CN106913904B - 一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架及其制备方法。该具有免疫治疗功能的支架是由静电纺纤维支架表面通过表面活化改性嫁接接枝抗体制备而成。制备方法包括以下步骤：（1）静电纺丝支架的制备；（2）静电纺丝支架的表面活化改性；（3）抗体的接枝。通过静电纺丝支架表面接枝抗体，一方面通过抗体的释放直接诱导肿瘤细胞的凋亡，同时抗体释放可诱导肿瘤微环境中树突状细胞活化，激发特异性免疫应答，释放细胞因子和活化杀伤性T细胞杀伤肿瘤，间接实现抑制肿瘤细胞生长效应；另一方面释放抗体后的支架，为组织再生提供固相载体，诱导新生组织再生。最终实现生物支架的免疫调节抑制肿瘤和促进新组织再生的双重功能。

Description

一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及医用材料领域，具体涉及一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架及其制备方法。
背景技术
以抗体为主的免疫治疗指的是通过抗体调控机体免疫系统，增强或抑制免疫应答能力，治疗疾病的一种方法。肿瘤免疫治疗通过调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。相反，通过特异性抗体抑制免疫应答来治疗自身免疫性疾病也是抗体应用的重要领域。目前抗体靶向治疗已在白血病、胃癌、肺癌等肿瘤患者和类风湿关节炎患者广泛应用。相对于化学药物治疗肿瘤，抗体治疗肿瘤具有特异性好，毒副作用相对较小，可预测、可依从性好,激活自体免疫系统发挥疗效等优点。但是由于肿瘤具有极大的异质性和遗传的不稳定性，单纯使用抗体难以达到理想的效果。为了提高抗体在临床中的应用，研究人员已经将单抗、细胞因子和化疗药物等联合应用，通过静脉、腹腔等注射方式进入体内以诱导有效的免疫反应，增强对肿瘤的杀伤力。然而，由于抗体半衰期短，弥散速度快，难于作用在局部，会降低治疗肿瘤的效果；同时存在使用剂量高，造成全身副作用、经济负担重等缺点。因此，如何将高浓度抗体局限于实体肿瘤局部发挥效应成为当前肿瘤治疗的难点。此外，肿瘤治疗过程中新组织的再生和重建，是加快原位组织修复的一个过程。因此，如何开发一种具有免疫肿瘤治疗和原位新生组织重建的治疗方法，具有治疗和重建的综合性功能。
生物支架具有细胞外基质替代的作用，能为正常细胞体外生长提供三维支架，还可以通过支架上装载药物实现局部疾病治疗，从而达到疾病治疗、组织再生等联合作用效果。静电纺丝微纳米纤维具有比表面积大、三维微纳米结构、灵活载药方式等，已经在组织重建、再生、疾病治疗等方面得到了广泛的研究。近期，采用静电纺纤维相关的免疫治疗已经有相关研究，例如Ma等通过氧化处理方法在静电纺纤维表面共价吸附蛋白A/G来募集抗体。Lu等通过过滤，利用抗体抗原之间的相互作用使抗体固定在静电纺纤维表现。目前，静电纺丝携载抗体的方法主要是表面吸附，然后这些装载存在装载量低、活性保持效率低以及后期灭菌等过程容易使得抗体失活等缺点。从而，难于实现抗体的高效的免疫治疗。
发明内容
要解决的技术问题：本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种免疫治疗功能的微纳米组织工程支架，抗体装载量高、活性保持率高、不易失活，具有免疫调节抑制肿瘤和促进新组织再生的双重功能。
技术方案：一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架，由静电纺纤维支架表面通过表面活化改性嫁接接枝抗体制备而成。
进一步的，所述的一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架，所述的静电纺纤维支架通过聚乳酸PLLA、乳酸-羟基乙酸的共聚物PLGA、聚己内酯PCL中的任一种纺丝原料制备而成。
进一步的，所述的一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架，所述的抗体为具有免疫调节作用的IgG类抗体。
进一步的，所述的一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架，所述的具有免疫调节作用的IgG类抗体为CD40抗体、CD28抗体、或CD80抗体。
