CN106970460B - 基于椭球反射镜的穿透深度可调tirf显微镜与方法 - Google Patents

基于椭球反射镜的穿透深度可调tirf显微镜与方法 Download PDF

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Abstract

本发明基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜与方法属于光学宽场显微成像领域，该装置由基于锥反射镜的环形平行光束发生光路、基于椭球反射镜的照明光路和普通荧光显微成像光路组成，该方法通过调整两互补锥反射镜间距离，实现样品激发深度的改变；本发明利用椭球反射镜的回转特性，提供了对样品的全方位角无阴影照明，消除了常规方案中单向照明带来的“灯塔”状瑕疵，提高了成像质量；利用椭球反射镜大数值孔径的特点，提供了对样品照明入射角从全反射临界角到近90度大范围精细可调的全内反射照明，满足了逐渐兴起的TIRF轴向超分辨三维成像研究对样品激发深度精密可调的需求；最终使得TIRF成像质量和轴向分辨率得到大幅提高。

Description

基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜与方法
技术领域
本发明基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜属于光学宽场显微成像领域和光学TIRF成像技术领域，可广泛适用于生命科学、物理化学和材料科学等领域的研究。
背景技术
TIRF显微镜利用光线全反射后在介质交界面附近产生的倏逝波来激发样品荧光，由于倏逝波的强度沿垂直界面方向上呈指数衰减，故只有靠近界面附近几百纳米的一小薄层样品区域能够被激发，极大地降低了背景光噪声的干扰，因此该技术被广泛地应用于要求高信噪比的技术领域尤其适合研究细胞膜或者膜内附近区域单分子的动态成像过程，如生物单分子研究、细胞信号转导动力学过程的研究等
现有技术方案主要有棱镜型TIRF和基于大NA物镜型TIRF两种。其中前者为早期发展起来的技术，具有结构简单、成本较低、入射角容易控制等优点，但对样品的观察操作比较复杂，目前并未形成成熟的商品型号；而后者是为了便于使用者的操作所做的改进型，虽然其有着光路结构比较复杂、成本较高且入射角难于控制等缺点，但鉴于其装置结构紧凑易于集成到现有显微镜平台、观察操作方便的优点，受到广大用户的热烈欢迎，从而得到迅速发展，目前已具有相关的成熟商品机型。然而，由于该两种技术的商品型方案采用的都是单向照明的方法，都存在着照明阴影带来的成像质量的下降的问题。在单方向照明的情况下，由于激光器光源的相干性通常会产生干涉条纹、灯塔型拖尾等影响照明均匀性的瑕疵，这些瑕疵将较大程度的影响TIRF成像质量，甚至引起对样品成像的失真。为了解决该问题，A.L.Mattheyses在物镜型TIRF中加入一个光楔，并利用光楔的旋转产生一个时间域上的空心照明光锥，通过将各个照明方向下CCD采集到的图像的进行叠加平均，从而良好地抑制了单向照明的带来的问题。雷明通过在物镜型TIRF中引入W型反射镜，在物镜的后焦面产生环形光束，从而利用物镜生成空间域上的空心照明光锥，通过各方向照明的叠加来抑制单向照明的阴影问题。陆续被提出的一些抑制单向照明阴影的方法都是基于这两种原理的，并且都是基于物镜型TIRF方案的改进。
随着TIRF技术的发展并受到日益广泛的关注，众多学者已经开始尝试利用TIRF技术进行轴向超分辨的三维成像的研究，如利用荧光漂白的方法、基于概率重构的方法等。该类研究需要对倏逝波穿透深度精确可调，即要求照明光入射角的范围可调，且可调范围越大越好。然而现有装置大部分都是基于物镜型TIRF的，一方面照明光的入射角范围受物镜结构的限制，最大不超过78度，另一方面由于需要调整照明光入射角，装置结构比较复杂，故采用的方案都为单向照明，此时便引入了照明阴影带来的瑕疵，而且现有调整照明光入射角的结构成本高昂，如使用了扫描振镜系统、声光调制系统等。这些不利因素都不利于良好的TIRF成像效果及相关技术的研究发展。
