CN106954884A - 一种固定化酵母菌制备烟用菠萝提取物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种固定化酵母菌制备烟用菠萝提取物的方法，包括以下步骤：(1)取新鲜菠萝，榨汁，(2)配制酵母菌菌悬液，(3)采用海藻酸钠‑CaCl2将酵母菌固定化，(4)将固定化酵母菌与菠萝汁进行发酵反应，(5)将发酵液过滤，得澄清发酵液，经过醇沉，减压浓缩后得菠萝提取物。本发明以菠萝为原料，利用固定化酵母菌发酵菠萝汁，获得了一种品质优良的烟用菠萝提取物，该提取物在卷烟中具有丰富烟香，透发烟香，增加果甜香韵，增加烟气生津感，柔和细腻烟气，减轻喉部刺激性等作用。

Description

一种固定化酵母菌制备烟用菠萝提取物的方法
技术领域
本发明涉及烟用添加剂领域，具体涉及利用固定化酵母菌制备烟用菠萝提取物的制备方法。
背景技术
加香加料是卷烟工艺中的关键环节，是完善产品风格的决定因素和提高卷烟香气质量的有效手段之一。目前烟用香精香料主要还是通过对天然动植物的提取、化学合成制备。由于受到天然植物资源有限以及化学合成条件较苛刻限制。随着生物技术的发展，近年来，利用微生物发酵法制备烟用香原料，为烟用香原料的生产提供一条经济、高效的途径，开发一些传统方法无法生产的新型烟用香原料。
微生物固定化技术，是将特选的微生物固定在选证的载体上，使其高度密集并保持生物活性，在适应条件下能够快速、大量增殖的生物技术，能够弥补悬浮微生物发酵处理效率低、固液分离困难、抗毒性差等缺点。因此，近年来，微生物固定化技术的研究非常活跃，发展较快，已应用到许多工业部门如食品发酵工业，环境保护，新能源开发以及生物传感器等，并取得了深入发展，显示出了强大的优越性。主要涉及到以下几个方面：在食品发酵工业中用于生产乙醇、啤酒、酸奶等；在环境保护中用于环境监测和工业废水的处理；在新能源开发中用于生产氢气、甲烷、生化电池、微生物电池等；固定化微生物还可作为分子识别元件，用于制作各种生物传感器。而随着固定微生物技术的不断成熟、完善，逐渐向高效低能耗、低成本、简单化、安全自动化、无污染等方向发展，在能源危机、资源短缺、环境污染日趋严重的情况下，由此将推动其在废水处理方面更加深入和广泛的应用，具有更加深远的意义。尤其在废水处理方面，具有很大的应用前景。但在利用微生物固定化技术制备烟用菠萝提取物却未见报道。
菠萝(学名：Ananas comosus)是著名的热带水果之一，为凤梨科凤梨属植物，原产于南美洲巴西、巴拉圭的亚马逊河流一带，16世纪从巴西传入中国，其可食部分主要由肉质增大之花序轴、螺旋状排列于外周的花组成，花通常不结实，宿存的花被裂片围成一个空腔，腔内藏着猥琐的雄蕊和花柱。菠萝中含有大量的糖苷类物质，这些糖苷类物质是形成菠萝香气的前体物质。湖南中烟提供了用菠萝皮多糖在卷烟中的应用的专利，专利中报道了菠萝皮多糖在卷烟中具有增香、增甜、生津和减轻喉部刺激性的作用。
酵母菌是一些单细胞真菌，是子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称，一般泛指能发酵糖类的真菌，可用于酿造生产，该菌在发酵过程中能产生乙酸乙酯、苯乙醇等香气物质，这些香气物质能够赋予卷烟特征的甜香香气，是一种生产烟用香料的优质产香菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种固定化酵母菌制备烟用菠萝提取物的方法，利用固定化微生物技术，开发了一种新型的菠萝提取物。
一种固定化酵母菌制备烟用菠萝提取物的方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜菠萝，去除果皮，榨汁，121℃下灭菌20min，冷却，过滤得到菠萝汁；
(2)酵母菌菌悬液配制：将酵母菌接种到肉汤培养基中，在温度37℃、搅拌转速为50rpm的条件下培养48h，取培养液于8000rpm下离心，离心后的湿菌体备用；
(3)酵母菌的海藻酸钠-CaCl2固定化：配制质量分数为3％～6％的海藻酸钠溶液，然后加入其体积的3％～5％的所述步骤(2)中制备的酵母菌湿菌体，配制成混合液，用蠕动泵经过1～5mm孔径的针头将配制好的混合液逐滴加入到质量分数为3％～6％的CaCl2溶液中，成球，并将CaCl2溶液和小球保存于-4℃条件下12～24h，取出小球，用无菌水冲洗，烘干备用；
(4)将菠萝汁与步骤(3)中制备的固定化酵母菌小球按照质量比2:1～5:1混合，在温度为28～37℃，搅拌转速为1～5rpm的条件下发酵12～24h；然后置于10℃冷柜中保存3～5d，然后于常温下放置1～2d；