进一步的，所述的一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）静电纺丝支架的制备：通过静电纺丝装置进行静电纺丝，制备静电纺纤维支架；
（2）静电纺纤维支架的表面活化改性：将静电纺纤维支架浸通过等离子处理表面活化引入羟基，得到羧基官能团化的静电纺纤维支架；或者在纺丝液中加入硅烷偶联剂共混纺丝后，用己二胺/正丙醇溶液处理得到氨基官能团化的静电纺纤维支架；或者将静电纺纤维支架放入含有多巴胺盐酸盐的缓冲溶液中，进行多巴胺表面处理；
（3）抗体的接枝：将表面的改性的静电纺纤维支架洗净阴干，再将静电纺纤维支架浸泡在抗体溶液中，在静电纺纤维支架上接枝抗体，反应后取出清洗即可。
进一步优选的，所述的一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）静电纺丝支架的制备：将纺丝原料分别溶解于二氯甲烷和N’N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，其中纺丝原料：二氯甲烷：N’N-二甲基甲酰胺的质量比为0.2-5:1.5-15:1-10，溶解完全后通过静电纺丝装置进行静电纺丝，制备静电纺纤维支架；
（2）静电纺纤维支架的等离子体表面改性：将静电纺纤维支架进行等离子体处理，将等离子处理仪内室压升至10-3Torr，以0.2-0.3Torr注入氧气以及气态丙烯酸，并且施加射频功率50-60W以及负极脉冲电压维持30-40s，得到羧基官能团化的静电纺纤维支架；
（3）抗体的接枝：将表面的改性的静电纺纤维支架洗净阴干，再将静电纺纤维支架浸泡在1-20ug/50ul抗体溶液中，在静电纺纤维支架上接枝抗体，在4℃下反应12-24h，反应后取出清洗即可。
进一步优选的，所述的一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）静电纺纤维支架的制备：将纺丝原料分别溶解于二氯甲烷和N’N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，其中纺丝原料：二氯甲烷：N’N-二甲基甲酰胺的质量比为0.2-5:1.5-15:1-10，溶解完全后加入硅烷偶联剂KH550，继续搅拌均匀，通过静电纺丝装置进行静电纺丝，制备静电纺纤维支架；
（2）静电纺纤维支架的偶联剂表面改性：将静电纺纤维支架浸泡于己二胺/正丙醇混合溶液中25℃振荡10分钟后，其中乙二胺和正丙醇的质量比为0.2-1:10，用乙醇和去离子水反复清洗并真空干燥，得到氨基官能团化的静电纺纤维支架；
（3）抗体的接枝：将静电纺纤维支架浸泡在1-20ug/50ul抗体溶液中，在静电纺纤维支架上接枝抗体，在4℃下反应12-24h，反应后取出清洗即可。
进一步的，所述的一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架的制备方法，所述的步骤（1）中加入的硅烷偶联剂KH550，其质量为PLLA、PLGA、PCL质量的5-15wt%。
进一步优选的，所述的一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）静电纺纤维支架的制备：将纺丝原料分别溶解于二氯甲烷和N’N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，其中纺丝原料：二氯甲烷：N’N-二甲基甲酰胺的质量比为0.2-5:1.5-15:1-10，溶解完全后通过静电纺丝装置进行静电纺丝，制备静电纺纤维支架；
（2）静电纺纤维支架的等离子体表面改性：将多巴胺盐酸盐加入10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，使得多巴胺盐酸盐的缓冲溶液的浓度为2mg/mL，保持溶液的pH在8.5，然后每5份的多巴胺盐酸盐缓冲溶液中加入1份的无水乙醇，搅拌均匀得到混合溶液，将静电纺纤维支架放入混合溶液中，室温下密闭反应12-48h；
（3）抗体的接枝：将表面的改性的静电纺纤维支架洗净阴干，再将纤维支架浸泡在1-20ug/50ul抗体溶液中，在静电纺纤维支架上接枝抗体，在4℃下反应12-24h，反应后取出清洗即可。
