鎖の塩基の間の水素結合が、二重鎖ＤＮＡの統一性を保持するための主な熱
力学的力であることから、水素結合力の少ないアナログによる塩基置換は、ユニ
バーサルヌクレオシドとして機能することができる（Nicholsら、1994、前述）
。このように機能する多くの異なるヌクレオシドアナログが開発されている（Mi
llicanら、1984,Nucl.Acids Res. 12:7435-7453; Inoneら、1985,Nucl.Acids Re
s.13:7119-7128; Fukadaら、1986, Naturforsch.B.41:1571-1579;Seelaら、1986
,Nucl.Acids Res.14:1825-1844;Eritjaら、1986,Nucl.Acids Res.14:8135-8153;
Habenerら、1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:1735-1739; Linら、1989,Nucl.Ac
ids Res.17:10373-10383; Francoisら、1990,Tetrahedron Lett. 32:6347-6350;
Brownら、1991,Carbohydrate Res.216:129-139）。Guoら（1997,前述）は、ユ
ニバーサルアナログの、ヘテロポリマーオリゴヌクレオチドへのそれらの合成の
間の導入が、ユニバーサルヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドと、正常で
単一ヌクレオチドバリアントＤＮＡターゲットとの間に形成されたハイブリッド
の熱安定性（△Ｔm）が、野生型のオリゴヌクレオチドと正常又は単一ヌクレオ
チドバリアントＤＮＡターゲットとの間に形成されたハイブリッドと比べて、２
００％も増加することを示した。
【０００９】 Bergstomらの米国特許第５，４３８，１３１号は、少なくとも２つの異なる塩
基からなり、少なくとも１つのユニバーサルヌクレオシドを含む、少なくとも１
０ヌクレオシドのオリゴヌクレオチドと、それを使用してリスクの要素を減少さ
せ、ＤＮＡライブラリーのスクリーニングの成功率を増加させることを教示して
いる。このユニバーサル塩基は米国特許第５，４３８，１３１号に、その同種の
、共通塩基Ａ，Ｔ，Ｃ及びＧ（並びにＵ）の１つの塩基対を形成することができ
る修飾核酸塩基として定義される。ユニバーサル塩基の目的は、プローブのユニ
ークさを保存しながら縮重を減少させることである。種々の化合物がユニバーサ
ル塩基として研究され、それらのうちの多くが米国特許第５，４３８，１３１号
に記載されている。好ましい実施態様において、米国特許第５，４３８，１３１
号は、オリゴマーが未知の塩基に結合でき、多義又は未知の核酸配列と二重鎖の
形成を可能にするように、縮重位置においてユニバーサルヌクレオシドを含むオ
リゴヌクレオチドに関する。特に好ましい実施態様において、米国特許第５，４
３８，１３１号は、ユニバーサルヌクレオシドとして３−ニトロピロールヌクレ
オシドに関する。したがって米国特許第５，４３８，１３１号は、オリゴヌクレ
オチドのヘテロポリマーと標的核酸との間の二重鎖形成の安定化のための、ユニ
バーサルヌクレオシドの使用に関する。
基からなり、少なくとも１つのユニバーサルヌクレオシドを含む、少なくとも１
０ヌクレオシドのオリゴヌクレオチドと、それを使用してリスクの要素を減少さ
せ、ＤＮＡライブラリーのスクリーニングの成功率を増加させることを教示して
いる。このユニバーサル塩基は米国特許第５，４３８，１３１号に、その同種の
、共通塩基Ａ，Ｔ，Ｃ及びＧ（並びにＵ）の１つの塩基対を形成することができ
る修飾核酸塩基として定義される。ユニバーサル塩基の目的は、プローブのユニ
ークさを保存しながら縮重を減少させることである。種々の化合物がユニバーサ
ル塩基として研究され、それらのうちの多くが米国特許第５，４３８，１３１号
に記載されている。好ましい実施態様において、米国特許第５，４３８，１３１
号は、オリゴマーが未知の塩基に結合でき、多義又は未知の核酸配列と二重鎖の
形成を可能にするように、縮重位置においてユニバーサルヌクレオシドを含むオ
リゴヌクレオチドに関する。特に好ましい実施態様において、米国特許第５，４
３８，１３１号は、ユニバーサルヌクレオシドとして３−ニトロピロールヌクレ
オシドに関する。したがって米国特許第５，４３８，１３１号は、オリゴヌクレ
オチドのヘテロポリマーと標的核酸との間の二重鎖形成の安定化のための、ユニ
バーサルヌクレオシドの使用に関する。
【００１０】
ｃＤＮＡ合成の現在の方法の技術的制限を鑑みて、特異的及び非特異的二重鎖
との間の区別を増加させるために、人為的な二重鎖形成を不安定化する必要性が
存在している。また、一般的にミスマッチを減少させる、より具体的にはＤＮＡ
合成、ｃＤＮＡライブラリー構築、及びＰＣＲ応用の間のミスプライムを減少さ
せる手段を提供する必要性も存在している。本発明はこれらとその他の必要性を
満たすことを意図する。
との間の区別を増加させるために、人為的な二重鎖形成を不安定化する必要性が
存在している。また、一般的にミスマッチを減少させる、より具体的にはＤＮＡ
合成、ｃＤＮＡライブラリー構築、及びＰＣＲ応用の間のミスプライムを減少さ
せる手段を提供する必要性も存在している。本発明はこれらとその他の必要性を
満たすことを意図する。
【００１１】 本明細書は、多くの文献を参照するが、その内容のすべてはこの明細書に取り
込まれるものとする。
込まれるものとする。
【００１２】
本発明は、人為的な二重鎖形成を不安定化し、プライマーとその標的配列との
間のミスマッチの数を減少させることが可能なプライマー修飾の同定に関する。
間のミスマッチの数を減少させることが可能なプライマー修飾の同定に関する。
【００１３】 １つの実施態様において、本発明は、さらに、非ホモポリマー標的配列に比較
して、ホモポリマー標的配列（真性の標的配列）へのそれらの結合の間の区別を
改善するプライマー同定修飾に関する。したがって本発明は、それらのホモポリ
マー相補配列と、関連する標的配列との間の区別において改善されたオリゴヌク
レオチドを提供する。さらに、本発明は、ミスマッチを不安定化するオリゴヌク
レオチド修飾を同定するために用いる（又は適合する）ことができるアッセイを
提供する。
して、ホモポリマー標的配列（真性の標的配列）へのそれらの結合の間の区別を
改善するプライマー同定修飾に関する。したがって本発明は、それらのホモポリ
マー相補配列と、関連する標的配列との間の区別において改善されたオリゴヌク
レオチドを提供する。さらに、本発明は、ミスマッチを不安定化するオリゴヌク
レオチド修飾を同定するために用いる（又は適合する）ことができるアッセイを
提供する。
【００１４】 本発明は、また、ＤＮＡ合成の間に起こるミスプライムを減少させるプライマ
ーの開発に関する。より具体的には、本発明は、ｃＤＮＡ生成の間の内部のミス
プライムの数を減少させ、これにより真性の３'ポリ（Ａ）末端の正しいプライ
ムの効率を改善する、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを含むプライマ
ーの開発に関する。
ーの開発に関する。より具体的には、本発明は、ｃＤＮＡ生成の間の内部のミス
プライムの数を減少させ、これにより真性の３'ポリ（Ａ）末端の正しいプライ
ムの効率を改善する、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを含むプライマ
ーの開発に関する。
【００１５】 本発明はさらに、遺伝子工学方法、例えばｍＲＮＡ精製、３'ＲＡＣＥ，５'Ｒ
ＡＣＥ、ＰＣＲ、配列決定などの間の、ミスマッチの比率を減少させるユニバー
サルプライマーに関する。特に好ましい実施態様において、本発明は、そのホモ
ポリマー標的配列へのミスマッチを減少させ、それにより修飾されたオリゴヌク
レオチドを生成させるために、ホモポリマー伸長部を含む、オリゴヌクレオチド
中の少なくとも１つのユニバーサル塩基の取り込みに関する。本発明は特に、修
飾されたオリゴヌクレオチドに関し、ここでオリゴのホモポリマー伸長部は、そ
れらの標的配列へのそれらの結合を改善する修飾を含む。さらに具体的には、本
発明は、ホモポリマー伸長部に少なくとも１つの３−ニトロピロール修飾を取り
込んだプライマー又はオリゴに関する。
ＡＣＥ、ＰＣＲ、配列決定などの間の、ミスマッチの比率を減少させるユニバー
サルプライマーに関する。特に好ましい実施態様において、本発明は、そのホモ
ポリマー標的配列へのミスマッチを減少させ、それにより修飾されたオリゴヌク
レオチドを生成させるために、ホモポリマー伸長部を含む、オリゴヌクレオチド
中の少なくとも１つのユニバーサル塩基の取り込みに関する。本発明は特に、修
飾されたオリゴヌクレオチドに関し、ここでオリゴのホモポリマー伸長部は、そ
れらの標的配列へのそれらの結合を改善する修飾を含む。さらに具体的には、本
発明は、ホモポリマー伸長部に少なくとも１つの３−ニトロピロール修飾を取り
込んだプライマー又はオリゴに関する。
【００１６】 本発明は、また、ミスマッチとミスプライムの比率を減少させるオリゴヌクレ
オチド中の修飾を同定するアッセイに関し、これは選択されたプライマーの修飾
のランダム又は合理的設計と、二重鎖を形成するためのその標的配列とのそれら
のハイブリダイゼーションと、この二重鎖から開始するＤＮＡ合成と、ミスプラ
イムの存在を評価するための合成されたＤＮＡの分析とを含み、ここでミスプラ
イムの数は、真性プライム部位（すなわちホモポリマープライム部位）から開始
から生産されたｃＤＮＡと比較して先端を欠いたサイズのｃＤＮＡを生産する。
オチド中の修飾を同定するアッセイに関し、これは選択されたプライマーの修飾
のランダム又は合理的設計と、二重鎖を形成するためのその標的配列とのそれら
のハイブリダイゼーションと、この二重鎖から開始するＤＮＡ合成と、ミスプラ
イムの存在を評価するための合成されたＤＮＡの分析とを含み、ここでミスプラ
イムの数は、真性プライム部位（すなわちホモポリマープライム部位）から開始
から生産されたｃＤＮＡと比較して先端を欠いたサイズのｃＤＮＡを生産する。
【００１７】 本発明によれば、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の非特異的二重鎖形成
を不安定化する方法が提供され、ここで、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド
と標的核酸はホモポリマー配列を含み、該方法は標的核酸と修飾されたオリゴヌ
クレオチドとのインキュベーションを含み、修飾されたオリゴヌクレオチドは、
それ自身と及び非特異的標的配列の間の水素結合を減少又は阻止する修飾を含み
、こうして、用いられたハイブリダイゼーションの条件下で真性二重鎖形成と人
為形成との区別を可能にする方法が提供される。本発明の好ましい実施態様によ
れば、標的核酸はホモポリマー配列である。
を不安定化する方法が提供され、ここで、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド
と標的核酸はホモポリマー配列を含み、該方法は標的核酸と修飾されたオリゴヌ
クレオチドとのインキュベーションを含み、修飾されたオリゴヌクレオチドは、
それ自身と及び非特異的標的配列の間の水素結合を減少又は阻止する修飾を含み
、こうして、用いられたハイブリダイゼーションの条件下で真性二重鎖形成と人
為形成との区別を可能にする方法が提供される。本発明の好ましい実施態様によ
れば、標的核酸はホモポリマー配列である。
【００１８】 本発明によれば、ライブラリー中の全長ｃＤＮＡクローンの比率を増加させる
方法であって、第１の鎖合成の間の修飾されたオリゴｄ（Ｔ）プライマーの使用
を含むものであり、修飾は前記修飾オリゴｄ（Ｔ）プライマーと非特異的標的配
列との間の水素結合を減少又は阻止させ、これにより全長ｃＤＮＡクローンの比
率を増加させるものである方法が提供される。
方法であって、第１の鎖合成の間の修飾されたオリゴｄ（Ｔ）プライマーの使用
を含むものであり、修飾は前記修飾オリゴｄ（Ｔ）プライマーと非特異的標的配
列との間の水素結合を減少又は阻止させ、これにより全長ｃＤＮＡクローンの比
率を増加させるものである方法が提供される。
【００１９】 本発明の別の態様によれば、ＤＮＡ合成を開始する修飾されたオリゴヌクレオ
チドの使用を含む、ＤＮＡ合成の間のミスプライムを減少させる方法であって、
修飾は、前記修飾されたオリゴヌクレオチドと非特異的標的配列との間の水素結
合を減少又は阻止し、これにより、ミスプライムを減少させる方法が提供される