(5)将步骤(4)发酵后发酵液过滤，得澄清发酵液，加入其质量2～4倍的80％～95％酒精溶液，沉淀24～48h，过滤取上清液减压浓缩至相对密度为1.20～1.30，得菠萝提取物。
本发明中采用的酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HHL-1，于2009年11月20日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 209272。
进一步的，所述步骤(2)中肉汤培养基的具体配方为(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，最终pH7.3±0.1。
进一步的，所述步骤(5)中减压浓缩的条件：浓缩压力0.1MPa，浓缩温度45℃。
本发明采用的微生物固定化技术具有发酵处理效率高、固液分离容易、抗毒性强等优点，能够弥补传统生物工艺的不足。
本发明以菠萝为原料，利用固定化酵母菌发酵菠萝提取物，获得了一种品质优良的烟用菠萝提取物，该提取物在卷烟中具有丰富烟香，透发香气，增加果香、甜香韵，增加甜感、生津感，降低刺激性等作用。与现有菠萝浸膏和菠萝提取物相比，该菠萝提取物在卷烟中香气更加丰富，果香韵和甜香韵更加明显；与悬浮酵母菌发酵相比，该方法制备的菠萝提取物中酯类香气物质含量增加了12.51％～18.27％，苯乙醇含量增加了20.21％～25.34％，卷烟效果评价中，口腔余味更加舒适，香气更加丰富。该方法替代了菠萝提取物传统的提取技术，更新了生物发酵制备工艺，使得其能够在卷烟中适用性增加，对烟用菠萝提取物的制备提供了一条新途径。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细的描述。
实施例1
(1)取新鲜菠萝，去除果皮，榨汁，121℃下灭菌20min，冷却，过滤得到菠萝汁；
(2)酵母菌菌悬液配制：将酵母菌接种到肉汤培养基中，肉汤培养基的具体配方为(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，最终pH7.3±0.1，在温度37℃、搅拌转速为50rpm的条件下培养48h，取培养液于8000rpm下离心，离心后的湿菌体备用；
(3)酵母菌的海藻酸钠-CaCl2固定化：配制质量分数为4％的海藻酸钠溶液，然后加入其体积的3％的所述步骤(2)中制备的酵母菌湿菌体，配制成混合液，用蠕动泵经过1mm孔径的针头将配制好的混合液逐滴加入到质量分数为3％的CaCl2溶液中，成球，并将CaCl2溶液和小球保存于-4℃条件下16h，取出小球，用无菌水冲洗，烘干备用；
(4)将菠萝汁与步骤(3)中制备的固定化酵母菌小球按照质量比2:1混合，在温度为30℃，搅拌转速为5rpm的条件下发酵14h；然后置于10℃冷柜中保存4d，然后于常温下放置1d；
(5)将步骤(4)发酵后发酵液过滤，得澄清发酵液，加入其质量2倍的80％酒精溶液，沉淀28h，过滤取上清液，在压力0.1MPa，温度45℃下将其减压浓缩至相对密度为1.22，得菠萝提取物。
实施例2
(1)取新鲜菠萝，去除果皮，榨汁，121℃下灭菌20min，冷却，过滤得到菠萝汁；
(2)酵母菌菌悬液配制：将酵母菌接种到肉汤培养基中，肉汤培养基的具体配方为(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，最终pH7.3±0.1，在温度37℃、搅拌转速为50rpm的条件下培养48h，取培养液于8000rpm下离心，离心后的湿菌体备用；
(3)酵母菌的海藻酸钠-CaCl2固定化：配制质量分数为5％的海藻酸钠溶液，然后加入其体积的4％的所述步骤(2)中制备的酵母菌湿菌体，配制成混合液，用蠕动泵经过3mm孔径的针头将配制好的混合液逐滴加入到质量分数为4％的CaCl2溶液中，成球，并将CaCl2溶液和小球保存于-4℃条件下20h，取出小球，用无菌水冲洗，烘干备用；
(4)将菠萝汁与步骤(3)中制备的固定化酵母菌小球按照质量比3:1混合，在温度为34℃，搅拌转速为4rpm的条件下发酵18h；然后置于10℃冷柜中保存5d，然后于常温下放置1.5d；
(5)将步骤(4)发酵后发酵液过滤，得澄清发酵液，加入其质量3倍的85％酒精溶液，沉淀30h，过滤取上清液，在压力0.1MPa，温度45℃下将其减压浓缩至相对密度为1.26，得菠萝提取物。
实施例3