发明内容
在光学TIRF显微成像技术领域中，针对通常技术手段中存在照明阴影影响成像质量的缺陷和实际应用中需要样品激发深度精密可调的需求，本发明公开了一种基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜与方法，利用椭球反射镜的回转特性，提供了对样品的全方位角无阴影照明，消除了通常技术方案中单向照明带来的“灯塔”状瑕疵，极大的提高了成像质量；利用椭球反射镜大数值孔径的特点，提供了对样品照明入射角从全反射临界角到近90度大范围精细可调的全内反射照明，完美满足了现状中逐渐兴起的TIRF轴向超分辨三维成像研究对样品激发深度精密可调的需求；最终使得TIRF成像质量和轴向分辨率得到大幅提高。
本发明的目的是这样实现的：
一种基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜，由同轴配置的环形平行光束发生光路、照明光路和成像光路组成；
所述的环形平行光束发生光路由依次同轴设置的激光器、孔径光阑、凹型锥面反射镜和凸型锥面反射镜组成，所述凹型锥面反射镜和所述凸型锥面反射镜的间距能够调整；
所述的照明光路由依次同轴设置的聚光透镜、椭球反射镜、半球透镜和光学平板组成，所述聚光镜的后焦点与所述椭球反射镜的远焦点重合，所述半球透镜的球心与所述椭球反射镜的近焦点重合，半球透镜的球面朝向椭球反射镜，光学平板前端面与半球透镜端面用胶紧贴粘合，光学平板的折射率不大于胶的折射率，胶的折射率不大于半球透镜的折射率，半球透镜的球心位于光学平板的后端面；
所述的成像光路由依次同轴设置的成像物镜、滤光片、管镜和图像探测器组成；所述成像物镜的前焦点与椭球反射镜的近焦点重合。
上述基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜，所述的凹型锥面反射镜和凸型锥面反射镜具有相同的锥顶角。
一种在上述基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜上实现的穿透深度可调TIRF显微成像方法，包括以下步骤：
步骤a、将样品密封于下盖玻片和上盖玻片之间，所述下盖玻片的折射率不低于光学平板的折射率；
步骤b、将样品、下盖玻片、油和上盖玻片作为整体，紧贴于光学平板的后端面，且所述下盖玻片与光学平板之间涂有折射率匹配液，所述折射率匹配液的折射率不低于光学平板的折射率；
步骤c、开启激光器，将孔径光阑开到最大，将凸型锥面反射镜与凹型锥面反射镜的间距调到最大，调整成像物镜与样品间的距离，使得图像探测器对样品成像；
步骤d、根据视场要求，将孔径光阑调小，根据对图像探测器采集到的图像强度要求，增大激光器光强，然后逐渐减小凸型锥面反射镜与凹型锥面反射镜的间距，得到穿透深度逐渐减小的TIRF图像；
步骤e、根据凸型锥面反射镜、凹型锥面反射镜、聚光透镜和椭球反射镜的参数，建立凸型锥面反射镜与凹型锥面反射镜的间距与倏逝波穿透深度函数关系数表，即间距与穿透深度关系数表；
步骤f、根据间距与穿透深度关系数表，找到所需要的倏逝波穿透深度对应的凸型锥面反射镜与凹型锥面反射镜的间距值；
步骤g、将凸型锥面反射镜与凹型锥面反射镜的间距调整到步骤f得到的间距值，利用图像探测器采集此时的荧光图像，得到所需穿透深度下的TIRF图像。
上述穿透深度可调TIRF显微成像方法，所述步骤e所述的间距与穿透深度关系数表的建立步骤，具体为：
步骤e1、按照如下公式，由所需穿透深度ddepth计算出所需入射角θ：
其中，λ为波长，n21为样品折射率和下盖玻片折射率的比值；
步骤e2、根据所需入射角θ、椭球反射镜的离心率参数e和所需会聚光锥的会聚角之间的关系，计算出的所需会聚光锥的会聚角值：
