CN106978452A - 一种生物法合成曲酸月桂酸单酯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物法合成曲酸月桂酸单酯的方法，该方法利用一类具有多重杂环骨架结构的功能化离子液体共价修饰脂肪酶，再利用该高稳定性、催化活性及反应选择性的修饰脂肪酶在非水介质中催化曲酸与月桂酸反应制备曲酸月桂酸单酯。提高了产物得率，缩短了反应时间，且操作简单。

Description

一种生物法合成曲酸月桂酸单酯的方法

技术领域

本发明涉及一种功能化离子液体修饰脂肪酶催化合成曲酸月桂酸单酯(KML)的方法，属于食品生物技术领域。

背景技术

曲酸(Kojic acid)为无色棱柱状晶体,化学名称为5-羟基-2-羟甲基-吡啶-4-酮，是由曲霉属中某些菌株利用葡萄糖、果糖、山梨糖和糖醉等原料，好氧发酵产生的一种弱酸化合物。最早是由斋藤在1970年从蒸米发酵物中发现的。

曲酸具有抑菌能力、抗氧化性、与金属离子鳌合等性质，并具有抑制酪氨酸酶减少黑色素生成的作用，因此在食品中可作为防腐剂、保鲜剂、护色剂。经过大量实验证明，适量的曲酸对人体无害，曲酸可安全应用于食品、护肤品及医疗行业。目前对于曲酸的开发研究，大多数集中在寻找能够保留甚至提高曲酸抑制酪氨酸酶活力的性能，又可以克服曲酸易变性的缺点的曲酸衍生物。因而，曲酸衍生物的制被成为近年来的研究应用上的焦点和相关产品开发的新动向。

Ariff等人(Lajis AF,et al.J Biomed Biotechnol.2012；2012:952452.)通过研究曲酸酯对细胞及mushroom酪氨酸酶的抑制活性，结果表明，曲酸酯是安全无毒的除色剂，能有效抑制B16F1黑色素瘤细胞的酪氨酸酶活性。人们尝试通过其与脂肪酸的酯化反应，以期提高曲酸的脂溶性，尤其是通过利用生物转化法获得更为安全可靠的曲酸脂肪酸酯衍生物(Liu KJ,Shaw JF.J Am Oil Chem-Soc.1998,75:1507–1511；El-Boulifi N,Ashari SE,Serrano M,et al.Enzyme and Microb Technol.2014,55:128–132；Gunawan ER,Basri M,et al.Enzyme and Microb Technol.2005,37:739–744.)，进一步扩大其在疏水性食品中的应用范围。

我们的前期研究结果表明，曲酸月桂酸单酯(Kojic Monolaurate，KML)具有良好的抑菌能力、抗氧化性能，有望被开发成为防腐剂、保鲜剂、护色剂，应用于果蔬及甲壳类水产品保鲜领域。

合成KML的方法主要有化学合成与生物催化法。化学合成法使用大量有机溶剂和价格昂贵的金属催化剂，通过复杂的保护与去保护步骤，提高产物的单酯选择性。分离纯化复杂、投资成本大、易污染环境等缺点。而生物催化法具有条件温和、能耗低、无有害副产物、分离纯化操作简便等特点。此外生物催化剂—酶可以重复利用，大大降低了成本。

酶促法制备KML，主要利用脂肪酶作为催化剂，使曲酸与月桂酸(酯)发生直接酯化(或酯交换)反应。但从国内外的研究发现，常规脂肪酶在有机溶剂(叔戊醇、叔丁醇等)介质中催化酯化反应仍存在反应活性低、时间过长、产率低、酶用量大、成本高等问题。基于以上研究现状，如何缩短反应时间、提高酶活性及产物得率，同时减少脂肪酶用量已成为制约KML生物法合成的主要问题。

离子液体因具备对环境友好的特性而被称为“绿色”溶剂，己经在有机合成与生物化学、电化学、分离过程、催化等领域得到广泛的应用。同时，离子液体又被称为“可设计性”溶剂，通过改变阴、阳离子的结构可调节离子液的物化特性(如极性、疏水性、黏性、熔点、密度等)以完成其在各领域中的应用任务(Task-specific ionic liquid)。目前，离子液体在生物催化领域的应用研究往往就是将结构相对简单的传统型离子液用作催化反应介质或少量添加的反应促进剂(enhancer)，以期改善酶促反应，提高产物得率或反应选择性。2011年，Bastien Doumèche等研究发现含羟基的离子液体在活化剂作用下可实现甲酸脱氢酶的化学修饰，但这类常规离子液体不仅修饰作用有限，且对酶活影响较大。