(1)取新鲜菠萝，去除果核，榨汁，121℃下灭菌20min，冷却，过滤得到菠萝汁；
(2)酵母菌菌悬液配制：将酵母菌接种到肉汤培养基中，肉汤培养基的具体配方为(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，最终pH7.3±0.1，在温度37℃、搅拌转速为50rpm的条件下培养48h，取培养液于8000rpm下离心，离心后的湿菌体备用；
(3)酵母菌的海藻酸钠-CaCl2固定化：配制质量分数为5％的海藻酸钠溶液，然后加入其体积的5％的所述步骤(2)中制备的酵母菌湿菌体，配制成混合液，用蠕动泵经过4mm孔径的针头将配制好的混合液逐滴加入到质量分数为6％的CaCl2溶液中，成球，并将CaCl2溶液和小球保存于-4℃条件下24h，取出小球，用无菌水冲洗，烘干备用；
(4)将菠萝汁与步骤(3)中制备的固定化酵母菌小球按照质量比5:1混合，在温度为36℃，搅拌转速为2rpm的条件下发酵22h；然后置于10℃冷柜中保存3d，然后于常温下放置2d；
(5)将步骤(4)发酵后发酵液过滤，得澄清发酵液，加入其质量4倍的90％酒精溶液，沉淀40h，过滤取上清液，在压力0.1MPa，温度45℃下将其减压浓缩至相对密度为1.30，得菠萝提取物。
上述实施例中制备的菠萝提取物具有丰富烟香，提升卷烟香气质量，增加卷烟香气透发性，增加烟气生津感，增加烟气甜润感，柔和细腻烟气，降低刺激性，改善喉部舒适性，掩盖杂气，改善余味等作用。
对比实验，申请人将本发明制备的菠萝提取物与现有传统提取方法制备的菠萝提取物、采用悬浮酵母菌发酵制备的菠萝提取物按照正常加香方式添加到烟丝中，制成卷烟，并进行评吸，其评吸效果如表1所示：
表1三种不同工艺制备的菠萝提取物在卷烟中的感官评价效果比较
从上述对比实验可以看出来，本发明中制备的菠萝提取物添加到卷烟中效果更好，而且根据具体实验分析发现，与悬浮酵母菌发酵相比，该方法制备的菠萝提取物中酯类香气物质含量增加了12.51％～18.27％，苯乙醇含量增加了20.21％～25.34％，，卷烟效果评价中，香气更加丰富，果甜香韵更加明显，口腔余味更加舒适。
以上所述仅为本发明的具体实施方案的详细描述，并不以此限制本发明，凡在本发明的设计思路上所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种固定化酵母菌制备烟用菠萝提取物的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取新鲜菠萝，去除果皮，榨汁，121℃下灭菌20min，冷却，过滤得到菠萝汁；
(2)酵母菌菌悬液配制：将酵母菌接种到肉汤培养基中，在温度37℃、搅拌转速为50rpm的条件下培养48h，取培养液于8000rpm下离心，离心后的湿菌体备用；
(3)酵母菌的海藻酸钠-CaCl2固定化：配制质量分数为3％～6％的海藻酸钠溶液，然后加入其体积的3％～5％的所述步骤(2)中制备的酵母菌湿菌体，配制成混合液，用蠕动泵经过1～5mm孔径的针头将配制好的混合液逐滴加入到质量分数为3％～6％的CaCl2溶液中，成球，并将CaCl2溶液和小球保存于-4℃条件下12～24h，取出小球，用无菌水冲洗，烘干备用；
(4)将菠萝汁与步骤(3)中制备的固定化酵母菌小球按照质量比2:1～5:1混合，在温度为28～37℃，搅拌转速为1～5rpm的条件下发酵12～24h；然后置于10℃冷柜中保存3～5d，然后于常温下放置1～2d；
(5)将步骤(4)发酵后发酵液过滤，得澄清发酵液，加入其质量2～4倍的80％～95％酒精溶液，沉淀24～48h，过滤取上清液减压浓缩至相对密度为1.20～1.30，得菠萝提取物。
2.根据权利要求1所述的固定化酵母菌制备烟用菠萝提取物的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HHL-1，保藏编号为CCTCCNO:M 209272。
3.根据权利要求1所述的固定化酵母菌制备烟用菠萝提取物的方法，其特征在于：所述步骤(2)中肉汤培养基的具体配方为(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，最终pH7.3±0.1。
4.根据权利要求1所述的固定化酵母菌制备烟用菠萝提取物的方法，其特征在于：所述步骤(5)中减压浓缩的条件：浓缩压力0.1MPa，浓缩温度45℃。
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