CN106974211A - 一种增强免疫力的海参西洋参枸杞子口服液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种增强免疫力的双参口服液及其制备方法，该口服液含有海参、西洋参、枸杞子、木糖醇、山梨酸钾、纯化水。本发明采用复合酶解和切向流分子截留技术，制备高纯度小分子肽，并复配皂苷、枸杞多糖提取物，制备的口服液活性成分纯度高，效果确切，经细胞学实验和动物实验证实，口服液具有增强免疫力的显著功效，同时实验证实口服液在辅助降血脂、降血糖方面有显著效果。本发明还侧重了环保工艺，将海参蒸煮水回复利用，做到零排放、环境友好，且增强了口服液的综合使用效果。

Description

一种增强免疫力的海参西洋参枸杞子口服液及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药保健领域，具体地说，涉及一种增强免疫力的海参西洋参枸杞子口服液及其制备方法。

背景技术

在当今社会，老龄化趋势显著，并且由于生活节奏加快，工作繁重生活压力大,很多人长期处于生活压力下，或者因年龄、生活习惯、饮食营养等众多原因使身体物质代谢处于不协调的内环境下，处于易疲劳、免疫力低下状态，危害自身健康。

海参具有滋阴补肾、养血益精、增强免疫力和预防心血管疾病等功效，有很高的滋补和药用价值,但是海参中特有的胶原蛋白能够包裹一些蛋白质类营养成分，导致其中的蛋白质有效利用率仅约为20％。海参肽是以鲜活海参为原料，经蛋白酶水解分离纯化后制得的小分子肽为主，多种功效成分共存的蛋白质水解产物，具有溶解性好、吸收率高、生物效价高、食用安全等多种优点。近些年来研究结果表明，海参肽几乎可以被100％吸收利用，且具有抗氧化、降血压、抗肿瘤和提高机体免疫力等功效。传统海参肽制备工艺酶成分单一、制备的肽分子量范围太宽，往往存在大分子、小分子共存，肽段不均一的情况，研究工艺可控、制备高纯度、相对均一的海参肽提取技术具有重要现实意义。

传统海参加工时需要高温煮泡，水煮液富含海参多肽、多糖、脂肪酸、皂苷等高附加值的物质，但是一般都被当成废弃物排放掉，这不仅造成环境污染，也是对海参资源的一种极大浪费。

西洋参含有人参皂苷、挥发油、糖类及多种微量元素等，其中主要有效成分为人参皂苷，具有显著的增强免疫力，抗癌，抗衰老等作用。

枸杞子，又名枸杞，性味甘，平，归肝、肾经，具有滋补肝肾，益精明目的功效，用于虚劳精亏，医膝酸痛，眩晕耳鸣，内热消渴，血虚萎黄，目昏不明。

西洋参性味苦、微甘，寒；有补气养阴，清火生津的功效。海参性味甘咸，微温，有补肾益精，养血润燥的功效。两药合用，可补气养血，益肾润燥，是很好的滋补品。本发明旨在将水生海参和陆生西洋参相结合，并复配枸杞子等主要功能性物质，制备一种增强免疫力的口服液，该口服液吸收利用率高，效果显著，同时考虑了海参加工时废水的循环利用问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种将海参肽、皂苷(海参皂苷和西洋参皂苷)、枸杞多糖工程化提取和海参水煮液回收利用的方法，提取物经复配、灭菌等工艺制备保健口服液。制得的口服液具有易吸收、减轻肠胃负担的特点，同时科学配伍肽、皂苷、多糖成分，可增强免疫力，特别适合老年人、慢性病康复期人群和术后恢复者食用。

本发明的技术方案：

本发明涉及一种海参西洋参双参口服液，其含有海参、西洋参、枸杞子、木糖醇、山梨酸钾、水，其特征在于按照以下重量配制原料：海参40-50g、西洋参 8-13g、枸杞子9-15g、木糖醇8-18g、山梨酸钾0.1-0.4g、水总量1000ml。