有益效果：本发明通过表面活化改性桥梁嫁接技术，在温和的水环境中实现静电纺纤维支架表面接枝抗体，一方面通过抗体的释放直接诱导肿瘤细胞的凋亡，同时抗体释放可诱导肿瘤微环境中树突状细胞（DC）活化，激发特异性免疫应答，释放细胞因子和活化杀伤性T细胞（CTL），间接实现抑制肿瘤细胞生长效应；另一方面释放抗体后的支架，为组织再生提供固相载体，诱导新生组织再生。最终实现生物支架的免疫调节抑制肿瘤和促进新组织再生的双重功能。
附图说明
图1本发明具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架构建示意图；
图2 本发明实施例5-7中PLLA静电纺纤维支架通过多巴胺接枝CD40抗体为接枝流程示意图；
图3本发明实施例7中PPLLA静电纺纤维支架通过多巴胺接枝CD40抗体为接枝抗体前后的扫描电镜图（右上角为接触角图），其中i为PLLA，ii为PLLA-PDA，iii为PLLA-PDA-IgG，ⅳ为PLLA-PDA-CD40mAb；
图4 本发明实施例7中PLLA静电纺纤维支架通过多巴胺接枝CD40抗体为接枝抗体前后的X射线光电子能谱分析，其中i为PLLA，ii为PLLA-PDA，iii为PLLA-PDA-IgG，ⅳ为PLLA-PDA-CD40mAb；
图5 本发明实施例7中PLLA静电纺纤维支架通过多巴胺接枝CD40抗体为接枝抗体前后的接触角；
图6本发明实施例7中PLLA静电纺纤维支架通过多巴胺接枝CD40抗体为MC3T3-E1细胞在PLLA静电纺纤维支架浸出液（24小时）中分别培养1、3、5天的增殖图；
图7 本发明实施例7中PLLA静电纺纤维支架通过多巴胺接枝CD40抗体后对MC3T3-E1细胞的增殖作用示意图，（a）-（c）为MC3T3细胞在纤维支架生长的SEM图，其中（a）为PLLA-PDA，(b) 为PLLA-PDA-IgG （c）为PLLA-PDA-CD40mAb。
具体实施方式
实施例1
一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：（1）静电纺纤维支架的制备：将PCL分别溶解于二氯甲烷和N’N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，其中PCL：二氯甲烷：N’N-二甲基甲酰胺的质量比为0.2:1.5:10，溶解完全后通过静电纺丝装置进行静电纺丝，制备PCL静电纺纤维支架；（2）静电纺纤维支架的等离子体表面改性：将PCL静电纺纤维支架进行等离子体处理，将等离子处理仪内室压升至10-3Torr，以0.2Torr注入氧气以及气态丙烯酸，并且施加射频功率60W以及负极脉冲电压维持30s，得到羧基官能团化的PCL静电纺纤维支架；（3）抗体的接枝：将表面的改性的PCL静电纺纤维支架洗净阴干，再将PCL静电纺纤维支架浸泡在1ug/50ulCD28抗体溶液中，在PCL静电纺纤维支架上接枝抗体，在4℃下反应12h，反应后取出清洗即可。
实施例2
一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：（1）静电纺纤维支架的制备：将PCL分别溶解于二氯甲烷和N’N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，其中PCL：二氯甲烷：N’N-二甲基甲酰胺的质量比为5:15:1，溶解完全后通过静电纺丝装置进行静电纺丝，制备PCL静电纺纤维支架；（2）静电纺纤维支架的等离子体表面改性：将PCL静电纺纤维支架进行等离子体处理，将等离子处理仪内室压升至10-3Torr，以0.3Torr注入氧气以及气态丙烯酸，并且施加射频功率50W以及负极脉冲电压维持40s，得到羧基官能团化的PCL静电纺纤维支架；（3）抗体的接枝：将表面的改性的PCL静电纺纤维支架洗净阴干，再将PCL静电纺纤维支架浸泡在20ug/50ulCD80抗体溶液中，在PCL静电纺纤维支架上接枝抗体，在4℃下反应24h，反应后取出清洗即可。
实施例3