步骤e3、按照如下公式，由所需会聚光锥的会聚角计算出所需凹型锥面反射镜和凸型锥面反射镜的反射面距离d：
其中，α为凹型锥面反射镜和凸型锥面反射镜的顶角，f为聚光镜的焦距，进而得到间距与穿透深度关系；
步骤e4、选取不同的穿透深度ddepth，重复步骤d1至步骤d3，完成间距与穿透深度关系数表的建立。
有益效果：
第一、利用椭球反射镜的回转特性，实现了传统技术途径中较难实现的对样品的全方位角无阴影照明，消除了通常技术方案中单向照明带来的“灯塔”状瑕疵，极大的提高了成像质量；
第二、利用椭球反射镜大数值孔径的特性，克服了传统物镜型TIRF照明角范围受物镜结构的限制和传统棱镜型TIRF照明角范围受棱镜结构的限制，将最大照明角由72度提高近90度，这将对TIRF三维成像的轴向分辨率有较大提升；
第三、能够在实现对样品的全方位无阴影照明的同时，实现穿透深度的大范围调整；
第四、利用椭球反射镜的对光线的会聚作用，将传统TIRF照明方案中大面积平行光照明变成覆盖视场范围的会聚照明，极大地减小了视场外的无效照明能量，大幅提高了照明的光能利用率，同时由于锥面反射镜和椭球面反射镜光能损失小的特点，使得系统对照明激光的功率要求降低了近10倍；
第五、利用一组互补锥面反射镜的间距调整实现照明角的角度调整，集成化度高，操作简便，利于精确控制照明角度；
第六、反射型光路，照明激光波长不受声光调制器等器件的透光波长的限制；
第七、装置结构简单紧凑，成本较低，易于集成到现有显微镜平台上。
附图说明
图1是本发明基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜的结构示意图。
图2是采用传统棱镜型方法单向照明时对直径5微米的小球的成像结果。
图3是采用本发明方法全方向无阴影照明时对直径5微米的小球的成像结果。
图4是三种方法中照明光入射角与倏逝波穿透深度关系仿真图。
图中：1激光器、2孔径光阑、3凹型锥面反射镜、4凸型锥面反射镜、5聚光透镜、6椭球反射镜、7半球透镜、8光学平板、9样品、10成像物镜、11滤光片、12管镜、13图像探测器。
具体实施例
下面结合附图对本发明具体实施例做进一步详细描述。
具体实施例一
本实施例是基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜实施例。
本实施例的基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜，结构示意图如图1所示。该显微镜由同轴配置的环形平行光束发生光路、照明光路和成像光路组成；
所述的环形平行光束发生光路由依次同轴设置的激光器1、孔径光阑2、凹型锥面反射镜3和凸型锥面反射镜4组成，所述凹型锥面反射镜3和所述凸型锥面反射镜4的间距能够调整；
所述的照明光路由依次同轴设置的聚光透镜5、椭球反射镜6、半球透镜7和光学平板8组成，所述聚光镜5的后焦点与所述椭球反射镜6的远焦点重合，所述半球透镜7的球心与所述椭球反射镜6的近焦点重合，半球透镜7的球面朝向椭球反射镜6，光学平板8前端面与半球透镜7端面用胶紧贴粘合，光学平板8的折射率不大于胶的折射率，胶的折射率不大于半球透镜7的折射率，半球透镜7的球心位于光学平板8的后端面；
所述的成像光路由依次同轴设置的成像物镜10、滤光片11、管镜12和图像探测器13组成；所述成像物镜10的前焦点与椭球反射镜6的近焦点重合。
利用该显微装置对直径5微米的小球，采用传统棱镜型方法单向照明时和采用本发明基于椭球反射镜型方法全方向无阴影照明时的对比成像结果如图2和图3所示，显然无阴影照明情况下的成像结果更真实反映了微球的圆形形态，体现了本装置提供的无阴影照明的显著优势。
具体实施例二
本实施例是基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜实施例。
本实施例的基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜，在具体实施例一的基础上，进一步限定所述的凹型锥面反射镜3和凸型锥面反射镜4具有相同的锥顶角。