。
チドの使用を含む、ＤＮＡ合成の間のミスプライムを減少させる方法であって、
修飾は、前記修飾されたオリゴヌクレオチドと非特異的標的配列との間の水素結
合を減少又は阻止し、これにより、ミスプライムを減少させる方法が提供される
。
【００２０】 さらに本発明の別の態様によれば、非特異的二重鎖形成を不安定化し、ＤＮＡ
合成の間のミスプライムを減少させる修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー
が提供される。
合成の間のミスプライムを減少させる修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー
が提供される。
【００２１】 本発明の方法は、第１の鎖ｃＤＮＡ合成の間に、オリゴｄ（Ｔ）ミスペアリン
グのために異常な３'末端を含むクローンの数を減少させることにより、より具
体的にはelF-４GII ｍＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡ比率の質を改善することが示
されるが、本発明は、広く利用され、それに制限されない。３'ミスペアリング
は、多くの生物からのｃＤＮＡライブラリーを生成させるときに起こる一般的な
問題であるが、 Ａリッチゲノムを有する生物からｃＤＮＡライブラリーを生成
させるときに、内部Ａリッチ伸長部が、これらの生物からの遺伝子においてより
高いであろうために、この問題は特に悪化する可能性がある。不完全なＡ領域の
このタイプは、ライブラリー構築の間、オリゴｄ（Ｔ）にミスアニールし、先端
を欠いたｃＤＮＡを生成すると考えられる。そのような生物の例は、蚊によるマ
ラリア伝染の原因となる寄生虫である、Plasmodium falciparumである。したが
って、本発明は、いかなる生物または核酸配列含有物からも、非標的又は非特異
的核酸配列へのオリゴヌクレオチド又はプライマーをミスペアリングを不安定化
し、それによりオリゴヌクレオチド又はプライマーとその適正な標的配列との間
の形成された二重鎖の比率を増加する手段を提供する。本発明の１つの好ましい
実施態様において、修飾されたプライマーは、実質的に、その相補ホモポリマー
配列を標的とするヌクレオチドのホモポリマー伸長部（修飾を含む）を含む。
グのために異常な３'末端を含むクローンの数を減少させることにより、より具
体的にはelF-４GII ｍＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡ比率の質を改善することが示
されるが、本発明は、広く利用され、それに制限されない。３'ミスペアリング
は、多くの生物からのｃＤＮＡライブラリーを生成させるときに起こる一般的な
問題であるが、 Ａリッチゲノムを有する生物からｃＤＮＡライブラリーを生成
させるときに、内部Ａリッチ伸長部が、これらの生物からの遺伝子においてより
高いであろうために、この問題は特に悪化する可能性がある。不完全なＡ領域の
このタイプは、ライブラリー構築の間、オリゴｄ（Ｔ）にミスアニールし、先端
を欠いたｃＤＮＡを生成すると考えられる。そのような生物の例は、蚊によるマ
ラリア伝染の原因となる寄生虫である、Plasmodium falciparumである。したが
って、本発明は、いかなる生物または核酸配列含有物からも、非標的又は非特異
的核酸配列へのオリゴヌクレオチド又はプライマーをミスペアリングを不安定化
し、それによりオリゴヌクレオチド又はプライマーとその適正な標的配列との間
の形成された二重鎖の比率を増加する手段を提供する。本発明の１つの好ましい
実施態様において、修飾されたプライマーは、実質的に、その相補ホモポリマー
配列を標的とするヌクレオチドのホモポリマー伸長部（修飾を含む）を含む。
【００２２】 本発明がオリゴｄ（Ｔ）・Ｚプライマー（２つのチミン塩基が３−ニトロピロ
ールにより置換されているオリゴｄ（Ｔ）プライマー）を用いて示されるが、本
発明は特にこれに制限されない。例えば、例示されたオリゴヌクレオチオド、オ
リゴｄ（Ｔ）プライマー内の修飾された塩基の位置は、プライマーと、相補テン
ペレート又は部分相補テンペレートのいずれかとの区別を変えることなしに、変
えることができる（図２Ｃ）。実際に、Guoら（1997,前述）は、与えられたヘテ
ロポリマーオリゴヌクレオチド内の２ユニバーサルヌクレオシドの位置を変えて
おり、多くの場合完全にマッチしたテンペレートとミスマッチテンペレートとの
区別の増加が保持されることを示している。こうして、本発明は、適当なアッセ
イ条件下でその修飾がオリゴヌクレオチドの区別する能力を保持する限り、いか
なる位置でもヌクレオチド修飾された含むオリゴｄ（Ｔ）プライマー等の、いか
なるホモポリマー伸長部含有オリゴヌクレオチド（又はホモポリマー標的配列に
結合するように設計されたいかなるオリゴヌクレオチド）へも発展する。本発明
はさらに、修飾がオリゴヌクレオチドの区別能力を変えるかどうかを評価する手
段を提供することは、当業者には明白なはずである。さらに、いかなるホモポリ
マー相補配列二重鎖形成が本発明により改善されるであろうことも、明白なはず
である。したがって広い意味において、本発明は、非−相補的配列に比べて、そ
れらの相補ホモポリマー配列に対する改善された区別をもってオリゴ又はプライ
マーを作製する手段と方法を提供する。
ールにより置換されているオリゴｄ（Ｔ）プライマー）を用いて示されるが、本
発明は特にこれに制限されない。例えば、例示されたオリゴヌクレオチオド、オ
リゴｄ（Ｔ）プライマー内の修飾された塩基の位置は、プライマーと、相補テン
ペレート又は部分相補テンペレートのいずれかとの区別を変えることなしに、変
えることができる（図２Ｃ）。実際に、Guoら（1997,前述）は、与えられたヘテ
ロポリマーオリゴヌクレオチド内の２ユニバーサルヌクレオシドの位置を変えて
おり、多くの場合完全にマッチしたテンペレートとミスマッチテンペレートとの
区別の増加が保持されることを示している。こうして、本発明は、適当なアッセ
イ条件下でその修飾がオリゴヌクレオチドの区別する能力を保持する限り、いか
なる位置でもヌクレオチド修飾された含むオリゴｄ（Ｔ）プライマー等の、いか
なるホモポリマー伸長部含有オリゴヌクレオチド（又はホモポリマー標的配列に
結合するように設計されたいかなるオリゴヌクレオチド）へも発展する。本発明
はさらに、修飾がオリゴヌクレオチドの区別能力を変えるかどうかを評価する手
段を提供することは、当業者には明白なはずである。さらに、いかなるホモポリ
マー相補配列二重鎖形成が本発明により改善されるであろうことも、明白なはず
である。したがって広い意味において、本発明は、非−相補的配列に比べて、そ
れらの相補ホモポリマー配列に対する改善された区別をもってオリゴ又はプライ
マーを作製する手段と方法を提供する。
【００２３】 本発明は、それが二重鎖の不安定化（二置換を有するオリゴｄ（Ｔ）、及びそ
のポリＡ標的配列で例示される）をもたらす修飾が、ミスマッチとミスプライム
の比率を著しく減少することを示すために、広く意味を有することは当業者にと
って明白なはずである。したがって、オリゴヌクレオチドとその標的配列との間
の水素結合の他のタイプの不安定化も同じ効果を有するかもしれないと考えられ
る。そのような二重鎖形成の不安定化をもたらす、オリゴヌクレオチドの修飾の
非制限的な例には、水素結合を減少又は阻止する修飾が含まれる。非制限的なよ
り具体的な例には、既知の塩基修飾、塩基アナログ（例えば、後述するようにイ
ノシン）、ユニバーサル塩基、及び部分的ミスマッチが含まれる。もちろん、そ
のような修飾は望まれない標的配列との二重鎖形成には向かないものと理解され
る。
のポリＡ標的配列で例示される）をもたらす修飾が、ミスマッチとミスプライム
の比率を著しく減少することを示すために、広く意味を有することは当業者にと
って明白なはずである。したがって、オリゴヌクレオチドとその標的配列との間
の水素結合の他のタイプの不安定化も同じ効果を有するかもしれないと考えられ
る。そのような二重鎖形成の不安定化をもたらす、オリゴヌクレオチドの修飾の
非制限的な例には、水素結合を減少又は阻止する修飾が含まれる。非制限的なよ
り具体的な例には、既知の塩基修飾、塩基アナログ（例えば、後述するようにイ
ノシン）、ユニバーサル塩基、及び部分的ミスマッチが含まれる。もちろん、そ
のような修飾は望まれない標的配列との二重鎖形成には向かないものと理解され
る。
【００２４】 本発明に包含されるオリゴヌクレオチドの異なる修飾は、当業者により特定の
使用（ｍＲＮＡ精製、配列決定）のために適合できるものと理解されるはずであ
る。
使用（ｍＲＮＡ精製、配列決定）のために適合できるものと理解されるはずであ
る。
【００２５】 他のユニバーサル塩基も当業者によく知られているため、本発明は、３−ニト
ロピロールによるオリゴヌクレオチド修飾に制限されるべきではない。実際に３
−ニトロピロールに加えて、多くのユニバーサルヌクレオシドが合成され、特徴
付けられている（Millicanら、1984、前述;Inoueら,1985、前述;Fukadaら,1986
、前述;Seelaら,1986、前述;Eritjaら、1986、前述;Habenerら,1988、前述;Lin
ら、1989、前述;Francoisら,1990、前述;Brouwnら,1991、前述）。ユニバーサル
塩基の他の例は、www.Synthegen.com/products/bases.htmlでも見出される。こ
うして、本発明は、ミスマッチテンペレートに対して完全なハイブリダイズのと
きに、区別の増加を可能にする少なくとも１つのユニバーサルヌクレオシドを含
むいかなるホモポリマー伸長部含有オリゴ（例えばオリゴｄ（Ｔ）プライマー）
もカバーする。さらに、ホモポリマー伸長部へ挿入されたイノシンなどの塩基ア
ナログも、標的配列とミスマッチ配列との区別を増加することを証明することは
、本発明が、標的配列に相補する配列中の水素結合を減少又は阻止する少なくと
も１つの修飾された塩基を含むいかなるホモポリマー伸長部含有オリゴもカバー
することを示す。
ロピロールによるオリゴヌクレオチド修飾に制限されるべきではない。実際に３
−ニトロピロールに加えて、多くのユニバーサルヌクレオシドが合成され、特徴
付けられている（Millicanら、1984、前述;Inoueら,1985、前述;Fukadaら,1986
、前述;Seelaら,1986、前述;Eritjaら、1986、前述;Habenerら,1988、前述;Lin
ら、1989、前述;Francoisら,1990、前述;Brouwnら,1991、前述）。ユニバーサル
塩基の他の例は、www.Synthegen.com/products/bases.htmlでも見出される。こ
うして、本発明は、ミスマッチテンペレートに対して完全なハイブリダイズのと
きに、区別の増加を可能にする少なくとも１つのユニバーサルヌクレオシドを含
むいかなるホモポリマー伸長部含有オリゴ（例えばオリゴｄ（Ｔ）プライマー）
もカバーする。さらに、ホモポリマー伸長部へ挿入されたイノシンなどの塩基ア
ナログも、標的配列とミスマッチ配列との区別を増加することを証明することは
、本発明が、標的配列に相補する配列中の水素結合を減少又は阻止する少なくと
も１つの修飾された塩基を含むいかなるホモポリマー伸長部含有オリゴもカバー
することを示す。
【００２６】 この技術の代替的な使用の非制限的な例は、現在用いられているオリゴｄ（Ｔ
）アフィニティマトリックスを、本発明による修飾オリゴｄ（Ｔで）置換するこ
とによる、ｍＲＮＡ精製である。オリゴｄ（Ｔ）・Ｚアフィニティマトリックス
は、内部Ａリッチ伸長部への結合が最小化して精製方法を現在よりも高いストリ
ンジェンシーとすることを除き、同じ仕事を実行することができるであろう。こ
のマトリックスは、例えば、真核生物のｍＲＮＡと汚染マイコプラズマＲＮＡ（
これはＡＴリッチである）との間のよりよい選択を提供することができる。マイ
コプラズマはしばしば組織培養セルラインを汚染するため、真核生物ｍＲＮＡと
マイコプラズマＲＮＡの、オリゴｄ（Ｔ）カラムでの共精製は、マイコプラズマ
クローンで汚染されたｃＤＮＡライブラリーを生産する可能性がある。
）アフィニティマトリックスを、本発明による修飾オリゴｄ（Ｔで）置換するこ
とによる、ｍＲＮＡ精製である。オリゴｄ（Ｔ）・Ｚアフィニティマトリックス
は、内部Ａリッチ伸長部への結合が最小化して精製方法を現在よりも高いストリ
ンジェンシーとすることを除き、同じ仕事を実行することができるであろう。こ
のマトリックスは、例えば、真核生物のｍＲＮＡと汚染マイコプラズマＲＮＡ（
これはＡＴリッチである）との間のよりよい選択を提供することができる。マイ