一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：（1）静电纺纤维支架的制备：将PLGA分别溶解于二氯甲烷和N’N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，其中PLGA：二氯甲烷：N’N-二甲基甲酰胺的质量比为0.5:3:4，溶解完全后加入硅烷偶联剂KH550，其中加入硅烷偶联剂的质量为PLGA的5wt%，继续搅拌均匀，通过静电纺丝装置进行静电纺丝，制备PLGA静电纺纤维支架；（2）静电纺纤维支架的偶联剂表面改性：将PLGA静电纺纤维支架浸泡于己二胺/正丙醇混合溶液中25℃振荡10分钟后，其中乙二胺和正丙醇的质量比为0.2:10，用乙醇和去离子水反复清洗并真空干燥，得到氨基官能团化的PLGA静电纺纤维支架；（3）抗体的接枝：将PLGA静电纺纤维支架浸泡在20ug/50ulCD80抗体溶液中，在PLGA静电纺纤维支架上接枝抗体，在4℃下反应24h，反应后取出清洗即可。
实施例4
一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：（1）静电纺纤维支架的制备：将PLGA分别溶解于二氯甲烷和N’N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，其中纺丝原料：二氯甲烷：N’N-二甲基甲酰胺的质量比为5:12:1，溶解完全后加入硅烷偶联剂KH550，其中加入硅烷偶联剂的质量为PLGA的15wt%，继续搅拌均匀，通过静电纺丝装置进行静电纺丝，制备PLGA静电纺纤维支架；（2）PLGA静电纺纤维支架的偶联剂表面改性：将PLGA静电纺纤维支架浸泡于己二胺/正丙醇混合溶液中25℃振荡10分钟后，其中乙二胺和正丙醇的质量比为1:10，用乙醇和去离子水反复清洗并真空干燥，得到氨基官能团化的PLGA静电纺纤维支架；（3）抗体的接枝：将PLGA静电纺纤维支架浸泡在1ug/50ulCD40抗体溶液中，在PLGA静电纺纤维支架上接枝抗体，在4℃下反应12h，反应后取出清洗即可。
实施例5
一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：（1）静电纺纤维支架的制备：将PLLA分别溶解于二氯甲烷和N’N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，其中PLLA：二氯甲烷：N’N-二甲基甲酰胺的质量比为5:15:3，溶解完全后通过静电纺丝装置进行静电纺丝，制备PLLA静电纺纤维支架；（2）静电纺纤维支架的等离子体表面改性：将多巴胺盐酸盐加入10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，使得多巴胺盐酸盐的缓冲溶液的浓度为2mg/mL，保持溶液的pH在8.5，然后每5份的多巴胺盐酸盐缓冲溶液中加入1份的无水乙醇，搅拌均匀得到混合溶液，将PLLA静电纺纤维支架放入混合溶液中，室温下密闭反应36h；（3）抗体的接枝：将表面的改性的PLLA静电纺纤维支架洗净阴干，再将PLLA静电纺纤维支架浸泡在5ug/50ulCD28抗体溶液中，在PLLA静电纺纤维支架上接枝抗体，在4℃下反应20h，反应后取出清洗即可。
实施例6
一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：（1）静电纺纤维支架的制备：将PLLA分别溶解于二氯甲烷和N’N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，其中PLLA：二氯甲烷：N’N-二甲基甲酰胺的质量比为0.2:6:3，溶解完全后通过静电纺丝装置进行静电纺丝，制备PLLA静电纺纤维支架；（2）静电纺纤维支架的等离子体表面改性：将多巴胺盐酸盐加入10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，使得多巴胺盐酸盐的缓冲溶液的浓度为2mg/mL，保持溶液的pH在8.5，然后每5份的多巴胺盐酸盐缓冲溶液中加入1份的无水乙醇，搅拌均匀得到混合溶液，将PLLA静电纺纤维支架放入混合溶液中，室温下密闭反应12h；（3）抗体的接枝：将表面的改性的PLLA静电纺纤维支架洗净阴干，再将PLLA静电纺纤维支架浸泡在1ug/50ulCD80抗体溶液中，在PLLA静电纺纤维支架上接枝抗体，在4℃下反应12h，反应后取出清洗即可。
实施例7