具体实施例三
本实施例是基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微成像方法实施例。
本实施例的基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微成像方法，在具体实施例一或具体实施例二所述的基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜上实现。该显微成像方法包括以下步骤：
步骤a、将样品9密封于下盖玻片和上盖玻片之间，所述下盖玻片的折射率不低于光学平板8的折射率；
步骤b、将样品9、下盖玻片、油和上盖玻片作为整体，紧贴于光学平板8的后端面，且所述下盖玻片与光学平板8之间涂有折射率匹配液，所述折射率匹配液的折射率不低于光学平板8的折射率；
步骤c、开启激光器1，将孔径光阑2开到最大，将凸型锥面反射镜4与凹型锥面反射镜3的间距调到最大，调整成像物镜10与样品9间的距离，使得图像探测器13对样品9成像；
步骤d、根据视场要求，将孔径光阑2调小，根据对图像探测器13采集到的图像强度要求，增大激光器1光强，然后逐渐减小凸型锥面反射镜4与凹型锥面反射镜3的间距，得到穿透深度逐渐减小的TIRF图像；
步骤e、根据凸型锥面反射镜4、凹型锥面反射镜3、聚光透镜5和椭球反射镜6的参数，建立凸型锥面反射镜4与凹型锥面反射镜3的间距与倏逝波穿透深度函数关系数表，即间距与穿透深度关系数表；
步骤f、根据间距与穿透深度关系数表，找到所需要的倏逝波穿透深度对应的凸型锥面反射镜4与凹型锥面反射镜3的间距值；
步骤g、将凸型锥面反射镜4与凹型锥面反射镜3的间距调整到步骤f得到的间距值，利用图像探测器13采集此时的荧光图像，得到所需穿透深度下的TIRF图像。
具体实施例四
本实施例是基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微成像方法实施例。
本实施例的基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微成像方法，在具体实施例三的基础上，进一步限定所述步骤e所述的间距与穿透深度关系数表的建立步骤，具体为：
步骤e1、按照如下公式，由所需穿透深度ddepth计算出所需入射角θ：
其中，λ为波长，n21为样品9折射率和下盖玻片折射率的比值；
步骤e2、根据所需入射角θ、椭球反射镜6的离心率参数e和所需会聚光锥的会聚角之间的关系，计算出的所需会聚光锥的会聚角值：
步骤e3、按照如下公式，由所需会聚光锥的会聚角计算出所需凹型锥面反射镜3和凸型锥面反射镜4的反射面距离d：
其中，α为凹型锥面反射镜3和凸型锥面反射镜4的顶角，f为聚光镜5的焦距，进而得到间距与穿透深度关系；
步骤e4、选取不同的穿透深度ddepth，重复步骤d1至步骤d3，完成间距与穿透深度关系数表的建立。
按照步骤e1公式，对传统基于棱镜型TIRF方法、传统基于物镜型TIRF方法和本发明基于椭球反射镜型TIRF方法中照明光入射角与倏逝波穿透深度关系进行仿真，得到仿真结果如图4所示，其中棱镜型方法中棱镜的折射率、物镜型方法中物镜镜油的折射率和基于椭球方法中光学平板和半球的折射率相同，都取1.518，样品折射率取1.33，激光波长为532nm。图中三条蓝色细实线型竖线代表了三种方法所能实现的的照明光的最大入射角，棱镜型TIRF照明光入射角的可调范围61.2度到72.8度，物镜型TIRF照明光入射角的可调范围是61.2度到79度(物镜NA取1.49)，基于椭球方法的照明光入射角的可调范围是61.2度到近90度。
该图表明本发明克服了传统物镜型TIRF照明角范围受物镜结构的限制和传统棱镜型TIRF照明角范围受棱镜结构的限制，将最大照明角由72度提高到近90度，这将对TIRF三维成像的轴向分辨率有较大提升，并能够实现穿透深度的大范围调整。