本发明是利用一类功能化离子液体共价修饰脂肪酶，再将此高催化活性及反应选择性的修饰脂肪酶用于催化合成食品添加剂KML，缩短了反应时间，避免环境污染，为生物法制备KML提供了又一成功范例。

发明内容

本发明提供了一种生物法合成曲酸月桂酸单酯的方法，该方法具有较高的转化率和选择性，同时，缩短了反应时间，避免了环境污染。

一种生物法合成曲酸月桂酸单酯的方法，包括以下步骤：

在生物催化剂和分子筛存在的条件下，曲酸和月桂酸在反应介质中进行反应，反应结束后，经过后处理得到所述的KML；

所述的催化剂为功能化离子液体共价修饰脂肪酶。

该方法首先利用一类具有多重杂环骨架结构的功能化离子液体共价修饰脂肪酶，再将此高催化活性及反应选择性的修饰脂肪酶用于催化合成食品添加剂KML。本发明具有反应条件温和、反应选择性高、绿色无污染等优点，符合现代食品添加剂制造的要求。

用于游离脂肪酶化学修饰的功能化离子液体的阴离子是具有不同亲水性或电负性的极性离子，阳离子是含多重杂环骨架结构的离子，且含有机官能团为羧基。该功能化离子液体可用于对游离脂肪酶进行化学修饰，目的在于提高游离脂肪酶的稳定性、活性及催化选择性。

作为优选，所述的功能化离子液体为6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑六氟磷酸盐和5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑六氟磷酸盐；作为进一步的优选，所述的功能化离子液体中阳离子部分的脂肪酸支链选自羧乙基、羧丙基、羧丁基、羧戊基。

本发明还提供了一种采用所述的功能化离子液体共价修饰得到的脂肪酶，所述的修饰方法如下：

将所述的离子液体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺按1:1-3:1的摩尔比溶于吗琳乙磺酸(MES)中活化1-3h，将活化后的离子液体与脂肪酶按摩尔比100-1000：1在0-4℃混合反应2-6h；或者将所述的离子液体与CDI按摩尔比1:1-3溶于DMSO中活化1-3h，将活化后的功能化离子液与脂肪酶按摩尔比100-1000：1在0-4℃混合反应1-6h。通过上述方法可以使离子液的活性官能基团与脂肪酶的氨基酸残基通过共价结合得到修饰后的脂肪酶，从而将多重杂环骨架结构引入到脂肪酶的表面。

本发明中食品添加剂KML的具体制备方法如下：

将一定量的曲酸、月桂酸、分子筛、修饰脂肪酶与非水反应介质加入生物反应器中，控制反应温度60℃，反应时间为48h。反应结束后，离心，反应体系经乙酸乙酯洗涤，收集有机相，减压除溶剂，得固体粗产品；过柱纯化，收集有机相，除水，减压除溶剂，得白色固体KML。

其中，上述脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶、褶皱假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶、猪胰脂肪酶、根霉脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、洋葱布克氏菌脂肪酶；或上述一种或多种的脂肪酶。

其中，上述脂肪酶的用量为2.0～2.5％(w/v)。

其中，上述非水反应介质为离子液体或有机溶剂；或离子液体与有机溶剂的混合物。

其中，上述的反应介质为离子液体，三辛烷基甲基季铵盐、氯化-1-烯丙基-3-甲基咪唑盐、1-乙基-3-甲基咪唑乙酸正离子、1-丁基-3-甲基咪唑鎓氯化物、1-羟乙基-3-甲基咪唑四氯硼酸盐、1-羟乙基-3-甲基咪唑十二烷基磺酸盐、1-羟乙基-3-甲基咪唑氯盐、1-羟乙基-3-甲基咪唑硫酸氢盐、1-羟乙基-3-甲基咪唑硝酸盐、及各类含PEG支链的功能离子液体；或上述一种或多种的混合离子液体。