コプラズマはしばしば組織培養セルラインを汚染するため、真核生物ｍＲＮＡと
マイコプラズマＲＮＡの、オリゴｄ（Ｔ）カラムでの共精製は、マイコプラズマ
クローンで汚染されたｃＤＮＡライブラリーを生産する可能性がある。
【００２７】 しばしば、特定のＲＮＡの配列も調べる必要がある。ＰＣＲと組み合わせた逆
転写酵素（ＲＴ）を用いて、ＲＮＡテンペレート上の与えられた領域を増幅する
ことができる。ＲＴ反応におけるプライマーとしてのオリゴｄ（Ｔ）・Ｚの使用
は、ｍＲＮＡの３'末端が、ｃＤＮＡテンペレート上に表されることを確実にす
るであろう。こうして、本発明も、与えられたクローンの３'末端を得るために
デザインされた現在の３'ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）プロ
トコールに取り込まれることができる。
転写酵素（ＲＴ）を用いて、ＲＮＡテンペレート上の与えられた領域を増幅する
ことができる。ＲＴ反応におけるプライマーとしてのオリゴｄ（Ｔ）・Ｚの使用
は、ｍＲＮＡの３'末端が、ｃＤＮＡテンペレート上に表されることを確実にす
るであろう。こうして、本発明も、与えられたクローンの３'末端を得るために
デザインされた現在の３'ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）プロ
トコールに取り込まれることができる。
【００２８】 いくつかのクローニングプロトコールにおいて、第１の鎖合成の後に、ターミ
ナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、産物のホモポリマー
テーリングが行なわれる。例えば、ｄＧＴＰは、ｃＤＮＡの５'末端におけるＧ'
ｓのホモポリマー伸長部を添加するために用いられることができる。こうして第
２の鎖合成に用いられたＤＮＡポリメラーゼは、５'末端に位置するＧ−伸長部
にアニールしたオリゴｄ（Ｃ）プライマーからのプライムによりこのＧ−伸長部
のを利益を受ける。この方法は、ｃＤＮＡの５'末端の配列を保持する利点を有
し、ｍＲＮＡｓの５'末端を同定するための５'ＲＡＣＥ法にも用いられる（Froh
manら,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8998-9002;Lohら,1989,Science 243:21
7-220）（図５）。しかしながら、このアプローチの１つの欠点は、ｍＲＮＡｓ
の５'非翻訳領域が通常ＧＣリッチであるために、オリゴｄ（Ｃ）は、内部Ｇ−
リッチ領域からミスプライムし、全長より短いｃＤＮＡを生産する可能性がある
ことである。本発明の修飾されたオリゴ又はプライマーを生成させるために、そ
のようなホモポリマー伸長部含有プライマーへのユニバーサルヌクレオシドを取
り込むことは、結合の特異性を増加し、真性の５'末端で終結するｃＤＮＡを生
成するであろうと考えられる。こうして本発明は、さらに、ホモポリマー末端か
らの第２の鎖合成のプライムを含むクローニング方法又はＲＡＣＥプロトコール
に関する。
ナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、産物のホモポリマー
テーリングが行なわれる。例えば、ｄＧＴＰは、ｃＤＮＡの５'末端におけるＧ'
ｓのホモポリマー伸長部を添加するために用いられることができる。こうして第
２の鎖合成に用いられたＤＮＡポリメラーゼは、５'末端に位置するＧ−伸長部
にアニールしたオリゴｄ（Ｃ）プライマーからのプライムによりこのＧ−伸長部
のを利益を受ける。この方法は、ｃＤＮＡの５'末端の配列を保持する利点を有
し、ｍＲＮＡｓの５'末端を同定するための５'ＲＡＣＥ法にも用いられる（Froh
manら,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8998-9002;Lohら,1989,Science 243:21
7-220）（図５）。しかしながら、このアプローチの１つの欠点は、ｍＲＮＡｓ
の５'非翻訳領域が通常ＧＣリッチであるために、オリゴｄ（Ｃ）は、内部Ｇ−
リッチ領域からミスプライムし、全長より短いｃＤＮＡを生産する可能性がある
ことである。本発明の修飾されたオリゴ又はプライマーを生成させるために、そ
のようなホモポリマー伸長部含有プライマーへのユニバーサルヌクレオシドを取
り込むことは、結合の特異性を増加し、真性の５'末端で終結するｃＤＮＡを生
成するであろうと考えられる。こうして本発明は、さらに、ホモポリマー末端か
らの第２の鎖合成のプライムを含むクローニング方法又はＲＡＣＥプロトコール
に関する。
【００２９】 いくつかのＰＣＲプロトコールにおいて、特異的産物又は産物のセット（例え
ばヒトにおけるＡｌｕ反復のＡリッチ伸長部からＤＮＡ合成を開始（prime）す
るためのオリゴｄ（Ｔ）プライマーの使用）を生成させるときに、対象の標的部
位（又はいくつかの標的部位）と増加された区別を達成するために、本発明によ
る修飾されたオリゴヌクレオチドを利用することは望ましいかもしれず、この修
飾オリゴは少なくとも１つのユニバーサルヌクレオシド（又は非特異的二重鎖不
安定化修飾）を含むホモポリマー伸長部を含むものである。これらの産物は、遺
伝子マーカーとして（産物の配列と共に存在する多形を同定することにより）用
いられるために開発することができるため、オリゴｄ（Ｔ）プライマーの特異性
を変えることにより標的化の特異性を変化させることは、最終ＰＣＲ産物のより
不変の表現をもたらすかもしれない。本発明は、こうして、さらに、ＰＣＲ増幅
の間の、ユニバーサルオリゴヌクレオチド又は他の修飾されたオリゴヌクレオチ
ドの使用に関する。
ばヒトにおけるＡｌｕ反復のＡリッチ伸長部からＤＮＡ合成を開始（prime）す
るためのオリゴｄ（Ｔ）プライマーの使用）を生成させるときに、対象の標的部
位（又はいくつかの標的部位）と増加された区別を達成するために、本発明によ
る修飾されたオリゴヌクレオチドを利用することは望ましいかもしれず、この修
飾オリゴは少なくとも１つのユニバーサルヌクレオシド（又は非特異的二重鎖不
安定化修飾）を含むホモポリマー伸長部を含むものである。これらの産物は、遺
伝子マーカーとして（産物の配列と共に存在する多形を同定することにより）用
いられるために開発することができるため、オリゴｄ（Ｔ）プライマーの特異性
を変えることにより標的化の特異性を変化させることは、最終ＰＣＲ産物のより
不変の表現をもたらすかもしれない。本発明は、こうして、さらに、ＰＣＲ増幅
の間の、ユニバーサルオリゴヌクレオチド又は他の修飾されたオリゴヌクレオチ
ドの使用に関する。
【００３０】 定義 ヌクレオチド配列は、ここで、左から右への５'から３'方向の一本鎖として、
この技術分野で通常用いられ、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Biochemical Nomenclature
Commissionの推奨による１文字ヌクレオチド文字を用いて、示される。
この技術分野で通常用いられ、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Biochemical Nomenclature
Commissionの推奨による１文字ヌクレオチド文字を用いて、示される。
【００３１】 他に定義しない限り、ここで用いられる科学的技術的用語及び命名は、この発
明の関連分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。一般的に
、細胞培養、感染、分子生物学方法等の方法はこの分野で用いられる一般的な方
法である。そのような標準的技術は、例えばSambrookら（1989, Molecular Clon
ing-A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories）及びAusubelら
（1994,Current Protocols in Molucular Biology, Wiley, New York）などの参
照マニュアルに見出される。
明の関連分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。一般的に
、細胞培養、感染、分子生物学方法等の方法はこの分野で用いられる一般的な方
法である。そのような標準的技術は、例えばSambrookら（1989, Molecular Clon
ing-A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories）及びAusubelら
（1994,Current Protocols in Molucular Biology, Wiley, New York）などの参
照マニュアルに見出される。
【００３２】 本明細書は、多くの日常的に用いられる組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術用語を
参照する。それでも、そのようなｒＤＮＡ用語の選択された例の定義は、明確か
つ一貫して提供される。明らかに、本発明は一般的な核酸の利用を見出したもの
と強調しておく。本発明の教示にしたがって用いることができる核酸の非制限的
な例は、動物細胞、植物細胞などの真核生物からのもの、又は微生物からのもの
、原核生物からのものが含まれる。
参照する。それでも、そのようなｒＤＮＡ用語の選択された例の定義は、明確か
つ一貫して提供される。明らかに、本発明は一般的な核酸の利用を見出したもの
と強調しておく。本発明の教示にしたがって用いることができる核酸の非制限的
な例は、動物細胞、植物細胞などの真核生物からのもの、又は微生物からのもの
、原核生物からのものが含まれる。
【００３３】 ここで用いられているとき、“ホモポリマー配列”なる用語は、単一タイプの
ヌクレオチド塩基（アデノシンＡ；シトシンＣ；グアニンＧ；チミンＴ；ウラシ
ルＵ）又はあまり一般的でない塩基（非制限的な例には、イノシン、Ｉ；及びシ
ュードウリジン、Ψが含まれる）からなる配列を意味する。
ヌクレオチド塩基（アデノシンＡ；シトシンＣ；グアニンＧ；チミンＴ；ウラシ
ルＵ）又はあまり一般的でない塩基（非制限的な例には、イノシン、Ｉ；及びシ
ュードウリジン、Ψが含まれる）からなる配列を意味する。
【００３４】 ここで用いられるとき、“核酸分子”“核酸配列”又は“配列”はヌクレオチ
ドのポリマーを意味する。それらの非制限的な例は、ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮ
Ａ、ｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）を含む。クローニング技術に
より核酸分子が得られるか、又は合成されることができる。ＤＮＡは二本鎖又は
一本鎖であることができる（コード鎖あるいは非コード鎖（アンチセンス））。
ドのポリマーを意味する。それらの非制限的な例は、ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮ
Ａ、ｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）を含む。クローニング技術に
より核酸分子が得られるか、又は合成されることができる。ＤＮＡは二本鎖又は
一本鎖であることができる（コード鎖あるいは非コード鎖（アンチセンス））。
【００３５】 この分野で知られている“組換えＤＮＡ”なる用語は、ＤＮＡセグメントの結
合から得られるＤＮＡ分子を意味する。これはしばしば遺伝子工学を意味する。
合から得られるＤＮＡ分子を意味する。これはしばしば遺伝子工学を意味する。
【００３６】 用語“増幅対”は、ここでは、多くのタイプの増幅プロセスのうちの１つ、好
ましくはポリメラーゼ連鎖反応により、選択された核酸配列の増幅において、合
わせて用いられるために選択される、本発明のオリゴヌクレオチド（オリゴ）の
対を意味する。他のタイプの増幅プロセスは、下記に詳しく述べるように、リガ
ーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、又は核酸配列に基づく増幅を含む。この分野で良く
知られているように、オリゴヌクレオチドは、選択された条件において、相補配
列に結合するように、設計される。
ましくはポリメラーゼ連鎖反応により、選択された核酸配列の増幅において、合
わせて用いられるために選択される、本発明のオリゴヌクレオチド（オリゴ）の
対を意味する。他のタイプの増幅プロセスは、下記に詳しく述べるように、リガ
ーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、又は核酸配列に基づく増幅を含む。この分野で良く
知られているように、オリゴヌクレオチドは、選択された条件において、相補配
列に結合するように、設計される。
【００３７】 本発明を実施するための核酸（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）は、よく知られた方
法により得ることができる。
法により得ることができる。
【００３８】 “オリゴヌクレオチド”又は“オリゴ”又は“プライマー”はヌクレオチド（
リボ又はデオキシリボヌクレオチド）からなる核酸分子を定義する。本発明のオ
リゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、用いられる特定のアッセイフォー
マット及び特定の必要性及び標的ゲノムにより、いかなる適当な長さでも良い。
一般的に、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、少なくとも１０ヌク
レオチドの長さであり、好ましくは５０未満のヌクレオチドである。好ましくは
オリゴ又はプライマーは、１５から４０ヌクレオチドの長さ、より好ましくは２
０〜３０ヌクレオチドの長さを有する。もちろん本発明のプローブ又はプライマ
ーは、選ばれた核酸増幅システムに特に適するように適合させることができる。
この分野で一般的に知られているように、オリゴヌクレオチドプローブ及びプラ
イマーは、その標的配列とのハイブリダイゼーションの融点を考慮して、設計さ
れることができる（下記及びSambrookら、1989, Molecular Cloning - A labora
tory Manual, 2nd Edition，CSH Laboratories；及びAusubelら、1989,Current
Protocols in Molucular Biology, John Wiley & Sons Inc. N.Y.参照）。オリ
ゴヌクレオチドのサイズは、特定の状況により最終的にその特定の使用において
指図され、当業者により適合される。オリゴヌクレオチドは、化学合成され、良
く知られた方法によりクローニングされることができる。例えば、当業者は、必
須のホモポリマー伸長部含有オリゴ（本発明の教示にしたがってホモポリマー伸
長部が修飾されている標的化する伸長部）の長さを、特定の必要性に、標的化伸
長部と、二重鎖配列、アッセイの条件（したがってＴｍの条件）及び必須ホモポ
リマー伸長部に隣接する（その５'及び/又は３'末端において）付加的配列の存
在等のその他のパラメーターの機能として適合させることができるであろう。
リボ又はデオキシリボヌクレオチド）からなる核酸分子を定義する。本発明のオ
リゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、用いられる特定のアッセイフォー
マット及び特定の必要性及び標的ゲノムにより、いかなる適当な長さでも良い。
一般的に、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、少なくとも１０ヌク
レオチドの長さであり、好ましくは５０未満のヌクレオチドである。好ましくは
オリゴ又はプライマーは、１５から４０ヌクレオチドの長さ、より好ましくは２
０〜３０ヌクレオチドの長さを有する。もちろん本発明のプローブ又はプライマ
ーは、選ばれた核酸増幅システムに特に適するように適合させることができる。
この分野で一般的に知られているように、オリゴヌクレオチドプローブ及びプラ
イマーは、その標的配列とのハイブリダイゼーションの融点を考慮して、設計さ
れることができる（下記及びSambrookら、1989, Molecular Cloning - A labora
tory Manual, 2nd Edition，CSH Laboratories；及びAusubelら、1989,Current
Protocols in Molucular Biology, John Wiley & Sons Inc. N.Y.参照）。オリ
ゴヌクレオチドのサイズは、特定の状況により最終的にその特定の使用において
指図され、当業者により適合される。オリゴヌクレオチドは、化学合成され、良
く知られた方法によりクローニングされることができる。例えば、当業者は、必
須のホモポリマー伸長部含有オリゴ（本発明の教示にしたがってホモポリマー伸
長部が修飾されている標的化する伸長部）の長さを、特定の必要性に、標的化伸
長部と、二重鎖配列、アッセイの条件（したがってＴｍの条件）及び必須ホモポ
リマー伸長部に隣接する（その５'及び/又は３'末端において）付加的配列の存
在等のその他のパラメーターの機能として適合させることができるであろう。
【００３９】 用語“オリゴヌクレオチド”又は“ＤＮＡ”分子又は配列は、ここで定義され
るときは、二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドアデニン（Ａ）、グアニン（
Ｇ）、チミン（Ｔ）、及び／又はシトシン（Ｃ）からなる分子を意味し、本発明
による“制御要素”を含む。用語“オリゴヌクレオチド”又は“ＤＮＡ”は、直
鎖ＤＮＡ分子又は断片、ウィルス、プラスミド、ベクター、染色体又は合成由来
ＤＮＡに見出すことができる。ここで用いられるとき、特定の二本鎖ＤＮＡ配列
は、５'から３'方向の配列だけを与える通常の協定にしたがって記載されること
ができる。
るときは、二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドアデニン（Ａ）、グアニン（
Ｇ）、チミン（Ｔ）、及び／又はシトシン（Ｃ）からなる分子を意味し、本発明
による“制御要素”を含む。用語“オリゴヌクレオチド”又は“ＤＮＡ”は、直
鎖ＤＮＡ分子又は断片、ウィルス、プラスミド、ベクター、染色体又は合成由来
ＤＮＡに見出すことができる。ここで用いられるとき、特定の二本鎖ＤＮＡ配列
は、５'から３'方向の配列だけを与える通常の協定にしたがって記載されること
ができる。
【００４０】 本発明のプローブ及びオリゴヌクレオチドは、自然発生の糖リン酸塩バックボ
ーンでも、あるいはホスホロチオエート、ジチオネート、アルキルホスホネート
、及びα‐ヌクレオチドなどの修飾されるバックボーンでも、利用されることが
できる。修飾される糖‐リン酸塩バックボーンは一般的には、Miller,1988,Ann.
Reports Med.Chem.23:295及びMoranら,1987,Nucleic acid molecule. Acids Res
.,14:5019に教示される。本発明のプローブは、リボ核酸（ＲＮＡ）でもデオキ
シリボ核酸（ＤＮＡ）でも構築されることができるが、好ましくはＤＮＡである
。オリゴヌクレオチドの合成についての一般的な教示と、その置換及び修飾は、
例えば米国特許第５，４３８，１３１号に見出される。オリゴヌクレオチドの、
及び適当な修飾及び用いられる置換の、最も適した合成経路の選択は、本発明の
関連分野の当業者により選択される。
ーンでも、あるいはホスホロチオエート、ジチオネート、アルキルホスホネート
、及びα‐ヌクレオチドなどの修飾されるバックボーンでも、利用されることが
できる。修飾される糖‐リン酸塩バックボーンは一般的には、Miller,1988,Ann.
Reports Med.Chem.23:295及びMoranら,1987,Nucleic acid molecule. Acids Res
.,14:5019に教示される。本発明のプローブは、リボ核酸（ＲＮＡ）でもデオキ
シリボ核酸（ＤＮＡ）でも構築されることができるが、好ましくはＤＮＡである
。オリゴヌクレオチドの合成についての一般的な教示と、その置換及び修飾は、
例えば米国特許第５，４３８，１３１号に見出される。オリゴヌクレオチドの、
及び適当な修飾及び用いられる置換の、最も適した合成経路の選択は、本発明の
関連分野の当業者により選択される。
【００４１】 本発明の修飾されたオリゴヌクレオチドは、化学合成され、又は組換えＤＮＡ
技術により生産されることができる。すべてのこれらの方法は、この分野でよく
知られている。本発明によれば、修飾されたオリゴヌクレオチドは、単一のタイ
プのヌクレオチドからなる必須のホモポリマー伸長部又は配列と、ミスマッチを
不安定化できる少なくとも１つのタイプの修飾を含む分子である。好ましい実施
態様において、これらの修飾されたオリゴヌクレオチドは、単一のタイプのヌク
レオチド（リボ又はデオキシリボヌクレオチド、Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ又はＵ）からな
るからなり、少なくとも１つのユニバーサルヌクレオシドを含む分子である。上
述したように、長さは１０から５０ヌクレオチドである。もちろん、ミスマッチ
を不安定化する１つを超えた修飾又はヌクレオチドが用いられる場合、同じタイ
プの“修飾”である必要はないことが認識されるべきである。本発明のいくつか
の実施態様において、本発明の修飾されたオリゴヌクレオチドは、必須のホモポ
リマー伸長部と“３'ロック”（下記参照）又は制限部位を創出できる配列を含
む。
技術により生産されることができる。すべてのこれらの方法は、この分野でよく
知られている。本発明によれば、修飾されたオリゴヌクレオチドは、単一のタイ
プのヌクレオチドからなる必須のホモポリマー伸長部又は配列と、ミスマッチを
不安定化できる少なくとも１つのタイプの修飾を含む分子である。好ましい実施
態様において、これらの修飾されたオリゴヌクレオチドは、単一のタイプのヌク
レオチド（リボ又はデオキシリボヌクレオチド、Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ又はＵ）からな
るからなり、少なくとも１つのユニバーサルヌクレオシドを含む分子である。上
述したように、長さは１０から５０ヌクレオチドである。もちろん、ミスマッチ
を不安定化する１つを超えた修飾又はヌクレオチドが用いられる場合、同じタイ
プの“修飾”である必要はないことが認識されるべきである。本発明のいくつか
の実施態様において、本発明の修飾されたオリゴヌクレオチドは、必須のホモポ
リマー伸長部と“３'ロック”（下記参照）又は制限部位を創出できる配列を含
む。
【００４２】 ここで用いられるとき、“プライマー”は、標的配列にアニールすることがで
き、適当な条件下においてＤＮＡ合成のための開始点として機能することができ
る二本鎖領域又は二重鎖を創出できるオリゴヌクレオチドを定義する。
き、適当な条件下においてＤＮＡ合成のための開始点として機能することができ
る二本鎖領域又は二重鎖を創出できるオリゴヌクレオチドを定義する。
【００４３】 “核酸ハイブリダイゼーション”は、一般的に、適当な条件下で熱力学的に有
利な二本鎖構造を形成することになる、相補塩基配列を有する２つの一本鎖核酸
分子のハイブリダイゼーションを意味する。ハイブリダイゼーション条件の例は
、前述の２つの研究室マニュアル（Sambrookら,1989,前述及びAusubelら,1989,
前述）に見出され、その分野で広く知られている。例えばサザンブロッティング
法においてよく知られているような、ニトロセルロースフィルターへのハイブリ
ダイゼーションの場合、ニトロセルロースフィルターは、５０％ホルムアミド、
高濃度塩（５×ＳＳＣ又は５×ＳＳＰＥ）、５×Denhardt's溶液、１％ＳＤＳ、
及び１００μｇ/ｍｌ変性キャリアＤＮＡ（例えばサケ精子ＤＮＡ）を含む溶液
中で、一晩６５℃で標識化プローブとインキュベートすることができる。非特異
的結合プローブは、ついで、所望のストリンジェンシーに照らして選択された温
度；室温（低ストリンジェンシー）、４２℃（中ストリンジェンシー）、又は６
５℃（高ストリンジェンシー）における、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでの
数回の洗浄によりフィルターから洗い落とすことができる。選択された温度は、
ＤＮＡハイブリッドの融点温度（Ｔｍ）に基づくものである。勿論、ＲＮＡ−Ｄ
ＮＡハイブリッドも、形成され検出されることができる。そのような場合、ハイ
ブリダイゼーションと洗浄の条件は、当業者によく知られた方法で適合されるこ
とができる。ストリンジェント条件は、好ましく用いられるであろう（Sambrook
ら、1989、前述）。
利な二本鎖構造を形成することになる、相補塩基配列を有する２つの一本鎖核酸
分子のハイブリダイゼーションを意味する。ハイブリダイゼーション条件の例は
、前述の２つの研究室マニュアル（Sambrookら,1989,前述及びAusubelら,1989,