Claims (3)

1.一种基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜，其特征在于，由同轴配置的环形平行光束发生光路、照明光路和成像光路组成；
所述的环形平行光束发生光路由依次同轴设置的激光器(1)、孔径光阑(2)、凹型锥面反射镜(3)和凸型锥面反射镜(4)组成，所述凹型锥面反射镜(3)和所述凸型锥面反射镜(4)的间距能够调整；凹型锥面反射镜(3)和凸型锥面反射镜(4)具有相同的锥顶角；
所述的照明光路由依次同轴设置的聚光透镜(5)、椭球反射镜(6)、半球透镜(7)和光学平板(8)组成，所述聚光透镜(5)的后焦点与所述椭球反射镜(6)的远焦点重合，所述半球透镜(7)的球心与所述椭球反射镜(6)的近焦点重合，半球透镜(7)的球面朝向椭球反射镜(6)，光学平板(8)前端面与半球透镜(7)端面用胶紧贴粘合，光学平板(8)的折射率不大于胶的折射率，胶的折射率不大于半球透镜(7)的折射率，半球透镜(7)的球心位于光学平板(8)的后端面；
所述的成像光路由依次同轴设置的成像物镜(10)、滤光片(11)、管镜(12)和图像探测器(13)组成；所述成像物镜(10)的前焦点与椭球反射镜(6)的近焦点重合。
2.一种在权利要求1所述基于椭球反射镜的穿透深度可调TIRF显微镜上实现的穿透深度可调TIRF显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a、将样品(9)密封于下盖玻片和上盖玻片之间，所述下盖玻片的折射率不低于光学平板(8)的折射率；
步骤b、将样品(9)、下盖玻片、油和上盖玻片作为整体，紧贴于光学平板(8)的后端面，且所述下盖玻片与光学平板(8)之间涂有折射率匹配液，所述折射率匹配液的折射率不低于光学平板(8)的折射率；
步骤c、开启激光器(1)，将孔径光阑(2)开到最大，将凸型锥面反射镜(4)与凹型锥面反射镜(3)的间距调到最大，调整成像物镜(10)与样品(9)间的距离，使得图像探测器(13)对样品(9)成像；
步骤d、根据视场要求，将孔径光阑(2)调小，根据对图像探测器(13)采集到的图像强度要求，增大激光器(1)光强，然后逐渐减小凸型锥面反射镜(4)与凹型锥面反射镜(3)的间距，得到穿透深度逐渐减小的TIRF图像；
步骤e、根据凸型锥面反射镜(4)、凹型锥面反射镜(3)、聚光透镜(5)和椭球反射镜(6)的参数，建立凸型锥面反射镜(4)与凹型锥面反射镜(3)的间距与倏逝波穿透深度函数关系数表，即间距与穿透深度关系数表；
步骤f、根据间距与穿透深度关系数表，找到所需要的倏逝波穿透深度对应的凸型锥面反射镜(4)与凹型锥面反射镜(3)的间距值；
步骤g、将凸型锥面反射镜(4)与凹型锥面反射镜(3)的间距调整到步骤f得到的间距值，利用图像探测器(13)采集此时的荧光图像，得到所需穿透深度下的TIRF图像。
3.根据权利要求2所述的穿透深度可调TIRF显微成像方法，其特征在于，所述步骤e所述的间距与穿透深度关系数表的建立步骤，具体为：
步骤e1、按照如下公式，由所需穿透深度ddepth计算出所需入射角θ：
其中，λ为波长，n21为样品(9)折射率和下盖玻片折射率的比值；
步骤e2、根据所需入射角θ、椭球反射镜(6)的离心率参数e和所需会聚光锥的会聚角之间的关系，计算出的所需会聚光锥的会聚角值：
步骤e3、按照如下公式，由所需会聚光锥的会聚角计算出所需凹型锥面反射镜(3)和凸型锥面反射镜(4)的反射面距离d：
其中，α为凹型锥面反射镜(3)和凸型锥面反射镜(4)的顶角，f为聚光透镜(5)的焦距，进而得到间距与穿透深度关系；
步骤e4、选取不同的穿透深度ddepth，重复步骤d1至步骤d3，完成间距与穿透深度关系数表的建立。
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