一种增强免疫力的双参口服液的制备方法，按照以下步骤制备进行：

1、海参肽提纯

1)前处理：将验收合格的鲜活海参，沿腹部从头至尾全剖开，去除内脏，清洗干净，在水中煮沸5min-45min，蒸煮用水收集留用；

2)脱盐：用粉碎机将海参打成海参糜，用10-20倍体积的纯化水泡发12-18小时脱盐，每3-5小时换水一次，离心分离；

3)均质：向肉糜中加蒸馏水，使海参肉糜与水以1∶3-5的质量比混合，然后利用均质机使海参肉糜与水充分混合；

4)酶解：准确称量占海参肉糜重量3-5％的复合风味蛋白酶，加入海参肉糜水溶液中，在40-60℃的水浴中酶解反应1-4h，整个酶解过程中用搅拌器不断的搅拌得到海参酶解液。

5)分子量截留：将海参酶解液通过5微米、0.22微米滤膜过滤，取滤液利用密理博切向流超滤系统截留分子量小于2000道尔顿的海参肽。

6)灭活：升温至95-100℃，灭酶活10-12min。

2、将西洋参、枸杞子用粉碎机粉碎成100-300目后，加入6-10倍水浸泡4-6h，放入提取罐中水提2次，每次1-2h，药渣弃去，将2次水煎液合并真空浓缩，得浓缩液。

3、海参蒸煮用水经粗滤(200目筛网)、精滤(0.22微米滤膜)、脱盐脱色去重金属(大孔树脂)，煮沸蒸煮5-15min。将木糖醇、山梨酸钾按量加入其中溶解，再将浓缩液、海参肽液加入混合，加入适量水定容，搅拌10-20min。

4、将搅拌均匀的料液通过灌装机进行灌装封口，再用压力蒸汽灭菌柜灭菌，得成品。灭菌温度为115-121℃，压力为0.10-0.13MPa，时间15-20分钟。

本发明的有益效果是：

1.采用复合风味蛋白酶，控制酶解温度，酶解彻底，且酶解液口感好；

2.采用切向流截留技术，获得分子量小于2000道尔顿的海参肽，提取液纯度更高，分子量分布相对集中，疗效更佳可控；

3.运用现代工艺对海参蒸煮用水进行去杂提纯，高温水解制备水解液，发明一种零排放、环境友好型的口服液制备方法。

具体实施方式

以下对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例各组分的重量以总量1000ml计，海参45g、西洋参12g、枸杞子9g、木糖醇12g、山梨酸钾0.18、水余量。

制备步骤如下：

1、海参肽提纯

1)前处理：将验收合格的鲜活海参，沿腹部从头至尾全剖开，去除内脏，清洗干净，在水中煮沸10min，蒸煮用水收集留用；

2)脱盐：用粉碎机将海参打成海参糜，用20倍体积的纯化水泡发12小时脱盐，每3小时换水一次，离心分离；

3)均质：向肉糜中加蒸馏水，使海参肉糜与水以1：3的质量比混合，然后利用均质机使海参肉糜与水充分混合；

4)酶解：准确称量占海参肉糜重量5％的复合风味蛋白酶，加入海参肉糜水溶液中，在40-60℃的水浴中酶解反应1h，整个酶解过程中用搅拌器不断的搅拌得到海参酶解液；

5)分子量截留：将海参酶解液通过5微米、0.22微米滤膜过滤，取滤液利用密理博切向流超滤系统截留分子量小于2000道尔顿的海参肽；

6)灭活：升温至100℃，灭酶活10min。

2、将西洋参、枸杞子用粉碎机粉碎成100目后，加入6倍水浸泡4-6h，放入提取罐中水提2次，每次2h，药渣弃去，将2次水煎液合并真空浓缩，得浓缩液。

3、海参蒸煮用水经粗滤(200目筛网)、精滤(0.22微米滤膜)、脱盐脱色去重金属(大孔树脂)，煮沸蒸煮15min。将木糖醇、山梨酸钾按量加入其中溶解，再将浓缩液、海参肽液加入混合，加入适量水定容，搅拌20min。