前述）に見出され、その分野で広く知られている。例えばサザンブロッティング
法においてよく知られているような、ニトロセルロースフィルターへのハイブリ
ダイゼーションの場合、ニトロセルロースフィルターは、５０％ホルムアミド、
高濃度塩（５×ＳＳＣ又は５×ＳＳＰＥ）、５×Denhardt's溶液、１％ＳＤＳ、
及び１００μｇ/ｍｌ変性キャリアＤＮＡ（例えばサケ精子ＤＮＡ）を含む溶液
中で、一晩６５℃で標識化プローブとインキュベートすることができる。非特異
的結合プローブは、ついで、所望のストリンジェンシーに照らして選択された温
度；室温（低ストリンジェンシー）、４２℃（中ストリンジェンシー）、又は６
５℃（高ストリンジェンシー）における、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでの
数回の洗浄によりフィルターから洗い落とすことができる。選択された温度は、
ＤＮＡハイブリッドの融点温度（Ｔｍ）に基づくものである。勿論、ＲＮＡ−Ｄ
ＮＡハイブリッドも、形成され検出されることができる。そのような場合、ハイ
ブリダイゼーションと洗浄の条件は、当業者によく知られた方法で適合されるこ
とができる。ストリンジェント条件は、好ましく用いられるであろう（Sambrook
ら、1989、前述）。
【００４４】 プローブが用いられることができる検出方法のタイプは、サザンブロット（Ｄ
ＮＡ検出）、ドット又はスロットブロット（ＤＮＡ、ＲＮＡ）及びノザンブロッ
ト（ＲＮＡ検出）を含む。
ＮＡ検出）、ドット又はスロットブロット（ＤＮＡ、ＲＮＡ）及びノザンブロッ
ト（ＲＮＡ検出）を含む。
【００４５】 プローブ又はオリゴヌクレオチドは、多くのよく知られた方法（Sambrookら、
1989、前述）にしたがって、標識化されることができる。標識の非制限的例は、 3 Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、及び35Ｓを含む。検出可能なマーカーの非制限的例には、リ
ガンド、蛍光体、化学発光剤、酵素及び抗体が含まれる。本発明の方法の感度を
増加することができる、プローブと用いられる他の検出可能なマーカーには、ビ
オチン及び放射性ヌクレオチドが含まれる。特定の標識を選択することが、プロ
ーブに結合する方法を決めることは、当業者には明白であろう。
1989、前述）にしたがって、標識化されることができる。標識の非制限的例は、 3 Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、及び35Ｓを含む。検出可能なマーカーの非制限的例には、リ
ガンド、蛍光体、化学発光剤、酵素及び抗体が含まれる。本発明の方法の感度を
増加することができる、プローブと用いられる他の検出可能なマーカーには、ビ
オチン及び放射性ヌクレオチドが含まれる。特定の標識を選択することが、プロ
ーブに結合する方法を決めることは、当業者には明白であろう。
【００４６】 一般に知られているように、放射活性ヌクレオチドは、いくつかの方法により
本発明のプローブ中に取り込まれることができる。その非制限的な例には、γ32 Ｐ ＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼを用いた、放射性ｄＮＴＰ（例えばラン
ダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いて低融点ゲルで均一に標識されたＤＮ
Ａプローブ）存在下で大腸菌のPol I Klenowフラグメント又は逆転写酵素を用い
た、１つ以上の放射性ＮＴＰの存在下でＤＮＡセグメントを転写するためにＳＰ
６／Ｔ７システムを用いた、等の、プローブの５'末端のキナージング（kinasin
g）が含まれる。
本発明のプローブ中に取り込まれることができる。その非制限的な例には、γ32 Ｐ ＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼを用いた、放射性ｄＮＴＰ（例えばラン
ダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いて低融点ゲルで均一に標識されたＤＮ
Ａプローブ）存在下で大腸菌のPol I Klenowフラグメント又は逆転写酵素を用い
た、１つ以上の放射性ＮＴＰの存在下でＤＮＡセグメントを転写するためにＳＰ
６／Ｔ７システムを用いた、等の、プローブの５'末端のキナージング（kinasin
g）が含まれる。
【００４７】 選択された、又は標識の核酸配列の増幅は、多くの適当な方法により行なうこ
とができる。一般的に、Kwohら、1990,Am.Biotechnol.Lab.8:14-25参照。多くの
増幅技術が記載されており、容易に、当業者の特定の必要性に合うように適合さ
れることができる。増幅技術のの非制限的な例には、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写ベースの増
幅、ＱＢレプリカーゼシステム及びＮＡＳＢＡ（Kwohら,1989,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 86,1173-1177;Lizardiら、1988,Bio Technology 6:1197-1202;Malekら,1
994,Methods Mol.Biol.,28:253-260;及びSambrookら、1989,前述）が含まれる。
好ましくは、増幅はＰＣＲを用いて行なわれるであろう。
とができる。一般的に、Kwohら、1990,Am.Biotechnol.Lab.8:14-25参照。多くの
増幅技術が記載されており、容易に、当業者の特定の必要性に合うように適合さ
れることができる。増幅技術のの非制限的な例には、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写ベースの増
幅、ＱＢレプリカーゼシステム及びＮＡＳＢＡ（Kwohら,1989,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 86,1173-1177;Lizardiら、1988,Bio Technology 6:1197-1202;Malekら,1
994,Methods Mol.Biol.,28:253-260;及びSambrookら、1989,前述）が含まれる。
好ましくは、増幅はＰＣＲを用いて行なわれるであろう。
【００４８】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はよく知られている技術にしたがって行なわ
れる。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第
４，８００，１５９号及び第４，９６５，１８８号（これらの３つの特許全ての
開示はここに参照として取り込まれる）参照。一般的に、ＰＣＲは、適当なハイ
ブリダイゼーション条件下で、検出される特異的配列の各鎖について１つのオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いて、核酸試料の処理（例えば、熱安定ＤＮＡポ
リメラーゼの存在下）を含む。合成される各プライマーの伸長物は、それにハイ
ブリダイズする特異的配列の各鎖に十分に相補するプライマーと共に、２つの核
酸鎖の各々に相補する。各プライマーから合成された伸長物は、また、同じプラ
イマーを用いた延長物のさらなる合成のテンペレートとして機能する。伸長物の
合成の十分な数のラウンドの後、試料は、検出される配列が存在するかどうかを
評価するために分析される。増幅された配列の検出は、ゲル電気泳動、ＤＮＡの
ＥｔＢｒ染色の後、可視化して、あるいは周知の技術による検出可能な標識を用
いて、などにより行なうことができる。ＰＣＲ技術のレビューのために、PCR Pr
otocols, A Guide to Methods and Amplifications, Michaelら編、Acad.Press,
1990参照。
れる。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第
４，８００，１５９号及び第４，９６５，１８８号（これらの３つの特許全ての
開示はここに参照として取り込まれる）参照。一般的に、ＰＣＲは、適当なハイ
ブリダイゼーション条件下で、検出される特異的配列の各鎖について１つのオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いて、核酸試料の処理（例えば、熱安定ＤＮＡポ
リメラーゼの存在下）を含む。合成される各プライマーの伸長物は、それにハイ
ブリダイズする特異的配列の各鎖に十分に相補するプライマーと共に、２つの核
酸鎖の各々に相補する。各プライマーから合成された伸長物は、また、同じプラ
イマーを用いた延長物のさらなる合成のテンペレートとして機能する。伸長物の
合成の十分な数のラウンドの後、試料は、検出される配列が存在するかどうかを
評価するために分析される。増幅された配列の検出は、ゲル電気泳動、ＤＮＡの
ＥｔＢｒ染色の後、可視化して、あるいは周知の技術による検出可能な標識を用
いて、などにより行なうことができる。ＰＣＲ技術のレビューのために、PCR Pr
otocols, A Guide to Methods and Amplifications, Michaelら編、Acad.Press,
1990参照。
【００４９】 リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、周知の技術（Weiss,1991,Science 254:1292
）に従って行なわれる。所望の必要性に合わせるためのプロトコールの適合は、
当業者により行なうことができる。鎖置換増幅（ＳＤＡ）も、周知の技術により
、又は特定の必要性に合わせるために適合させて、当業者により行なうことがで
きる（Walkerら,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:392-396;及びibid.,1992,Nuc
leic Acids Res. 20:1691-1696）。
）に従って行なわれる。所望の必要性に合わせるためのプロトコールの適合は、
当業者により行なうことができる。鎖置換増幅（ＳＤＡ）も、周知の技術により
、又は特定の必要性に合わせるために適合させて、当業者により行なうことがで
きる（Walkerら,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:392-396;及びibid.,1992,Nuc
leic Acids Res. 20:1691-1696）。
【００５０】 ここで用いられるとき、“遺伝子”という用語は、当業者で良く知られており
、単一のタンパク質又はポリペプチドを定義する核酸配列に関する。“構造遺伝
子”は、ＲＮＡに転写され、特異的アミノ酸配列を有するタンパク質に翻訳され
、これにより特異的ポリペプチド又はタンパク質を与えるＤＮＡ配列を定義する
。本発明の核酸配列が、この分野でよく知られている確立された多くのキットフ
ォーマットのうちの１つに取り込まれ得ることは、当業者により容易に理解され
るであろう。
、単一のタンパク質又はポリペプチドを定義する核酸配列に関する。“構造遺伝
子”は、ＲＮＡに転写され、特異的アミノ酸配列を有するタンパク質に翻訳され
、これにより特異的ポリペプチド又はタンパク質を与えるＤＮＡ配列を定義する
。本発明の核酸配列が、この分野でよく知られている確立された多くのキットフ
ォーマットのうちの１つに取り込まれ得ることは、当業者により容易に理解され
るであろう。
【００５１】 “ベクター”という用語は、その分野で一般的に知られており、本発明のＤＮ
Ａがその中にクローン化されるＤＮＡビヒクルとして機能する、プラスミドＤＮ
Ａ、ファージＤＮＡ、ウィルスＤＮＡなどを定義する。多くのタイプのベクター
が存在し、この分野でよく知られている。
Ａがその中にクローン化されるＤＮＡビヒクルとして機能する、プラスミドＤＮ
Ａ、ファージＤＮＡ、ウィルスＤＮＡなどを定義する。多くのタイプのベクター
が存在し、この分野でよく知られている。
【００５２】 “対立遺伝子”という用語は、染色体の与えられたローカスを占める遺伝子の
別の形態を定義する。
別の形態を定義する。
【００５３】 一般的に知られているように、“変異”とは、娘細胞に伝達し得る遺伝子材料
における検出可能な変化である。よく知られている様に、変異は、例えば、１つ
以上のデオキシリボヌクレオチドの検出可能な変化であり得る。例えば、ヌクレ
オチドは付加され、削除され、置換され、転換され、新しい位置にトランスポー