其中，上述反应介质为有机介质，叔丁醇、叔戊醇、正己烷、环己烷、异辛烷、丙酮、辛醇、丁醇、十二烷醇、2-甲基-2-丙醇、DMSO；或上述两种或多种有机溶剂的混合物。

作为最优选，所述的反应介质为叔丁醇和[PEG₃₅₀Im]PF₆的混合物，此时，催化效率最高。

其中，其中，上述曲酸的用量为6-10mg/L,且曲酸与月桂酸的摩尔比为1:2-1:6。

其中，上述反应温度为50-75℃。

其中，上述催化反应时间为6-48h。

其中，上述分子筛为3A型，分子筛用量为10-12％(w/v)。

本发明还提供了一种曲酸月桂酸单酯在制备食品添加剂中的应用，所述的食品添加剂用于抑制单增李斯特菌。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本发明提供的功能化离子液体修饰脂肪酶催化合成KML的方法，具有多重杂环骨架结构的功能性离子液体对脂肪酶实施了有效化学修饰，调整酶活性中心的空间结构，强化了脂肪酶的催化性能。不仅反应迅速，得到高纯度的曲酸月桂酸单酯，而且提高了脂肪酶的选择性，有效解决了副产物多、反应耗时、操作繁琐等问题，符合绿色化学的要求。

附图说明

图1是实施例1中，对比研究了自由酶与化学修饰脂肪酶在有机介质中催化合成KML的反应情况；

图2是实施例2中，化学修饰脂肪酶在离子液体/有机溶剂混合体系中[PEG₃₅₀Im]PF₆/叔丁醇中催化合成KML的反应情况。

图3是实施例3中，酶促反应产物KML对单增李斯特菌的抑菌效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但本发明不限于此。

气相色谱(GC)分析条件：不同时间从反应器中取出适量样品用色谱纯甲醇稀释并置于样品瓶中。立刻加样入GC色谱仪(Agilent 6890N)中，以防止样品的分解。色谱柱：HT-5fused silica capillary column(0.15μm,0.53mm,0.30m),检测器：FID，进样口及检测器温度340℃和350℃，柱温采用程序升温：70℃到340℃，升温速率20℃/min。载气为N₂，流速：1.0mL/min，进样量：2μL。KML得率(摩尔转化率)＝曲酸月桂酸单酯摩尔数/初始曲酸摩尔数×100％。

样品处理条件：反应结束后，反应体系进行离心分离，并用乙酸乙酯洗涤固体相两次，收集有机相，减压除溶剂得白色固体粗产物；再经过色谱分离，收集样品组分，合并有机相，干燥，减压除溶剂，得白色产物。

实施例1

本实施例对比研究了修饰脂肪酶与自由酶在有机介质中催化合成KML的反应差异。

仅用自由脂肪酶催化反应：

在生物反应器中加入42mM曲酸、130mM月桂酸、300mg 3A分子筛和60mg脂肪酶，3mL叔丁醇，水浴60℃，反应时间为48h。测定KML产率随时间的变化曲线。如图1所示。

功能离子液体共价修饰脂肪酶催化反应：

功能化离子液体的活化：将0.30g 6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-羧乙基咪唑溴化盐与0.2g CDI(1,1′-羰基二咪唑)溶于5mL DMSO，在室温条件下反应2h，得到活化后的功能化离子液体，未经处理，4℃冷藏备用。酶的共价修饰：功能化离子液体经活化后与游离南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B)按摩尔比200:1混合反应，反应温度控制在0～4℃，反应时间4h，离心去除残留修饰剂后得到修饰脂肪酶。

在生物反应器中加入42mM曲酸、130mM月桂酸、300mg 3A分子筛和60mg共价修饰脂肪酶，3mL叔丁醇，水浴60℃，反应时间为48h。反应结束后，测定KML产率随时间的变化曲线。如图1所示。

实施例2

本实施例对比研究了共价修饰脂肪酶在离子液体[PEG₃₅₀Im]PF₆与叔丁醇混合体系中催化合成KML的反应情况。

在生物反应器中加入42mM曲酸、130mM月桂酸、300mg 3A分子筛和60mg共价修饰脂肪酶，3mL[PEG₃₅₀Im]PF₆/叔丁醇(3:1,1:1,1:3,v/v)，设定反应温度60℃，反应时间为24h。反应结束后，计算产物KML产率，如图2所示。