4、将搅拌均匀的料液通过灌装机进行灌装封口，再用压力蒸汽灭菌柜灭菌，得成品。灭菌温度为121℃，压力为0.13MPa，时间15分钟。

实施例2

本实施例各组分的重量以总量1000ml计，海参50g、西洋参8g、枸杞子15g、木糖醇8g、山梨酸钾0.3g、水余量。

1、海参肽提纯

1)前处理：将验收合格的鲜活海参，沿腹部从头至尾全剖开，去除内脏，清洗干净，在水中煮沸45min，蒸煮用水收集留用；

2)脱盐：用粉碎机将海参打成海参糜，用15倍体积的纯化水泡发16小时脱盐，每4小时换水一次，离心分离；

3)均质：向肉糜中加蒸馏水，使海参肉糜与水以1:5的质量比混合，然后利用均质机使海参肉糜与水充分混合；

4)酶解：准确称量占海参肉糜重量5％的复合风味蛋白酶，加入海参肉糜水溶液中，在60℃的水浴中酶解反应4h，整个酶解过程中用搅拌器不断的搅拌得到海参酶解液。

5)分子量截留：将海参酶解液通过5微米、0.22微米滤膜过滤，取滤液利用密理博切向流超滤系统截留分子量小于2000道尔顿的海参肽。

6)灭活：升温至95℃，灭酶活10min。

2、将西洋参、枸杞子用粉碎机粉碎成300目后，加入10倍水浸泡6h，放入提取罐中水提2次，每次2h，药渣弃去，将2次水煎液合并真空浓缩，得浓缩液。

3、海参蒸煮用水经粗滤(200目筛网)、精滤(0.22微米滤膜)、脱盐脱色去重金属(大孔树脂)，煮沸蒸煮15min。将木糖醇、山梨酸钾按量加入其中溶解，再将浓缩液、海参肽液加入混合，加入适量水定容，搅拌20min。

4、将搅拌均匀的料液通过灌装机进行灌装封口，再用压力蒸汽灭菌柜灭菌，得成品。灭菌温度为115℃，压力为0.13MPa，时间20分钟。

实施例3

将实施例1制得的口服液进行如下实验，检测其对巨噬细胞吞噬能力的影响，验证其提高非特异性免疫力方面的功效。

1、实验方法

用含10％胎牛血清的1640培养基培养巨噬细胞(Raw264.7)，调整细胞浓度，将其接种于96孔细胞培养板中，使得细胞浓度为2×10⁴个/孔，然后加入不同浓度样品，使被测样终浓度分别为1/1000原液、1/500原液、1/100原液、1/20 原液、1/10原液。以空白培养基为对照。培养24小时之后吸去培养基，用PBS 洗涤多余的培养基，加入0.08％中性红，37℃下，5％CO₂孵育30min，PBS洗净多余中性红，加细胞裂解液(无水乙醇：冰醋酸＝1:1，体积比)，混匀后在酶标仪上540nm处测吸光度值，通过吸光值的大小评价样品促进巨噬细胞吞噬中性红能力。

2、数据统计

吞噬率＝OD样品组/OD空白组

实验结果见下表：

表1：样品对巨噬细胞(Raw264.7)吞噬中性红能力的影响

注：*<0.05**<0.01代表各给药组与阴性对照组比较的结果

结果分析：

样品在1/1000原液、1/500原液时，对巨噬细胞吞噬中性红的能力基本无作用，但是在1/100原液、1/20原液、1/10原液时吞噬能力明显提高，且具有统计学意义。说明样品具有促进非特异性免疫的功能。

实施例4

将实施例2制得的口服液进行动物实验，利用免疫低下小鼠模型验证双参口服液对提高机体免疫力的实际效果。

1、实验方法

动物适应性饲养5d,随机分为6组，每组10只。除正常组外，各组在首次注射地塞米松处理后次日开始给药，隔日腹腔注射地塞米松(40mg/kg·d)，连续 5次，建立免疫低下模型。正常组、模型组灌胃生理盐水，阳性对照组灌胃左旋咪唑(25mg/kg·d,现用现配)，实验组灌胃不同浓度的口服液(5、10和20mL/ kg·d)，即低、中、高剂量组，按照小鼠体质量0.1mL/10g灌胃，连续给药21d。然后分别进行如下实验：