ズされ得る。自然発生変異及び経験的に誘導された変異が存在する。核酸分子の
変異の結果は変異核酸分子である。変異ポリペプチドは、この変異核酸分子から
コードされ得る。
における検出可能な変化である。よく知られている様に、変異は、例えば、１つ
以上のデオキシリボヌクレオチドの検出可能な変化であり得る。例えば、ヌクレ
オチドは付加され、削除され、置換され、転換され、新しい位置にトランスポー
ズされ得る。自然発生変異及び経験的に誘導された変異が存在する。核酸分子の
変異の結果は変異核酸分子である。変異ポリペプチドは、この変異核酸分子から
コードされ得る。
【００５４】 ここで用いられるとき、“精製”なる用語は、細胞成分から分離された分子を
意味する。例えば、“精製タンパク質”は、自然では見出せないレベルまで精製
されている。“実質的に純粋な”分子は、大部分の他の細胞成分を含まない分子
である。
意味する。例えば、“精製タンパク質”は、自然では見出せないレベルまで精製
されている。“実質的に純粋な”分子は、大部分の他の細胞成分を含まない分子
である。
【００５５】 本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを含むキットに関する
。例えば、本発明による分画されたキットは、分離された容器に試薬が含まれる
いかなるキットも含む。そのような容器は、小ガラス容器、プラスチック容器又
はプラスチック片又は紙片を含む。そのような容器は、試料と試薬がクロス汚染
されないように、及び１つの区画から他の区画へ定量的に試薬又は溶液は添加で
きるように、１つの区画から他の区画への効率的な試薬の移動を可能にする。そ
のような容器は、試験試料（ＤＮＡ、ＲＮＡ又は細胞）を受け入れるであろう容
器、アッセイに用いられるプライマーを含む容器、酵素を含む容器、洗浄試薬を
含む容器、伸長物の検出又は分離に用いられる試薬を含む容器、を含むことがで
きるであろう。
。例えば、本発明による分画されたキットは、分離された容器に試薬が含まれる
いかなるキットも含む。そのような容器は、小ガラス容器、プラスチック容器又
はプラスチック片又は紙片を含む。そのような容器は、試料と試薬がクロス汚染
されないように、及び１つの区画から他の区画へ定量的に試薬又は溶液は添加で
きるように、１つの区画から他の区画への効率的な試薬の移動を可能にする。そ
のような容器は、試験試料（ＤＮＡ、ＲＮＡ又は細胞）を受け入れるであろう容
器、アッセイに用いられるプライマーを含む容器、酵素を含む容器、洗浄試薬を
含む容器、伸長物の検出又は分離に用いられる試薬を含む容器、を含むことがで
きるであろう。
【００５６】 もちろん、ｃＤＮＡクローニングキットは、本発明のプライマーの挿入により
適合されるであろう。
適合されるであろう。
【００５７】 このように一般的に本発明について記載したが、図面を参照しながら、好まし
い実施態様を示す。
い実施態様を示す。
【００５８】 本発明の他の目的、利点及び特徴は、以下の、好ましい実施態様の、図面の参
照を伴う非制限的記載により、より明白となるであろう。これらは例示的であり
、本発明の範囲を制限するものと解釈されてはならない。
照を伴う非制限的記載により、より明白となるであろう。これらは例示的であり
、本発明の範囲を制限するものと解釈されてはならない。
【００５９】
非特異的又は人為的二重鎖形成の不安定化効果とミスマッチ及び/又はミスプ
ライムに対するその共同効果の実証は、１又は２のユニバーサルアナログで修飾
されたオリゴｄ（Ｔ）プライマーを用いてなされた。そのような導入が、そのプ
ライマー（すなわちｍＲＮＡの３'ポリ（Ａ）末端）の完全にマッチする標的と
、不完全にマッチする配列（内部Ａリッチ伸長部）との間の区別の増加をもたら
すか否かを分析した。
ライムに対するその共同効果の実証は、１又は２のユニバーサルアナログで修飾
されたオリゴｄ（Ｔ）プライマーを用いてなされた。そのような導入が、そのプ
ライマー（すなわちｍＲＮＡの３'ポリ（Ａ）末端）の完全にマッチする標的と
、不完全にマッチする配列（内部Ａリッチ伸長部）との間の区別の増加をもたら
すか否かを分析した。
【００６０】 より具体的には、オリゴｄ（Ｔ）・Ｚと呼ばれるオリゴｄ（Ｔ）プライマーが
生成され、その中では２つのチミン塩基が３−ニトロピロールにより置換されて
いた（図２Ｃ）。３−ニトロピロールについての一般的な教示、その合成などは
、例えば米国特許第５，４３８，１３１号に見出される。
生成され、その中では２つのチミン塩基が３−ニトロピロールにより置換されて
いた（図２Ｃ）。３−ニトロピロールについての一般的な教示、その合成などは
、例えば米国特許第５，４３８，１３１号に見出される。
【００６１】 このプライマーが、内部Ａリッチ配列からのミスプライムを減少させることが
できるかどうかを試験するために（図２Ｄ）、elF-4GIIからのｃＤＮＡクローン
、真核生物翻訳因子、を取得した。この遺伝子に対するｃＤＮＡクローンが最初
に単離されたときに、５クローンの１つだけが、正しい３'末端を有していた。
これらのクローンの配列の特徴づけは、すべての先端を欠いたクローンが、４つ
の異なる部位におけるオリゴｄ（Ｔ）による内部プライミングの結果であること
を示した（図３Ａにおいて左向きの矢印で示される）。このクローンから生成さ
れたインビトロ転写されたＲＮＡは、ミスプライムの数を減少させるための置換
されたオリゴｄ（Ｔ）の３−ニトロピロールの能力を決定するためのこうして優
れた試験試薬として機能する。インビトロ転写されたＲＮＡの質は、図３Ｂに示
され、試験テンペレートがインタクトであることを示している。このＲＮＡはつ
いでオリゴｄ（Ｔ）又はオリゴｄ（Ｔ）・Ｚとアニールし、ＭＭＬＶ ＲＴを用
いて逆転写を行なった。図３Ｃに示すように、このテンペレートにおけるオリゴ
ｄ（Ｔ）の使用は、内部プライミングの結果生成された全長産物より短い（＞９
５％）ものをもたらした（図３Ｃ、レーン１）。しかしながら、同じテンペレー
トにおけるオリゴｄ（Ｔ）・Ｚのプライマーとしての使用は、大部分（＞９５％
）の産物が全長である結果をもたらした（図３Ｃ、レーン２）。
できるかどうかを試験するために（図２Ｄ）、elF-4GIIからのｃＤＮＡクローン
、真核生物翻訳因子、を取得した。この遺伝子に対するｃＤＮＡクローンが最初
に単離されたときに、５クローンの１つだけが、正しい３'末端を有していた。
これらのクローンの配列の特徴づけは、すべての先端を欠いたクローンが、４つ
の異なる部位におけるオリゴｄ（Ｔ）による内部プライミングの結果であること
を示した（図３Ａにおいて左向きの矢印で示される）。このクローンから生成さ
れたインビトロ転写されたＲＮＡは、ミスプライムの数を減少させるための置換
されたオリゴｄ（Ｔ）の３−ニトロピロールの能力を決定するためのこうして優
れた試験試薬として機能する。インビトロ転写されたＲＮＡの質は、図３Ｂに示
され、試験テンペレートがインタクトであることを示している。このＲＮＡはつ
いでオリゴｄ（Ｔ）又はオリゴｄ（Ｔ）・Ｚとアニールし、ＭＭＬＶ ＲＴを用
いて逆転写を行なった。図３Ｃに示すように、このテンペレートにおけるオリゴ
ｄ（Ｔ）の使用は、内部プライミングの結果生成された全長産物より短い（＞９
５％）ものをもたらした（図３Ｃ、レーン１）。しかしながら、同じテンペレー
トにおけるオリゴｄ（Ｔ）・Ｚのプライマーとしての使用は、大部分（＞９５％
）の産物が全長である結果をもたらした（図３Ｃ、レーン２）。
【００６２】 これらの結果は、逆転写反応におけるオリゴｄ（Ｔ）・Ｚの使用が、３'ポリ
（Ａ）末端に対する特異性を著しく改善することを示し、非特異性二重鎖形成を
不安定化することにおける、特に全長のｃＤＮＡｓを生成させるためのこの方法
の有用性を示す。
（Ａ）末端に対する特異性を著しく改善することを示し、非特異性二重鎖形成を
不安定化することにおける、特に全長のｃＤＮＡｓを生成させるためのこの方法
の有用性を示す。
【００６３】 対照eIF-4GIIテンペレートにおけるオリゴｄ（Ｔ）を用いたミスプライムの部
位を同定した（図４）。これは、アルカリアガロースゲルにおいてオリゴｄ（Ｔ
）又はオリゴｄ（Ｔ）・Ｚのいずれかを用いてなされたＲＴ反応の産物の分画と
、その後のナイロン膜への移動によりなされた。この膜はついで、eIF-4GIIの３
'非翻訳領域の標的の種々の領域について設計されたオリゴヌクレオチドを用い
たハイブリダイゼーションによりプローブした（オリゴヌクレオチドは標識化さ
れている。図４Ａのa,b,c,d,及びe）。図４Ｂに示すように、オリゴｄ（Ｔ）及
びオリゴｄ（Ｔ）・Ｚの両方がプライマーとして用いられたときに、オリゴヌク
レオチド“a”とのハイブリダイゼーションは、正しく開始されたｃＤＮＡを検
出した。オリゴヌクレオチドｂとｃとのハイブリダイゼーションは、ＲＴ反応が
オリゴｄ（Ｔ）で開始されたとき、新規の先端を欠いた産物を検出し、このプラ
イマーでの内部Ａリッチ伸長部からのミスプライムを示した（図４Ｂ）。オリゴ
ヌクレオチドｄとｅとのハイブリダイゼーションは、ＲＴ反応をオリゴｄ（Ｔ）
で開始したときに、付加的な新規のより多くの先端を欠いた産物を検出し（図４
Ｂにおいて矢印の頭で示される）、オリゴｄ（Ｔ）・Ｚを用いずにこのプライマ
ーを用いた第２の内部Ａリッチ伸長部からのミスプライムを示す（図４Ｂ）。
位を同定した（図４）。これは、アルカリアガロースゲルにおいてオリゴｄ（Ｔ
）又はオリゴｄ（Ｔ）・Ｚのいずれかを用いてなされたＲＴ反応の産物の分画と
、その後のナイロン膜への移動によりなされた。この膜はついで、eIF-4GIIの３
'非翻訳領域の標的の種々の領域について設計されたオリゴヌクレオチドを用い
たハイブリダイゼーションによりプローブした（オリゴヌクレオチドは標識化さ
れている。図４Ａのa,b,c,d,及びe）。図４Ｂに示すように、オリゴｄ（Ｔ）及
びオリゴｄ（Ｔ）・Ｚの両方がプライマーとして用いられたときに、オリゴヌク
レオチド“a”とのハイブリダイゼーションは、正しく開始されたｃＤＮＡを検
出した。オリゴヌクレオチドｂとｃとのハイブリダイゼーションは、ＲＴ反応が
オリゴｄ（Ｔ）で開始されたとき、新規の先端を欠いた産物を検出し、このプラ
イマーでの内部Ａリッチ伸長部からのミスプライムを示した（図４Ｂ）。オリゴ
ヌクレオチドｄとｅとのハイブリダイゼーションは、ＲＴ反応をオリゴｄ（Ｔ）
で開始したときに、付加的な新規のより多くの先端を欠いた産物を検出し（図４
Ｂにおいて矢印の頭で示される）、オリゴｄ（Ｔ）・Ｚを用いずにこのプライマ
ーを用いた第２の内部Ａリッチ伸長部からのミスプライムを示す（図４Ｂ）。
【００６４】 ミスプライムは、ｃＤＮＡ末端の迅速ナ増幅（ＲＡＣＥ）でよく起こることで
ある。５'ＲＡＣＥ分析の間、ｃＤＮＡの５'末端におけるミスプライムの例は、
図５に示される。そのようなミスプライムは、ホモロガスな標的（例えば５'末
端Ｇ末尾）と内部Ｇリッチ配列との区別を増加させるために、オリゴｄ（Ｃ）プ
ライマーにユニバーサルヌクレオチドを取り込むことにより解決されるであろう
。ホモポリマーオリゴｄ（Ｃ）プライマー中の少なくとも１つのユニバーサル塩
基（例えば３−ニトロピロール）の取り込みが、そのようなミスプライムを著し
く減少させるに違いないことが期待される。
ある。５'ＲＡＣＥ分析の間、ｃＤＮＡの５'末端におけるミスプライムの例は、
図５に示される。そのようなミスプライムは、ホモロガスな標的（例えば５'末
端Ｇ末尾）と内部Ｇリッチ配列との区別を増加させるために、オリゴｄ（Ｃ）プ
ライマーにユニバーサルヌクレオチドを取り込むことにより解決されるであろう
。ホモポリマーオリゴｄ（Ｃ）プライマー中の少なくとも１つのユニバーサル塩
基（例えば３−ニトロピロール）の取り込みが、そのようなミスプライムを著し
く減少させるに違いないことが期待される。
【００６５】 本発明をさらに以下の非制限的な実施例により説明する。
【００６６】
実施例１ オリゴｄ（Ｔ）・Ｉプライマーを用いたミスプライムの不安定化とミスプライム
の減少 本発明においてミスマッチの配列の間の水素結合を不安定化するヌクレオチド
の他の“修飾”を用いることができることを示すために、オリゴｄ（Ｔ）プライ
マーを、デオキシヌクレオチドデオキシイノシン（Ｉ）の挿入により修飾した。 配列５'ＴＴＴＴＴＴＴＩ*ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＩ*ＴＴＴＴＴ３'を有するオリ
ゴヌクレオチド［オリゴｄ（Ｔ）・Ｉと呼ばれる］をこうして合成した(McGill
University Sheldon Biotechnology Center)。ここでＩ*は２'デオキシイノシン