一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：（1）静电纺纤维支架的制备：将PLLA分别溶解于二氯甲烷和N’N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，其中PLLA：二氯甲烷：N’N-二甲基甲酰胺的质量比为1：8：4，溶解完全后通过静电纺丝装置进行静电纺丝，制备PLLA静电纺纤维支架；（2）静电纺纤维支架的等离子体表面改性：将多巴胺盐酸盐加入10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，使得多巴胺盐酸盐的缓冲溶液的浓度为2mg/mL，保持溶液的pH在8.5，然后每5份的多巴胺盐酸盐缓冲溶液中加入1份的无水乙醇，搅拌均匀得到混合溶液，将PLLA静电纺纤维支架放入混合溶液中，室温下密闭反应24h；（3）抗体的接枝：将表面的改性的PLLA静电纺纤维支架洗净阴干，再将PLLA静电纺纤维支架浸泡在10ug/50ulCD40抗体溶液中，在PLLA静电纺纤维支架上接枝抗体，在4℃下反应24h，反应后取出清洗即可。
按照实施例7制备的PLLA静电纺纤维支架，将接枝抗体的PLLA静电纺纤维支架对MC3T3-E1细胞进行细胞培养，由图7所示SEM图可以看出MC3T3-E1细胞能够在支架表面进行细胞增殖。
本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨的情况下，还可以作出很多变形，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (6)

1.一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架，其特征在于：由静电纺纤维支架表面通过表面活化改性嫁接接枝抗体制备而成，所述表面活化的方式为采用硅烷偶联剂进行活性；
所述的微纳米组织工程支架的制备方法，包括以下步骤： （1）静电纺丝支架的制备：通过静电纺丝装置进行静电纺丝，制备静电纺纤维支架； （2）静电纺纤维支架采用硅烷偶联剂进行表面活化改性：在纺丝液中加入硅烷偶联剂共混纺丝后，用己二胺/正丙醇溶液处理得到氨基官能团化的静电纺纤维支架； （3）抗体的接枝：将表面的改性的静电纺纤维支架洗净阴干，再将静电纺纤维支架浸泡在抗体溶液中，在静电纺纤维支架上接枝抗体，反应后取出清洗即可。
2.根据权利要求1所述的一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架，其特征在于：所述的静电纺纤维支架通过聚乳酸PLLA、乳酸-羟基乙酸的共聚物PLGA、聚己内酯PCL中的任一种纺丝原料制备而成。
3.根据权利要求1所述的一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架，其特征在于：所述的抗体为具有免疫调节作用的IgG类抗体。
4.根据权利要求3所述的一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架，其特征在于：所述的具有免疫调节作用的IgG类抗体为CD40抗体、CD28抗体、或CD80抗体。
5.根据权利权利要求1所述的一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架，其特征在于，所述的微纳米组织工程支架的制备方法包括以下步骤： （1）静电纺纤维支架的制备：将纺丝原料分别溶解于二氯甲烷和N’N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，其中纺丝原料：二氯甲烷：N’N-二甲基甲酰胺的质量比为0.2-5:1.5-15:1-10，溶解完全后加入硅烷偶联剂KH550，继续搅拌均匀，通过静电纺丝装置进行静电纺丝，制备静电纺纤维支架； （2）静电纺纤维支架采用硅烷偶联剂进行表面活化改性：将静电纺纤维支架浸泡于己二胺/正丙醇混合溶液中25℃振荡10分钟后，其中乙二胺和正丙醇的质量比为0.2-1:10，用乙醇和去离子水反复清洗并真空干燥，得到氨基官能团化的静电纺纤维支架； （3）抗体的接枝：将静电纺纤维支架浸泡在1-20μg/50μl抗体溶液中，在静电纺纤维支架上接枝抗体，在4℃下反应12-24h，反应后取出清洗即可。
6.根据权利要求5所述的一种具有免疫治疗功能的微纳米组织工程支架，其特征在于：所述的步骤（1）中加入的硅烷偶联剂KH550，其质量为PLLA、PLGA或PCL质量的5-15wt%。
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