CN106987597A - 脂肪酶基因及其在制备D‑α‑生育酚醋酸酯方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种编码皱褶假丝酵母脂肪酶的基因CRL1及其应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该序列全长1602bp，该基因对于毕赤酵母是密码子偏好的。利用本发明的该基因通过基因工程的方法可以高效获取高质量的脂肪酶，且获取的脂肪酶在催化合成生育酚方面的效果显著优于现有的脂肪酶。

Description

脂肪酶基因及其在制备D-α-生育酚醋酸酯方面的应用
技术领域
本发明涉及一种脂肪酶基因及其应用，尤其是一种编码皱褶假丝酵母脂肪酶的基因及其在制备D-α-生育酚醋酸酯方面的应用。
背景技术
VE又称生育酚，是人体内具有多种生理功能的重要脂溶性维生素和天然抗氧化剂，是重要的的保健药品，有抗衰老、提高免疫力的作用，对心血管疾病有辅助治疗作用。VE有化学合成品和天然品两种，而天然VE无论从生物活性和安全性上均高于化学合成品。VE的市场很活跃，世界年消耗量约为25000吨。由于VE具有易氧化、表面活性差等缺点，因此目前的研究热点集中在酚羟基的改性上，即生产醋酸酯、琥珀酸酯、阿魏酸酯等VE酯类产品。另外，由于化学合成法副产物多、环境污染严重、选择性差、产物转化率低，反应条件剧烈，而生物酶法具有反应条件温和、高效、专一、节约能源，不污染环境等优点，因此采用生物酶法催化合成VE酯具有重要意义。
中国发明专利申请CN 101240303 A披露了一种脂肪酶催化合成天然生育酚酯的方法，该方法将天然的生育酚和一种不饱和的羧酸酯，按两者摩尔比在1:1-1:5的范围，加入到反应媒体有机溶剂中，以脂肪酶为催化剂催化合成天然生育酚酯。该方法的缺点在于其需要有机溶剂作为反应媒体，且反应需要48至72小时，反应时间过长，这些显然都会制约脂肪酶催化合成生育酚的用途。
发明内容
鉴于此，本发明的发明人提出一种脂肪酶基因及其在制备D-α-生育酚醋酸酯方面的应用，本发明的脂肪酶基因可以大大提高脂肪酶的制备效率，且当把利用该脂肪酶基因制备的脂肪酶可以直接应用于制备D-α-生育酚醋酸酯，该制备方法不需要有机溶剂作为反应媒体，且反应时长较短，可以促进脂肪酶在催化合成生育酚方面的应用。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种编码皱褶假丝酵母脂肪酶的基因CRL1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该序列全长1602bp，该基因对于毕赤酵母是密码子偏好的。
一种含有上述的皱褶假丝酵母脂肪酶的基因CRL1的表达载体。
一种上述的皱褶假丝酵母脂肪酶的基因的表达载体，所述表达载体为pHKA-CRL1表达载体。
一种含有上述编码皱褶假丝酵母脂肪酶的基因CRL1的基因工程菌。
一种含有上述表达载体的基因工程菌。
一种含有上述pHKA-CRL1表达载体的基因工程菌。
一种上述的基因工程菌，所述基因工程菌为生产皱褶假丝酵母脂肪酶的毕赤酵母GS115/pHKA-CRL1。
一种利用上述的基因工程菌发酵生产脂肪酶的方法，其包含以下步骤：毕赤酵母GS115/pHKA-CRL1经YPD培养基培养24h后，转接BMGY培养基培养24h，然后接种BMMY培养基进行发酵，发酵条件为：摇瓶装液量10%（V/V），菌体起始OD600=1.0，每24h添加1%（V/V)甲醇诱导，发酵时间120-144h，结束后将发酵液7000rpm，4℃离心10min，取上清，加入终浓度1%海藻糖（M/V），-80℃冻存6h，得到CRL1粗酶粉。
一种利用上述的粗酶粉催化合成D-α-生育酚醋酸酯的方法，其特征在于包含以下步骤：反应条件：乙酸酐1-5mL，D-α-生育酚（1300IU/g，87.25%）200mg，CRL1粗酶粉（80-100U/g)100-300mg，转速200rpm，反应温度40℃-80℃，反应时间2h-36h。
本发明的有益效果为：
本发明的编码皱褶假丝酵母脂肪酶的基因CRL1对于毕赤酵母是密码子偏好的，利用该基因通过基因工程的方法可以高效获取高质量的脂肪酶，且获取的脂肪酶在催化合成生育酚方面的效果显著优于现有的脂肪酶，比如本发明的催化合成反应最短仅需时2小时，另外本发明的催化合成不需要以有机溶剂作为反应媒体。
具体实施方式
重组质粒载体的构建和毕赤酵母GS115工程菌的构建
以1602bp（成熟肽核苷酸序列）SEQ ID NO1序列为模板，EcoR I和Not I为酶切位点，设计引物：
上游引物：5’-CTTATGAATTCGCTCCAACTGCTACTTTGGC
下游引物：5’-TATAGCGGCCGCTTAAACGAAAAAGGATGGT
以质粒pGH-CRL1为模板，使用上述引物和KOD高保真酶进行PCR扩增。CRL1基因和分泌型质粒载体pHKA（由本实验室构建并保存，菌种DH5α/pPICZαA-HKA）经EcoR I和Not I双酶切后，通过T4连接酶体外连接构建重组质粒pHKA-CRL1。
采用LiCl法将Sal I线性化后的重组质粒pHKA-CRL1电击转化毕赤酵母GS115感受态，转化物涂布MD平板，30℃培养2-3天后挑取阳性转化子到三丁酸甘油酯乳化平板。30℃培养18h-36h后挑去水解圈较大且较早出现的菌落接种YPD培养基。
重组工程菌的摇瓶发酵和粗酶粉的制备
GS115/pHKA-CRL1经YPD培养24h后，转接BMGY培养基培养24h，然后接种BMMY培养基进行发酵。发酵条件为：摇瓶装液量10%（V/V），菌体起始OD600=1.0，每24h添加1%（V/V)甲醇诱导，发酵时间120-144h。
发酵结束后将发酵液7000rpm，4℃离心10min，取上清，加入终浓度1%海藻糖（M/V），-80℃冻存6h，然后过夜冷冻真空干燥（≤0.37MPa)得到粗酶粉。经测定，对对硝基苯酚丁酯水解活力约为80-100U/g粗酶粉。测酶粉保存于4℃，使用前置于干燥器（饱和LiCl，水活度0.110）中过夜活化。
脂肪酶CRL1催化D-α-生育酚醋酸酯的合成