がオリゴヌクレオチドに取り込まれた位置を示す。逆転写反応を、Superscript
II TM(Life Technologies)を用いて、Life Technologiesにより推奨された条件
下で、インビトロ生成されたeIF-4G ｍRNAテンペレート（１μｇ）で行なった
。第１の鎖合成を開始するために用いられたオリゴヌクレオチドプライマーは、
オリゴｄ（Ｔ）15、オリゴｄ（Ｔ）・Ｚ、又はオリゴｄ（Ｔ）・Ｉのいずれか０
．１μｇであった。放射性同位体α‐32Ｐ−ｄＣＴＰ（New England Nuclear）
をｃＤＮＡ産物の質をモニターするためのトレーサーとして用いた。ｃＤＮＡ産
物を４２℃、１時間生成させた後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し
、等量の水で逆抽出し、Ｇ５０TM精子カラムを通し、２Ｍ酢酸アンモニウムと２
．５倍量のエタノールで沈澱させた。沈澱を７０％エタノールで洗浄し、乾燥さ
せ、２０μｌの水で再懸濁させた。アリコート（５μｌ）を１．２％のアルカリ
アガロースゲル上にロードし、７８ボルトで６．５時間電気泳動を行なった。ゲ
ルを７％トリクロロ酢酸で３０分間中和し、乾燥させ、Ｘ−ＯＭＡＴＸ線フィル
ム（Kodak）に−７０℃１０時間、増感スクリーンを用いて暴露した。
の減少 本発明においてミスマッチの配列の間の水素結合を不安定化するヌクレオチド
の他の“修飾”を用いることができることを示すために、オリゴｄ（Ｔ）プライ
マーを、デオキシヌクレオチドデオキシイノシン（Ｉ）の挿入により修飾した。 配列５'ＴＴＴＴＴＴＴＩ*ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＩ*ＴＴＴＴＴ３'を有するオリ
ゴヌクレオチド［オリゴｄ（Ｔ）・Ｉと呼ばれる］をこうして合成した(McGill
University Sheldon Biotechnology Center)。ここでＩ*は２'デオキシイノシン
がオリゴヌクレオチドに取り込まれた位置を示す。逆転写反応を、Superscript
II TM(Life Technologies)を用いて、Life Technologiesにより推奨された条件
下で、インビトロ生成されたeIF-4G ｍRNAテンペレート（１μｇ）で行なった
。第１の鎖合成を開始するために用いられたオリゴヌクレオチドプライマーは、
オリゴｄ（Ｔ）15、オリゴｄ（Ｔ）・Ｚ、又はオリゴｄ（Ｔ）・Ｉのいずれか０
．１μｇであった。放射性同位体α‐32Ｐ−ｄＣＴＰ（New England Nuclear）
をｃＤＮＡ産物の質をモニターするためのトレーサーとして用いた。ｃＤＮＡ産
物を４２℃、１時間生成させた後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し
、等量の水で逆抽出し、Ｇ５０TM精子カラムを通し、２Ｍ酢酸アンモニウムと２
．５倍量のエタノールで沈澱させた。沈澱を７０％エタノールで洗浄し、乾燥さ
せ、２０μｌの水で再懸濁させた。アリコート（５μｌ）を１．２％のアルカリ
アガロースゲル上にロードし、７８ボルトで６．５時間電気泳動を行なった。ゲ
ルを７％トリクロロ酢酸で３０分間中和し、乾燥させ、Ｘ−ＯＭＡＴＸ線フィル
ム（Kodak）に−７０℃１０時間、増感スクリーンを用いて暴露した。
【００６７】 オートラジオグラフの写真を図６に示す。分子量標準ラダーをレーン１に示す
（Life Technologiesより購入）。オリゴｄ（Ｔ）15による開始により得られた
ｃＤＮＡ産物をレーン２に示す。明らかに、大部分のｃＤＮＡ産物は、全長より
も短く、内部Ａリッチ部位における内部ミスプライムにより生じている。すでに
示したように、オリゴｄ（Ｔ）・Ｚでのプライミングは、ミスプライム現象を正
すことができ、特にこの実験では５０％を超えるｃＤＮＡがｍＲＮＡのポリ（Ａ
）末端から正しく開始されている（レーン３、全長産物を矢印で示す）。オリゴ
ｄ（Ｔ）・ＩによるｃＤＮＡ反応の開始も、オリゴｄ（Ｔ）15プライマーで観察
されたミスプライム反応を効率的に正し、かなりの比率の全長のｃＤＮＡをもた
らした（レーン４、全長産物は矢印で示す）。
（Life Technologiesより購入）。オリゴｄ（Ｔ）15による開始により得られた
ｃＤＮＡ産物をレーン２に示す。明らかに、大部分のｃＤＮＡ産物は、全長より
も短く、内部Ａリッチ部位における内部ミスプライムにより生じている。すでに
示したように、オリゴｄ（Ｔ）・Ｚでのプライミングは、ミスプライム現象を正
すことができ、特にこの実験では５０％を超えるｃＤＮＡがｍＲＮＡのポリ（Ａ
）末端から正しく開始されている（レーン３、全長産物を矢印で示す）。オリゴ
ｄ（Ｔ）・ＩによるｃＤＮＡ反応の開始も、オリゴｄ（Ｔ）15プライマーで観察
されたミスプライム反応を効率的に正し、かなりの比率の全長のｃＤＮＡをもた
らした（レーン４、全長産物は矢印で示す）。
【００６８】 これまで本発明を好適な実施態様により説明したが、これはクレームされた本
発明の思想と性質から離れることなしに、修正することができるものである。
発明の思想と性質から離れることなしに、修正することができるものである。
【図１】 図１（従来技術）は、ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを生成
させる工程の例を示す。ｃＤＮＡライブラリー生成のために多くの方法を用いる
ことができるが、そのうちの１つだけを示す。しかし、すべてのライブラリーは
、第１工程として、逆転写酵素（ＲＴ）がそこから開始できるプライマーを必要
とする。全長ｃＤＮＡライブラリーの場合、真核生物ｍＲＮＡｓの３'ポリ（Ａ
）末端にアニールするために、オリゴｄ（Ｔ）プライマーが用いられる。原核生
物、いくつかのウィルス、又はポリ（Ａ）末端を欠く他の真核生物ｍＲＮＡの場
合、ヌクレオシド５'モノホスフェートのホモポリマー伸長部が、ｍＲＮＡの３'
末端に付加される。例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼは、それを欠いているｍＲ
ＮＡにポリ（Ａ）末端を付加するために用いることができる。相補ヌクレオチド
（例えばオリゴｄ（Ｔ））含むオリゴヌクレオチドは、ついでｍＲＮＡにアニー
ルされて、ＲＴのためのプライマーとして機能する。
させる工程の例を示す。ｃＤＮＡライブラリー生成のために多くの方法を用いる
ことができるが、そのうちの１つだけを示す。しかし、すべてのライブラリーは
、第１工程として、逆転写酵素（ＲＴ）がそこから開始できるプライマーを必要
とする。全長ｃＤＮＡライブラリーの場合、真核生物ｍＲＮＡｓの３'ポリ（Ａ
）末端にアニールするために、オリゴｄ（Ｔ）プライマーが用いられる。原核生
物、いくつかのウィルス、又はポリ（Ａ）末端を欠く他の真核生物ｍＲＮＡの場
合、ヌクレオシド５'モノホスフェートのホモポリマー伸長部が、ｍＲＮＡの３'
末端に付加される。例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼは、それを欠いているｍＲ
ＮＡにポリ（Ａ）末端を付加するために用いることができる。相補ヌクレオチド
（例えばオリゴｄ（Ｔ））含むオリゴヌクレオチドは、ついでｍＲＮＡにアニー
ルされて、ＲＴのためのプライマーとして機能する。
【図２】 図２Ａは、現在のｃＤＮＡライブラリー構築で用いられる従来の
オリゴｄ（Ｔ）プライマーによる、ｍＲＮＡ（右）の真性ポリ（Ａ）末端への、
又はｍＲＮＡ内部の内部Ａリッチ伸長部（左）への、オリゴｄ（Ｔ）15プライマ
ーのハイブリダイゼーションを示す。用いられるプライマーの長さは異なること
があり、また２つの３'先端のヌクレオチドは、時々オリゴヌクレオチドを、ｍ
ＲＮＡのボディとポリ（Ａ）末端のジャンクションにおいて適所に“ロックした
”（Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ）及び（Ａ，Ｇ，Ｃ）であるが、これらの修飾はどれもオリ
ゴｄ（Ｔ）プライマーの内部Ａリッチ伸長部へのミスアニールを防がない。アス
テリスクは、二重鎖の不安定化をもたらすミスペアリングを示す。図２Ｂは３−
ニトロピロールの化学構造を示す。図２Ｃは、オリゴｄ（Ｔ）・Ｚプライマーの
構造を示す。図２Ｄは、オリゴｄ（Ｔ）・Ｚにハイブリダイズするときの、ポリ
（Ａ）末端（右）と内部Ａリッチ伸長部（左）との間の期待される区別を示す。
アステリスクは、二重鎖の不安定化をもたらすミスペアリングを示し、丸は３−
ニトロピロール人為ミスマッチを示す。
オリゴｄ（Ｔ）プライマーによる、ｍＲＮＡ（右）の真性ポリ（Ａ）末端への、
又はｍＲＮＡ内部の内部Ａリッチ伸長部（左）への、オリゴｄ（Ｔ）15プライマ
ーのハイブリダイゼーションを示す。用いられるプライマーの長さは異なること
があり、また２つの３'先端のヌクレオチドは、時々オリゴヌクレオチドを、ｍ
ＲＮＡのボディとポリ（Ａ）末端のジャンクションにおいて適所に“ロックした
”（Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ）及び（Ａ，Ｇ，Ｃ）であるが、これらの修飾はどれもオリ
ゴｄ（Ｔ）プライマーの内部Ａリッチ伸長部へのミスアニールを防がない。アス
テリスクは、二重鎖の不安定化をもたらすミスペアリングを示す。図２Ｂは３−
ニトロピロールの化学構造を示す。図２Ｃは、オリゴｄ（Ｔ）・Ｚプライマーの
構造を示す。図２Ｄは、オリゴｄ（Ｔ）・Ｚにハイブリダイズするときの、ポリ
（Ａ）末端（右）と内部Ａリッチ伸長部（左）との間の期待される区別を示す。
アステリスクは、二重鎖の不安定化をもたらすミスペアリングを示し、丸は３−
ニトロピロール人為ミスマッチを示す。
【図３】 図３Ａは、３'末端におけるミスプライムを分析するために用い
られるeIF-4GII ｃＤＮＡ構築物の構造を示す。４つの内部Ａ配列の位置が示さ
れる‐それらの全てが、elF-4GIIがｃＤＮＡライブラリーから単離されたときに
３'先端を欠いたクローンを生成した。プラスミドを、〜２４００のnt 3Ｈテス
ト転写物を生成させるために用いられるＡｓｐ７１８とＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
で直鎖化した。図３Ｂは、ホルムアルデヒド１．２％アガロースゲル上での分画
化、ＥＮ3ＨＡＮＣＥでの処理、乾燥ゲルのアートラジオグラフィーの後に、イ
ンビトロで生成された転写物の完全な状態を示す。図３Ｃは、ＭＭＬＶＲＴを用
いたオリゴｄ（Ｔ）（レーン１）又はオリゴｄ（Ｔ）・Ｚ（レーン２）による合
成を開始することより生成されるＲＴ産物のアルカリアガロース分析を示す。相
補ＤＮＡをα‐32ＰｄＣＴＰで標識化した。先端を欠いた産物のミグレーション
の位置は、黒丸により示され、全長産物は矢印により示される。これらの結果は
直接、第１の鎖合成の間のプライマーとしてオリゴｄ（Ｔ）・Ｚを用いた３'ミ
スプライムの訂正を示す。
られるeIF-4GII ｃＤＮＡ構築物の構造を示す。４つの内部Ａ配列の位置が示さ
れる‐それらの全てが、elF-4GIIがｃＤＮＡライブラリーから単離されたときに
３'先端を欠いたクローンを生成した。プラスミドを、〜２４００のnt 3Ｈテス
ト転写物を生成させるために用いられるＡｓｐ７１８とＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
で直鎖化した。図３Ｂは、ホルムアルデヒド１．２％アガロースゲル上での分画
化、ＥＮ3ＨＡＮＣＥでの処理、乾燥ゲルのアートラジオグラフィーの後に、イ
ンビトロで生成された転写物の完全な状態を示す。図３Ｃは、ＭＭＬＶＲＴを用
いたオリゴｄ（Ｔ）（レーン１）又はオリゴｄ（Ｔ）・Ｚ（レーン２）による合
成を開始することより生成されるＲＴ産物のアルカリアガロース分析を示す。相
補ＤＮＡをα‐32ＰｄＣＴＰで標識化した。先端を欠いた産物のミグレーション
の位置は、黒丸により示され、全長産物は矢印により示される。これらの結果は
直接、第１の鎖合成の間のプライマーとしてオリゴｄ（Ｔ）・Ｚを用いた３'ミ
スプライムの訂正を示す。
【図４】 図４Ａは、３'末端でのミスプライムを示すために用いられるeIF
-4GII構築物の構造を示す。オリゴｄ（T）により３'ミスプライムの部位をマッ
プするためにハイブリダイゼーションアッセイに用いられる５つのオリゴヌクレ
オチド（a,b,c,d,e）の位置が示される。eIF-4GII上のオリゴヌクレオチドヌク