1.1免疫器官重量的测定

于末次给药后次日，称重和处死小鼠，取脾，胸腺，称重。计算小鼠脾指数及胸腺指数。

脾指数＝脾/体重(mg/g)胸腺指数＝胸腺/体重(mg/g)

1.2血液学指标测定

于末次给药后次日，用EDTA抗凝管，眼内眦取血，用全自动血细胞分析仪分析白细胞和淋巴细胞数。

*

1.3血浆免疫球蛋白的测定

小鼠于末次给药后次日，眼内眦取血，分离血浆，按照ELISA试剂盒方法分别测定血浆中抗体IgA、IgG的含量。

1.4碳粒廓清能力的检测

于末次给药后次日，分别称重小鼠。把印度墨汁3倍稀释后，尾静脉注入小鼠体内(0.1ml/10g),注入后第2min和第10min分别从内眦静脉丛取血20μl，并将其加到2mL0.1％Na2CO2中，紫外分光光度计测定600nm处OD值，并且称量小鼠的体重、脾脏和肝脏。计算廓清指数K值及吞噬指数α。

廓清指数K＝(logOD₂—logOD₁₀)/T₁₀—T₂

吞噬指数α＝体重/(肝重+脾重)×K^1/3

2、实验结果

2.1对免疫器官重量影响

由表2可知，给与地塞米松造模后，小鼠脾指数与胸腺指数明显降低 (P<0.01)，与文献报道一致。给与口服液后，与模型组相比，小鼠的脾指数与胸腺指数得到明显恢复。脾指数上，低、中剂量组具有极其显著性差异(P<0.01)，高剂量组有统计学意义(P<0.05)；胸腺指数上，中、高剂量组有统计学意义(P<0.05)。这初步显示口服液能够增强小鼠的免疫功能。

表2口服液对小鼠脾指数及胸腺指数的影响

注：^**P<0.01，与正常组对照组比较；^#P<0.05，^##P<0.01与模型组比较；x±s， n＝10

2.2血液学指标测定

地塞米松是临床常用的免疫抑制剂，能够造成免疫功能低下，引起白细胞数量减少。表3表明，口服液能够抵抗由地塞米松引起的小鼠外周血白细胞数量及淋巴细胞数量减少。相对模型组，中、高剂量能够提高白细胞总数达75％、46％ (P<0.05)。另外，不同剂量组均能够提高淋巴细胞量(P<0.01)。

表3口服液对小鼠外周血白细胞及淋巴细胞的影响

注：^**P<0.01，与正常组对照组比较；^#P<0.05，^##P<0.01与模型组比较；x±s， n＝10

2.3血浆免疫球蛋白的测定

外分泌抗体的水平，反应动物的体液免疫功能。下表显示，不同剂量的口服液能够不同程度的提高免疫低下小鼠抗体IgA和IgG的表达。与模型组相比，其中低、高剂量恢复IgA的效果有显著性差异(P<0.01)，中剂量有统计学差异 (P<0.05)；另外，中剂量显著性恢复IgG的表达(P<0.01)，高剂量的作用效果也具有统计学意义(P<0.05)。这说明，口服液能够改善免疫低下小鼠的体液免疫能力。

表4口服液对小鼠抗体表达的影响

2.4碳粒廓清能力的检测

正常组吞噬细胞的吞噬活性明显高于模型组(P<0.05)，说明模型成功。阳性药左旋咪唑相对于模型组，吞噬能力得到一定程度的恢复(P<0.05)，与文献报道一致。给与口服液组均能够提升地塞米松引起的吞噬活性降低，其中低剂量组差异性显著(P<0.01)，中、高剂量组也有统计学意义(P<0.05)。(表2)上述结果表明，口服液能显著提高免疫功能低下小鼠的非特异性免疫功能。