反应条件：乙酸酐1-5mL，D-α-生育酚（1300IU/g，87.25%）200mg，CRL1粗酶粉（80-100U/g)100-300mg，转速200rpm，反应温度40℃-80℃，反应时间2h-36h，D-α-生育酚最大转化率接近100%，D-α-生育酚醋酸酯最大产率大约96%。
实施例1：称取200mg D-α-生育酚（1300IU/g，87.25%)，加入5mL乙酸酐和200mgCRL1酶粉（85U/g)，反应温度40℃，摇床转速200rpm，反应36h后经测定D-α-生育酚转化率为96%，D-α-生育酚醋酸酯产率大为78%。
实施例2：称取200mg D-α-生育酚（1300IU/g，87.25%)，加入5mL乙酸酐和200mgCRL1酶粉（85U/g)，反应温度80℃，摇床转速200rpm，反应2h后经测定D-α-生育酚转化率为99%，D-α-生育酚醋酸酯产率为96%。
实施例3：称取200mg D-α-生育酚（1300IU/g，87.25%)，加入1mL乙酸酐和100mgCRL1酶粉（85U/g)，反应温度80℃，摇床转速200rpm，反应2h后经测定D-α-生育酚转化率为99%，D-α-生育酚醋酸酯产率为87%。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州康琳奈生物科技有限公司
<120> 脂肪酶基因及其在制备D-α-生育酚醋酸酯方面的应用
<130> none
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1602
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gctccaactg ctactttggc taacggtgac actattactg gtttgaacgc tattattaac 60
gaagcgtttt tgggtattcc atttgctgaa ccaccagttg gtaacttgag attcaaagat 120
ccagttccat actctggttc tttggatggt caaaagttta cttcttacgg tccatcttgt 180
atgcaacaaa acccagaagg tacttacgaa gaaaacttgc caaaggctgc tttggatttg 240
gttatgcaat ctaaggtttt tgaagctgtt tctccatctt ctgaagattg tttgactatt 300
aacgttgtta gaccaccagg tactaaggct ggtgctaact tgccagttat gttgtggatt 360
tttggtggtg gttttgaagt tggtggtact tctacttttc caccagctca aatgattact 420
aagtctattg ctatggggaa accaattatt catgtttctg ttaactacag agtttcttct 480
tggggatttt tggctggcga cgaaattaag gctgaaggtt ctgctaacgc tggtttgaag 540
gatcaaagat tgggtatgca atgggttgct gataacattg ctgcttttgg tggagaccca 600
actaaggtta ctatttttgg tgaatctgct ggttctatgt ctgttatgtg tcatattttg 660
tggaacgatg gcgacaacac ttacaagggg aaaccattgt ttagagctgg tattatgcaa 720
tctggtgcta tggttccatc tgatgctgtt gatggtatct atggtaacga aatttttgat 780
ttgttggctt ctaacgctgg ttgtggttct gcttctgata agttggcttg tttgagaggt 840
gtttcttctg atactttgga agatgctact aacaacactc caggtttctt ggcttactct 900
tctttgagat tgtcttactt gccaagacca gatggtgtta acattactga tgatatgtac 960
gctttggtta gagaaggcaa atacgctaac attccagtta ttattgggga tcaaaacgat 1020
gaagggacat tcttcggtac ttcttctttg aacgttacta ctgatgctca agctagagaa 1080
tactttaagc aatcttttgt tcatgcttct gatgctgaaa ttgatacttt gatgactgct 1140
taccctgggg acattactca aggttctcca tttgatactg gtattttgaa cgctttgact 1200
ccacagttta agagaatttc tgctgttttg ggcgacttgg gttttacttt ggctagaaga 1260
tactttttga accattacac tggtggtact aagtacagct tcttgtctaa gcaattgtct 1320
ggtttgccag ttttgggtac ttttcattct aacgatattg tttttcaaga ttacttgttg 1380
ggttctggtt ctttgatcta caacaacgct tttattgctt ttgctactga tcttgatcca 1440
aacactgctg gtttgttggt taagtggcca gaatacactt cttcttctca atctggtaac 1500
aacttgatga tgattaacgc tttgggtttg tacactggga aagataactt tagaactgct 1560
ggttacgatg ctttgttttc taacccacca tcctttttcg tt 1602