レオチドのヌクレオチド標的は： オリゴａ 5567GAAATTGACTCAGTACTATT5584 オリゴｂ 5416GAAGGAAATGCTGTGGACC5535 オリゴｃ 5194TGTATAATAGAAAAGCAGAG5213 オリゴｄ 5068TTTTAAACAAGGACTCATAC5087 オリゴｅ 4781AAGAGGAGTCTGAGGATAAC4800 図４Ｂはオリゴｄ（Ｔ）又はオリゴｄ（Ｔ）・Ｚのいずれかによる合成開始に
より生成されるＲＴ産物のアルカリアガロースゲルのサザンブロットを示す。マ
ーカーレーンは、ＧＩＢＣＯからの１ｋｂサイズのラダーを示し、サイズ（ｂｐ
）は図の左に示される。eIF-4GII DNAは、ＤＮＡハイブリダイゼーションの陽
性対照として用いられるeIF-4GIIのＤＮＡ断片を示す。各ブロットでプローブと
して用いられるオリゴヌクレオチドは、各パネルの下に示される。左のアステリ
スクは、正しいポリ（Ａ）部位での開始により得られるｃＤＮＡ産物を示す。黒
丸は、ヌクレオチド５５５０−５５７５の間のＡリッチ伸長部からの開始により
得られるｃＤＮＡ産物を示し、矢印は、ヌクレオチド５０８５−５１２０からの
開始により得られるｃＤＮＡを示す。
-4GII構築物の構造を示す。オリゴｄ（T）により３'ミスプライムの部位をマッ
プするためにハイブリダイゼーションアッセイに用いられる５つのオリゴヌクレ
オチド（a,b,c,d,e）の位置が示される。eIF-4GII上のオリゴヌクレオチドヌク
レオチドのヌクレオチド標的は： オリゴａ 5567GAAATTGACTCAGTACTATT5584 オリゴｂ 5416GAAGGAAATGCTGTGGACC5535 オリゴｃ 5194TGTATAATAGAAAAGCAGAG5213 オリゴｄ 5068TTTTAAACAAGGACTCATAC5087 オリゴｅ 4781AAGAGGAGTCTGAGGATAAC4800 図４Ｂはオリゴｄ（Ｔ）又はオリゴｄ（Ｔ）・Ｚのいずれかによる合成開始に
より生成されるＲＴ産物のアルカリアガロースゲルのサザンブロットを示す。マ
ーカーレーンは、ＧＩＢＣＯからの１ｋｂサイズのラダーを示し、サイズ（ｂｐ
）は図の左に示される。eIF-4GII DNAは、ＤＮＡハイブリダイゼーションの陽
性対照として用いられるeIF-4GIIのＤＮＡ断片を示す。各ブロットでプローブと
して用いられるオリゴヌクレオチドは、各パネルの下に示される。左のアステリ
スクは、正しいポリ（Ａ）部位での開始により得られるｃＤＮＡ産物を示す。黒
丸は、ヌクレオチド５５５０−５５７５の間のＡリッチ伸長部からの開始により
得られるｃＤＮＡ産物を示し、矢印は、ヌクレオチド５０８５−５１２０からの
開始により得られるｃＤＮＡを示す。
【図５】 図５は、既知の遺伝子の配列を伸長するための５'ＲＡＣＥ分析
のｃＤＮＡライブラリー構築の間のｃＤＮＡの５'末端でのミスプライムを図示
する例を示す。
のｃＤＮＡライブラリー構築の間のｃＤＮＡの５'末端でのミスプライムを図示
する例を示す。
【図６】 図６は、eIF-4GII ｍＲＮＡ上のオリゴｄ（Ｔ）で開始される第
１の鎖合成の後の、オートラジオグラフを示す。レーン２はオリゴｄ（Ｔ）対照
でありレーン３はオリゴｄ（Ｔ）・Ｚであり、レーン４はオリゴｄ（Ｔ）・Ｉで
ある。分子量標準ラダーはレーン１に示される。
１の鎖合成の後の、オートラジオグラフを示す。レーン２はオリゴｄ（Ｔ）対照
でありレーン３はオリゴｄ（Ｔ）・Ｚであり、レーン４はオリゴｄ（Ｔ）・Ｉで
ある。分子量標準ラダーはレーン１に示される。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１２月５日（２０００．１２．５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA12 HA19 4B063 QA13 QQ43 QQ53 QR07 QR08 QR32 QR36 QR62 QS25 QS34 QX01 QX07
Claims (37)
- 【請求項１】 オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の非特異的二重鎖形成
を不安定化する方法であって、前記標的核酸と修飾されたオリゴヌクレオチドと
のインキュベーションを含み、前記修飾されたオリゴヌクレオチドは、前記修飾
されたオリゴヌクレオチドと非特異的標的配列との間の水素結合を減少又は阻止
する修飾を有するホモポリマー配列を含むものである方法。 - 【請求項２】 前記修飾は、前記ホモポリマー配列中に取り込まれた少なく
とも１つのユニバーサル塩基である、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記ユニバーサル塩基が３−ニトロピロールである請求項２
記載の方法。 - 【請求項４】 前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチド
修飾を含むホモポリマーである、請求項１乃至３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項５】 ライブラリー中の全長ｃＤＮＡクローンの比率を増加させる
方法であって、第１の鎖合成の間の修飾されたオリゴｄ（Ｔ）の使用を含むもの
であり、前記修飾されたオリゴｄ（Ｔ）は前記修飾オリゴｄ（Ｔ）と非特異的標
的配列との間の水素結合を減少又は阻止する修飾を有する修飾を含み、これによ
り全長ｃＤＮＡクローンの比率を増加させるものである方法。 - 【請求項６】 前記修飾は、前記オリゴｄ（Ｔ）中に取り込まれた少なくと
も１つのユニバーサル塩基である、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 前記ユニバーサル塩基が３−ニトロピロールである請求項６
記載の方法。 - 【請求項８】 前記修飾は、前記オリゴｄ（Ｔ）中に取り込まれた少なくと
も１つの化学修飾されたヌクレオシドである、請求項５記載の方法。 - 【請求項９】 前記修飾は、前記オリゴｄ（Ｔ）中に取り込まれた少なくと
も１つの塩基アナログである、請求項５記載の方法。 - 【請求項１０】 前記塩基アナログがイノシンである請求項９記載の方法。
- 【請求項１１】 前記修飾は、前記オリゴｄ（Ｔ）中に取り込まれた少なく
とも１つのミスマッチである、請求項５記載の方法。 - 【請求項１２】 前記修飾は、前記オリゴｄ（Ｔ）中に取り込まれたリン酸
又はリボース修飾である、請求項５記載の方法。 - 【請求項１３】 前記第１の鎖合成のために、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメリ
ゼーションが可能な酵素が用いられる、請求項５乃至１２のいずれか１項記載の
方法。 - 【請求項１４】 前記第１の鎖合成のために、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメリ
ゼーションが可能な酵素が用いられる、請求項５乃至１２のいずれか１項記載の
方法。 - 【請求項１５】 前記酵素が、鳥類ミオブラストイドウィルス逆転写酵素、
ネズミモロニー白血病ウィルス逆転写酵素、及びヒト免疫不全症ウィルス逆転写
酵素からなる群より選ばれた逆転写酵素である、請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 修飾されたオリゴｄ（Ｔ）プライマーを含むキットであっ
て、前記修飾されたオリゴヌクレオチドはそれ自身と非特異的標的配列との間の
水素結合を減少又は阻止する修飾を含む、ｃＤＮＡの合成のためのキット。 - 【請求項１７】 前記ＤＮＡ合成を開始する修飾されたオリゴヌクレオチド
の使用を含む、ＤＮＡ合成の間のミスプライムを減少させる方法であって、前記
修飾されたオリゴヌクレオチドは、前記修飾されたオリゴヌクレオチドと非特異
的標的配列との間の水素結合を減少又は阻止する修飾を有するホモポリマー配列
を含み、これにより、真性のホモポリマー標的配列との二重鎖の形成を保持しな
がらミスプライムを減少させる方法。 - 【請求項１８】 前記修飾が、前記ホモポリマー配列に取り込まれた少なく
とも１つのユニバーサル塩基である請求項１７記載の方法。 - 【請求項１９】 前記ユニバーサル塩基が３−ニトロピロールである請求項
１８記載の方法。 - 【請求項２０】 前記オリゴヌクレオチドがホモポリマーである請求項１７
、１８、１９のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２１】 ５'ＲＡＣＥを開始する修飾されたオリゴヌクレオチドの
使用を含む５'ＲＡＣＥの間のミスプライムを減少させる方法であって、前記修
飾されたオリゴヌクレオチドは、前記修飾されたオリゴヌクレオチドと非特異的
標的配列との間の水素結合を減少又は阻止する修飾を有するホモポリマー配列を
含み、これにより、真性のホモポリマー標的配列との二重鎖の形成を保持しなが
らミスプライムを減少させる方法。 - 【請求項２２】 前記修飾が、前記ホモポリマー配列に取り込まれた少なく
とも１つのユニバーサル塩基である請求項２１記載の方法。 - 【請求項２３】 前記ユニバーサル塩基が３−ニトロピロールである請求項
２１記載の方法。 - 【請求項２４】 前記修飾は、前記ホモポリマー配列中に取り込まれた少な
くとも１つの化学修飾されたヌクレオシドである、請求項２１記載の方法。 - 【請求項２５】 前記修飾は、前記ホモポリマー配列中に取り込まれた少な
くとも１つの塩基アナログである、請求項２１記載の方法。 - 【請求項２６】 前記塩基アナログがイノシンである請求項２５記載の方法
。 - 【請求項２７】 前記修飾は、前記ホモポリマー配列中に取り込まれた少な
くとも１つのミスマッチである、請求項２１記載の方法。 - 【請求項２８】 前記修飾は、前記ホモポリマー配列中に取り込まれたミス
マッチ認識を不安定化するリン酸又はリボース修飾である、請求項２１記載の方
法。 - 【請求項２９】 修飾されたオリゴヌクレオチドプライマーを含む５'ＲＡ
ＣＥのためのキットであって、前記修飾されたオリゴヌクレオチドと非特異的標
的配列との間の水素結合を減少又は阻止する修飾を有するホモポリマー配列を含
むキット。 - 【請求項３０】 修飾されたオリゴヌクレオチドでの３'ＲＡＣＥのプライ
ムを含む３'ＲＡＣＥの間のミスプライムを減少させる方法であって、前記修飾
されたオリゴヌクレオチドは、前記修飾されたオリゴヌクレオチドと非特異的標
的配列との間の水素結合を減少又は阻止する修飾を有するホモポリマー配列を含
み、これにより、真性のホモポリマー標的配列との二重鎖の形成を保持しながら
ミスプライムを減少させる方法。 - 【請求項３１】 前記修飾が、前記ホモポリマー配列に取り込まれた少なく
とも１つのユニバーサル塩基である請求項３０記載の方法。 - 【請求項３２】 ホモポリマー伸長部から開始する修飾されたオリゴヌクレ
オチドの使用を含む真性の遺伝子マーカーを作製する方法であって、前記修飾さ
れたオリゴヌクレオチドは、前記修飾されたオリゴヌクレオチドと非特異的標的
配列との間の水素結合を減少又は阻止する修飾を有するホモポリマー配列を含む
方法。 - 【請求項３３】 前記修飾されたオリゴヌクレオチドが、Ａｌｕ反復中の内
部Ａリッチ領域から開始するものである請求項３２記載の方法。 - 【請求項３４】 オリゴヌクレオチドと標的ホモポリマー配列との間の二重
鎖形成を安定化する方法であって、該方法は前記標的ホモポリマー配列と修飾さ
れたオリゴヌクレオチドとのインキュベーションを含み、前記修飾されたオリゴ
ヌクレオチドは、それ自身と非特異的標的配列間の水素結合を減少又は阻止する
修飾を有するホモポリマー領域を含むものである方法。 - 【請求項３５】 ＤＮＡ合成を開始する修飾されたオリゴヌクレオチドの使
用を含む、配列の間のミスプライムを減少させる方法であって、前記修飾された
オリゴヌクレオチドは、それ自身と非特異的標的配列間の水素結合を減少又は阻
止する修飾を有するホモポリマー配列を含むものである方法。 - 【請求項３６】 オリゴヌクレオチド配列の、その標的化ホモポリマー配列
対非ホモポリマー領域との結合の間の区別を改善する方法であって、それ自身と
非特異的標的領域間の水素結合を減少又は阻止する少なくとも１つの修飾の前記
オリゴヌクレオチド配列のホモポリマー領域への挿入を含むものである方法。 - 【請求項３７】 ３'末端化された第１の鎖産物からの第２の鎖合成の間の
修飾されたオリゴヌクレオチドの使用を含み、前記修飾されたオリゴヌクレオチ
ドは前記修飾オリゴと非特異的標的配列との間の水素結合を減少又は阻止する修
飾を有する修飾を含み、これにより全長ｃＤＮＡクローンの比率を増加させる、
ライブラリー中の全長ｃＤＮＡクローンの比率を増加させる方法。
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