表5口服液对小鼠炭粒廓清能力的影响

注：^**P<0.01，与正常组对照组比较；^#P<0.05，^##P<0.01与模型组比较；x±s， n＝10

3、结果分析

许多研究表明：海参、西洋参、枸杞子都具有免疫调节能力，但是对于三者混合提取后是否具有类似的活性尚不清楚。本实验中，对三者的提取物，即海参西洋参枸杞子口服液作用于免疫低下小鼠模型，观察其对小鼠免疫能力的调节作用。

结果表明：口服液能增加小鼠免疫器官胸腺及脾的重量；增加小鼠末梢血白细胞尤其淋巴细胞的数量；提高小鼠IgG和IgA抗体分泌的功能；提高小鼠碳粒廓清能力，多途径的提高小鼠的免疫功能。

实施例5

将实施例2制得的口服液利用油酸诱导HepG2细胞模型，验证其在降脂方面的潜在功效。

1、模型说明

本实验利用油酸(Oleic Acid,OA)作用于人肝癌细胞HepG2，导致细胞内脂质堆积，并使用降脂药物辛伐他汀(Simvastatin)作为阳性药，起到降脂效果。油红O染色后通过对比OD₃₅₈来比较化合物降脂效果。本模型可用来筛选潜在的具有降脂活性的化合物。

2、实验方法

取对数生长期HepG2细胞12000个/孔接种于96孔板，100μl/孔；12h后融合度达到70-80％后换成无血清DMEM培养基，每孔80μl，饥饿12h；12h后，空白对照加入20μl无血清培养基，其他组每孔加入诱导剂OA(终浓度80uM)， 10μl/孔；在此基础上，模型组补充10μl无血清培养，给药组加入10μl待测化合物，培养箱孵育24h；24h孵育完毕后，弃掉培养基，用PBS(室温)缓冲液洗 1次，每孔加入80μl 4％多聚甲醛固定液室温固定0.5h，PBS洗1次，60％异丙醇润洗10min后每孔加入60μl 0.3％油红O(Sigma O0625)染液室温染色1h，然后用PBS缓冲液洗3次；用DMSO溶解，100μl/孔，酶标仪358nm处测OD 值。

3、实验结果

表6口服液体外降脂活性结果

结果分析：

通过对比OD₃₅₈，模型(OA)组可明显诱导脂质堆积，阳性药辛伐他汀在10μM能显著性(P<0.01)降低胞内脂质含量，具有统计学意义。待测样品海参肽稀释20倍剂量下，有显著(P<0.05)的降脂效果。

实施例6

将实施例2制得的口服液作用于蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)，通过体外活性抑制实验，验证口服液是否具有提高胰岛素敏感性、辅助降血糖的功效。

1、模型说明

PTP1B是在体内广泛分布的酪氨酸磷酸酶，主要通过对胰岛素受体底物-1 (IRS-1)和胰岛素受体底物-2(IRS-2)的脱磷酸化作用，负向调控胰岛素信号的传导。经过抑制PTP1B的活性，提高胰岛素的敏感性，已经成为治疗Ⅱ型糖尿病和肥胖症的新靶点。

本实验采用MES缓冲液为反应体系，利用人源蛋白酪氨酸磷酸酶1B (PTP1B)，以对硝基苯磷酸二钠(pNPP)为特异性底物，选择原钒酸钠作为阳性药、以DMSO为阴性对照，建立了基于酶反应速率的96孔微板为载体的筛选模型，通过酶学方法寻找PTP1B抑制剂。

2、实验方法

反应采用MES缓冲体系(25mM，pH6.5)，在96孔板内依次加入10μL pNPP (77mM)、86μL MES缓冲液、4μL化合物(2mM)、100μL PTP1B溶液(50 nM)，反应总体积为200μL。每组3个平行，以DMSO为阴性对照，原钒酸钠 (2mM)为阳性对照，25℃下，在摇床上摇动1min，酶标仪上每隔60s读数一次，动态测定5min，测其OD ₄₀₅的变化(OD/min)。每个孔的初始阶段反应速率呈线性相关，动力学曲线线性部分的斜率决定PTP1B的反应速度，以速度表示酶活。化合物对PTP1B的抑制率计算公式：