Claims (9)

1.一种编码皱褶假丝酵母脂肪酶的基因CRL1，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，该序列全长1602bp，该基因对于毕赤酵母是密码子偏好的。
2.一种含有权利要求1所述的皱褶假丝酵母脂肪酶的基因CRL1的表达载体。
3.如权利要求2所述的皱褶假丝酵母脂肪酶的基因的表达载体，其特征在于：所述表达载体为pHKA-CRL1表达载体。
4.一种含有权利要求1所述编码皱褶假丝酵母脂肪酶的基因CRL1的基因工程菌。
5.一种含有权利要求2所述表达载体的基因工程菌。
6.一种含有权利要求3所述pHKA-CRL1表达载体的基因工程菌。
7.如权利要求6所述的一种基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌为生产皱褶假丝酵母脂肪酶的毕赤酵母GS115/pHKA-CRL1。
8.一种利用权利要求7所述的基因工程菌发酵生产脂肪酶的方法，其特征在于包含以下步骤：毕赤酵母GS115/pHKA-CRL1经YPD培养基培养24h后，转接BMGY培养基培养24h，然后接种BMMY培养基进行发酵，发酵条件为：摇瓶装液量10%（V/V），菌体起始OD600=1.0，每24h添加1%（V/V)甲醇诱导，发酵时间120-144h，结束后将发酵液7000rpm，4℃离心10min，取上清，加入终浓度1%海藻糖（M/V），-80℃冻存6h，得到CRL1粗酶粉。
9.一种利用权利要求8所述的粗酶粉催化合成D-α-生育酚醋酸酯的方法，其特征在于包含以下步骤：反应条件：乙酸酐1-5mL，D-α-生育酚（1300IU/g，87.25%）200mg，CRL1粗酶粉（80-100U/g)100-300mg，转速200rpm，反应温度40℃-80℃，反应时间2h-36h。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102994471A (zh) * 2012-12-10 2013-03-27 江南大学 一种最适温度提高的脂肪酶突变体及其应用

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