实施例3

本实施例探究产物KML对单增李斯特菌的抑菌效果(琼脂扩散法)。

单增李斯特菌在TSB培养基中37℃培养12h。取其中100μl菌悬液，将其稀释至浓度为10⁶CFU/mL，在55℃将20mL TSA培养基与其混合均匀后立即置于培养皿中，冷却固化。利用无菌打孔器在固化培养基上打孔(直径7.0mm)，分别将100μL的10mM的抑菌剂溶液滴加入板空内，在还有实验菌的琼脂培养基上进行扩散渗透，并将他们置于37℃培养12h，再测定抑菌圈的大小。如果抑菌剂能杀死或抑制培养皿中供试菌的生长，则在牛津环的周围会出现一个无菌生长的透明圈，即抑菌圈。以抑菌圈的直径作为评定指标，直径越大，说明该抑菌剂对此种供试菌的抑制效果越好，反之则抑制效果越差。

(0)号，对应乙醇，作为阴性对照。(1)号，L-抗坏血酸；(2)号，对应KML；(3)号，对应醋酸，作为阳性对照；对应KML；(4)号，蔗糖单硬脂酸酯

抑菌圈测定结果为：12.2±0.4(1),15.4±0.2(2),13.4±0.3(3)和12.1±0.2mm(4)。结果表明KML对单增李斯特菌具有较好的抑菌效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应该视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种生物法合成曲酸月桂酸单酯的方法，包括以下步骤：

在生物催化剂和分子筛存在的条件下，曲酸和月桂酸在反应介质中进行反应，反应结束后，经过后处理得到所述的曲酸月桂酸单酯；

其特征在于，所述的生物催化剂为功能化离子液体共价修饰的脂肪酶。

2.根据权利要求1所述的生物法合成曲酸月桂酸单酯的方法，其特征在于，所述的功能化离子液体为6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑六氟磷酸盐和/或5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑六氟磷酸盐。

3.根据权利要求2所述的生物法合成曲酸月桂酸单酯的方法，其特征在于，所述的功能化离子液体中阳离子部分的脂肪酸支链选自羧乙基、羧丙基、羧丁基或羧戊基。

4.根据权利要求1所述的生物法合成曲酸月桂酸单酯的方法，其特征在于，所述的脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶、褶皱假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶、猪胰脂肪酶、根霉脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、洋葱布克氏菌脂肪酶中的一种。

5.根据权利要求1所述的生物法合成曲酸月桂酸单酯的方法，其特征在于，所述的脂肪酶的用量为2.0～2.5％(w/v)；

所述曲酸与月桂酸的摩尔比为1:2-1:6；

所用分子筛的用量为10-12％(w/v)。

6.根据权利要求1所述的生物法合成曲酸月桂酸单酯的方法，其特征在于，所述的反应介质为离子液体或有机溶剂；或离子液体与有机溶剂的混合物。

7.根据权利要求6所述的生物法合成曲酸月桂酸单酯的方法，其特征在于，所述的离子液体为三辛烷基甲基季铵盐、氯化-1-烯丙基-3-甲基咪唑盐、1-乙基-3-甲基咪唑乙酸正离子、1-丁基-3-甲基咪唑鎓氯化物、1-羟乙基-3-甲基咪唑四氯硼酸盐、1-羟乙基-3-甲基咪唑十二烷基磺酸盐、1-羟乙基-3-甲基咪唑氯盐、1-羟乙基-3-甲基咪唑硫酸氢盐、1-羟乙基-3-甲基咪唑硝酸盐、及各类含PEG支链的功能离子液体；或上述两种或多种离子液体的混合物。

8.根据权利要求6所述的所述的生物法合成曲酸月桂酸单酯的方法，其特征在于，所述的有机溶剂为叔丁醇、叔戊醇、正己烷、环己烷、异辛烷、丙酮、辛醇、丁醇、十二烷醇、2-甲基-2-丙醇、DMSO；或上述两种或多种有机溶剂的混合物。

9.根据权利要求1所述的生物法合成曲酸月桂酸单酯的方法，其特征在于，反应温度为50～75℃，反应时间为6～48h。

10.一种曲酸月桂酸单酯在制备食品添加剂中的应用，其特征在于，所述的食品添加剂用于抑制单增李斯特菌。