抑制率(％)＝(ν_DMSO-ν_样本)/ν_DMSO*100

ν_DMSO表示阴性对照组的初始平均反应速率，ν_样本表示化合物的初始平均反应速率。

3、实验结果

海参西洋参枸杞子口服液对PTP1B活性的抑制结果如表7所示：与阴性对照组相比，阳性对照组(原钒酸钠组，原钒酸钠是一种磷酸酶抑制剂)对PTP1B 的抑制率为95.37％(P＜0.01)；对口服液原液稀释20倍后评价其对PTP1B的抑制活性，结果可见1/20原液可以显著抑制PTP1B的酶活，抑制率为80.46％(P ＜0.01)。

由此可推断，按照实施例2制备的口服液可以通过抑制PTP1B酶活，提高胰岛素的敏感性，从而达到辅助降血糖的效果。

表7海参西洋参枸杞子口服液对PTP1B活性的抑制结果

注：与阴性对照组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

结合实施例3-6可以看出，本发明海参西洋参枸杞子口服液具有增强免疫力的显著功效，实验还证明其具有显著的降脂效果，另外，通过提高胰岛素敏感性达到显著的降血糖效果。

以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行更动、润饰或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应属于本发明的权利要求保护范围当中。

Claims (3)

1.一种增强免疫力的海参西洋参枸杞子口服液(以下简称口服液)及其制备方法，其特征在于，它含有海参、西洋参、枸杞子、木糖醇、山梨酸钾、水。

2.根据权利要求1所述，其特征在于，所用原材料均为正规食材、食品级以上质量水平，按照以下重量配制原料：海参40-50g、西洋参8-13g、枸杞子9-15g、木糖醇8-18g、山梨酸钾0.1-0.4g、水总量1000ml。

3.权利要求1所述制备方法，其特征在于，按照以下步骤制备：

1)海参肽提纯

①前处理：将验收合格的鲜活海参，沿腹部从头至尾全剖开，去除内脏，清洗干净，在水中煮沸5min-45min，蒸煮用水收集留用；

②脱盐：用粉碎机将海参打成海参糜，用10-20倍体积的纯化水泡发12-18小时脱盐，每3-5小时换水一次，离心分离；

③均质：向肉糜中加蒸馏水，使海参肉糜与水以1∶3-5的质量比混合，然后利用均质机使海参肉糜与水充分混合；

④酶解：准确称量占海参肉糜重量3-5％的复合风味蛋白酶，加入海参肉糜水溶液中，在40-60℃的水浴中酶解反应1-4h，整个酶解过程中用搅拌器不断的搅拌得到海参酶解液。

⑤分子量截留：将海参酶解液通过5微米、0.22微米滤膜过滤，取滤液利用密理博切向流超滤系统截留分子量小于2000道尔顿的海参肽。

⑥灭活：升温至95-100℃，灭酶活10-12min。

2)将西洋参、枸杞子用粉碎机粉碎成100-300目后，加入6-10倍水浸泡4-6h，放入提取罐中水提2次，每次1-2h，药渣弃去，将2次水煎液合并真空浓缩，得浓缩液。

3)海参蒸煮用水经粗滤(200目筛网)、精滤(0.22微米滤膜)、脱盐脱色去重金属(大孔树脂)，煮沸蒸煮5-15min。将木糖醇、山梨酸钾按量加入其中溶解，再将浓缩液、海参肽液加入混合，加入适量水定容，搅拌10-20min。

4)将搅拌均匀的料液通过灌装机进行灌装封口，再用压力蒸汽灭菌柜灭菌，得成品。灭菌温度为115-121℃，压力为0.10-0.13MPa，时间15-20分钟。